柳州酸筍中降膽固醇乳酸菌的篩選及鑒定

熊建文，桂揚(yáng)，周小玲，陳正培，吳錦蘭，崔娜，鞏僖

(柳州工學(xué)院 食品與化學(xué)工程系，廣西 柳州 545616)

隨著人民生活水平的普遍提高，膳食營養(yǎng)越來越豐富，人群平均血清總膽固醇(cholesterol，TC)水平顯著升高，由此引發(fā)的心腦血管疾病已成為威脅人類健康的頭號殺手[1]。服用降膽固醇的藥物雖然能有效控制體內(nèi)膽固醇含量，但同時(shí)容易引起肝酶異常、腎功能受損等副作用[2]。作為國際公認(rèn)的食品級益生菌，乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)大量存在于人體和動物體的腸道內(nèi)，具有維持胃腸道微生態(tài)平衡、提高機(jī)體免疫力等重要生理功能[3-4]。同時(shí)，乳酸菌也是發(fā)酵食品中的重要細(xì)菌，在發(fā)酵食品和飲料的生產(chǎn)中具有長期和安全的應(yīng)用和消費(fèi)歷史[5]。有研究表明，一些乳酸菌具有降膽固醇的能力，能產(chǎn)生高活性的膽汁鹽水解酶和膽固醇氧化酶，在降解膽固醇及其同系物上起到了重要作用[6-8]。這為降低血清中膽固醇含量的研究提供了新的方向，而獲得高效降膽固醇的乳酸菌菌株是利用乳酸菌降低膽固醇技術(shù)的關(guān)鍵，已成為近年來的研究熱點(diǎn)[9]。馬長路等[10]從自然發(fā)酵的傳統(tǒng)東北酸菜中篩選出了降解膽固醇的優(yōu)良乳酸菌，并且這類降解膽固醇的乳酸菌在干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryneformes)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)中均有存在。

酸筍(fermented bamboo shoot)是我國南方地區(qū)傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品，也是柳州螺螄粉的重要輔料，因其獨(dú)特的風(fēng)味，深受人們鐘愛。酸筍是利用竹筍中自然附著的乳酸菌發(fā)酵而制成，其中蘊(yùn)藏著豐富的乳酸菌資源[11]。目前有關(guān)酸筍的研究主要集中在其營養(yǎng)成分、風(fēng)味物質(zhì)和制作工藝上[12-14]，而有關(guān)酸筍中功能性乳酸菌的研究仍相對匱乏。本研究以柳州傳統(tǒng)發(fā)酵酸筍為原料，采用MRS-CaCO3培養(yǎng)基對酸筍發(fā)酵液中的乳酸菌進(jìn)行分離，通過硫酸鐵銨顯色法對降膽固醇乳酸菌進(jìn)行篩選，隨后對該優(yōu)良菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，最后探究影響降解膽固醇能力的因素，為開發(fā)降膽固醇功能性乳酸菌產(chǎn)品提供了參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 原料

酸筍自然發(fā)酵液樣品：采集于廣西柳州市。

1.1.2 化學(xué)試劑

牛肉膏、酵母浸粉、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、多聚蛋白胨和瓊脂粉：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉和蔗糖：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碳酸鈣：廣東光華科技股份有限公司；瓊脂糖：Biowest公司；膽固醇：上海麥克林生化科技有限公司；牛膽鹽：上海源葉生物科技有限公司；DNA 提取試劑盒：北京天根生化試劑有限公司；Ⅱ型核酸染料：Pitoop公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

按文獻(xiàn)[15]配制MRS液體培養(yǎng)基；MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)添加質(zhì)量濃度為15 g/L的瓊脂；含碳酸鈣MRS培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中添加3 g/L的碳酸鈣；含膽固醇MRS-CHOL培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中添加0.2%牛膽鹽、100 μg/mL或者200 μg/mL膽固醇。

1.1.4 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F 超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)安泰公司；ZQLY-180S振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；H1650R高速離心機(jī) 湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司；HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司；Master-S15超純水機(jī) 上海和泰儀器有限公司；UV-1800 型紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；Nikon Eclipse E200生物顯微鏡 日本尼康公司；GenoSens 1880凝膠成像分析系統(tǒng) 上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；L9800基因擴(kuò)增儀 北京萊普特科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酸筍中乳酸菌的分離與純化

將采集的酸筍發(fā)酵液樣品梯度稀釋(10-1～10-6)后，利用傾注法接種在MRS-CaCO3固體培養(yǎng)基平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取溶鈣圈明顯的菌落，在MRS多次純化后進(jìn)行甘油保存。

1.2.2 降膽固醇乳酸菌的初篩

取1環(huán)目標(biāo)菌株，接種到MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)10 h，調(diào)整菌液的OD600 nm值為0.6，將其作為種子液，按1%(V/V)的接種量接種于含有100 μg/mL膽固醇的MRS-CHOL液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h。取30 μL發(fā)酵液置于2 mL離心管中，加入1.5 mL無水乙醇，混勻后于10000 r/min離心2 min，取1.0 mL上清液于試管中，加入1.0 mL硫酸鐵銨顯色液，先搖勻混合，待冷卻后于波長560 nm處測定吸光度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算膽固醇含量，并按下列公式計(jì)算膽固醇降解率。

式中：D為菌株的膽固醇降解率，%；C0為原培養(yǎng)基中膽固醇質(zhì)量濃度，μg/mL；C1為測試菌株發(fā)酵后上清液樣品膽固醇質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.2.3 降膽固醇乳酸菌的復(fù)篩

按1%的接種量(V/V)將目標(biāo)菌株接種于含有200 μg/mL膽固醇的MRS-CHOL液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下恒溫靜置培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液中的膽固醇含量，計(jì)算降解率，方法同上。

1.2.4 降膽固醇菌株的初步鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察

將目標(biāo)菌株在MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌株的菌落形態(tài)特征，再對菌株進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體細(xì)胞形態(tài)特征，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.4.2 分子生物學(xué)鑒定

利用16S rDNA測序法對菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，具體方法參考文獻(xiàn)[15]。

1.2.5 不同因素對乳酸菌降解膽固醇能力的影響

碳源的影響：分別按比例使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉等碳源作為200 μg/mL含膽固醇MRS-CHOL液體培養(yǎng)基的碳源，將目標(biāo)菌株的種子液按照1.0%(V/V)接種量接種到上述培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，分別在24 h和48 h后，測定每組發(fā)酵液中膽固醇含量，考察不同碳源對菌株降解膽固醇能力的影響。

氮源的影響：分別按比例使用蛋白胨、胰蛋白胨、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、多聚蛋白胨等氮源作為含200 μg/mL膽固醇MRS-CHOL液體培養(yǎng)基的氮源進(jìn)行上述菌株降解膽固醇試驗(yàn)，培養(yǎng)24 h和48 h后，測定每組發(fā)酵液中膽固醇含量，考察不同氮源對菌株降解膽固醇能力的影響。

接種量的影響：分別取1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的接種量接入到含200 μg/mL膽固醇MRS-CHOL液體培養(yǎng)基中進(jìn)行上述菌株降解膽固醇試驗(yàn)，培養(yǎng)24 h和48 h后，測定每組發(fā)酵液中膽固醇含量，考察不同接種量對菌株降解膽固醇能力的影響。

pH值的影響：將含200 μg/mL膽固醇MRS-CHOL液體培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的條件下進(jìn)行上述菌株降解膽固醇試驗(yàn)，培養(yǎng)24 h和48 h后，測定每組發(fā)酵液中膽固醇含量，考察不同pH值對菌株降解膽固醇能力的影響。

溫度的影響：將培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為 22，27，32，37，42 ℃的條件下進(jìn)行上述菌株降解膽固醇試驗(yàn)，培養(yǎng)24 h和48 h后，測定每組發(fā)酵液中膽固醇含量，考察不同溫度對菌株降解膽固醇能力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸筍中乳酸菌的分離

利用MRS-CaCO3培養(yǎng)基對酸筍發(fā)酵液的乳酸菌進(jìn)行分離，得到48株形態(tài)均一的白色菌株，菌落周圍都出現(xiàn)典型的溶鈣圈，將其純化后進(jìn)行編號，分別為LZ-1-1～LZ-1-24、LZ-2-1～LZ-2-24。

2.2 降膽固醇乳酸菌的初篩和復(fù)篩

在 100 μg/mL膽固醇質(zhì)量濃度下48株菌的膽固醇降解率結(jié)果見表1。初篩結(jié)果顯示，不同的菌株降膽固醇能力不同，其中菌株LZ-1-8、LZ-1-10、LZ-1-14、LZ-2-11、LZ-2-12、LZ-2-14、LZ-2-15、LZ-2-19、LZ-2-20、LZ-2-22的膽固醇降解率均超過60%。

表1 48株菌的膽固醇降解率Table 1 The degradation rates of cholesterol of 48 strains

對這10株菌膽固醇降解率進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果見表2，復(fù)篩結(jié)果表明，這10株菌膽固醇的降解能力大小依次為菌株LZ-2-12>菌株LZ-1-10>菌株LZ-2-14>菌株LZ-2-19>菌株LZ-1-14>菌株LZ-2-22>菌株LZ-2-15>菌株LZ-2-20>菌株LZ-1-8>菌株LZ-2-11，其中菌株LZ-2-12膽固醇降解率最大，平均值為54.27%。因此，對菌株LZ-2-12進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表2 200 μg/mL膽固醇濃度下10株菌的膽固醇降解率Table 2 The degradation rates of cholesterol of 10 strains with cholesterol concentration of 200 μg/mL

2.3 降膽固醇菌株的鑒定結(jié)果

菌株LZ-2-12在MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，菌落形態(tài)為圓形、乳白色、表面光滑、邊緣整齊、中央微凸起(見圖1中A)。在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株呈短桿狀、單個(gè)或成對存在，無芽孢，革蘭氏染色為紫色呈陽性(見圖1中B)。

A B圖1 菌株LZ-2-12的形態(tài)特征 Fig.1 The morphological characteristics of strain LZ-2-12注：A為菌落形態(tài)；B為菌株形態(tài)(革蘭氏染色40x)

以菌株LZ-2-12的基因組DNA為模板，以細(xì)菌鑒定16S rDNA通用引物27F及1492R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相符，符合條件，純化后送測序公司進(jìn)行測序。

圖2 菌株LZ-2-12的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 Fig.2 The electrophoretogram of 16S rDNA PCR amplified products of strain LZ-2-12注：M為DL 2000 DNA Marker；1為菌株LZ-2-12；2為空白對照。

菌株LZ-2-12的16S rDNA序列經(jīng)同源性比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。在GenBank的核苷酸BLAST比對結(jié)果表明，菌株LZ-2-12序列和植物乳桿菌Lactobacillusplantarumstrain 8187 序列同源性高達(dá)99.58%且與其在系統(tǒng)發(fā)育樹同一分支(見圖3)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征將其鑒定為植物乳桿菌Lactobacillusplantarum。

圖3 菌株LZ-2-12的系統(tǒng)進(jìn)化分析 Fig.3 The phylogenetic analysis of strain LZ-2-12

2.4 降膽固醇菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 碳源的優(yōu)化

按照1.2.5的方法，用4種碳源分別作為培養(yǎng)基中唯一碳源培養(yǎng)LZ-2-12，分別在24 h和48 h取樣測定發(fā)酵液中的膽固醇含量，計(jì)算膽固醇降解率，分析它們作為唯一碳源對LZ-2-12降解膽固醇的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同碳源對菌株LZ-2-12降膽固醇能力的影響Fig.4 Effect of different carbon sources oncholesterol-reducing ability of strain LZ-2-12

由圖4可知，不同的碳源作為唯一碳源對膽固醇降解率的大小為葡萄糖>乳糖>蔗糖>可溶性淀粉。通過事后檢驗(yàn)，對碳源進(jìn)行兩兩比較，分析顯著性差異，結(jié)果見表3。

表3 4種碳源間的差異性分析 Table 3 The difference analysis among four carbon sources

續(xù) 表

由表3可知，培養(yǎng)24 h時(shí)，除蔗糖與可溶性淀粉間無顯著性外(P>0.05)，其他均有顯著性差異(P<0.05)。培養(yǎng)48 h時(shí)，除蔗糖與乳糖無顯著差異外(P>0.05)，其他均有顯著性差異(P<0.05)。出現(xiàn)這種差異可能是碳源結(jié)構(gòu)、單糖種類和糖苷鍵種類綜合影響的結(jié)果，葡萄糖作為單糖，可以直接被LZ-2-12利用，促進(jìn)菌的生長，有利于對膽固醇的降解；蔗糖與乳糖均為二糖，不能直接被菌利用，需要被分解為單糖后才能被利用，故其降解膽固醇的效果次之；而蔗糖比乳糖利用慢，可能是糖苷鍵和糖苷差異的原因?？扇苄缘矸蹖儆诙嗵?，也不能被菌直接利用，被分解的效率更低，故其降解膽固醇的效果更差。

2.4.2 氮源的優(yōu)化

按照1.2.5的方法，用4種氮源分別作為培養(yǎng)基中唯一氮源來培養(yǎng)LZ-2-12，分別在24 h和48 h取樣測定其發(fā)酵液中膽固醇的含量，計(jì)算膽固醇降解率，分析它們作為唯一氮源對LZ-2-12降解膽固醇的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同氮源對菌株LZ-2-12降膽固醇能力的影響Fig.5 Effect of different nitrogen sources on cholesterol-reducing ability of strain LZ-2-12

由圖5可知，不同的氮源作為唯一氮源的膽固醇降解率大小為細(xì)菌學(xué)蛋白胨>蛋白胨>胰蛋白胨>多聚蛋白胨。通過事后檢驗(yàn)，對氮源進(jìn)行兩兩比較，分析氮源間的顯著性差異，見表4。

表4 4種氮源間的差異性分析 Table 4 The difference analysis among four nitrogen sources

續(xù) 表

由表4可知，在培養(yǎng)的24 h和48 h后，細(xì)菌學(xué)蛋白胨作為唯一氮源的膽固醇降解率顯著大于其他3種氮源的膽固醇降解率，且均有顯著性差異(P<0.05)，因此細(xì)菌學(xué)蛋白胨是植物乳桿菌LZ-2-12降解膽固醇的最優(yōu)氮源。

2.4.3 接種量的優(yōu)化

將植物乳桿菌LZ-2-12分別以1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%進(jìn)行接種，在培養(yǎng)后的24 h和48 h取樣測定發(fā)酵液中膽固醇的含量，分析接種量對植物乳桿菌LZ-2-12降解膽固醇的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 不同接種量對菌株LZ-2-12降膽固醇能力的影響Fig.6 Effect of different inoculation amount on cholesterol-reducing ability of strain LZ-2-12

由圖6可知，不同時(shí)期膽固醇降解率隨接種量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在接種量為3%時(shí)達(dá)到最高。對它們進(jìn)行兩兩比較，分析接種量間的顯著性，結(jié)果見表5。

表5 接種量間的差異性分析 Table 5 The difference analysis among the inoculation amount

續(xù) 表

由表5可知，培養(yǎng)24 h時(shí)，1%和2%接種量間的膽固醇降解率無顯著差異(P>0.05)，3%、4%和5%接種量間的膽固醇降解率兩兩無顯著性差異(P>0.05)，3%、4%和5%接種量的降解率顯著高于1%和2%接種量(P<0.05)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是，植物乳桿菌LZ-2-12對膽固醇的降解與活菌數(shù)呈正比關(guān)系，在培養(yǎng)24 h時(shí)，1%與2%的接種量較低，生物量也低，因此降膽固醇降解率低；接種量超過3%時(shí)，接種量越大，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗越快，細(xì)菌活細(xì)胞數(shù)越低，導(dǎo)致膽固醇的降解率越低。培養(yǎng)48 h時(shí),接種量為2%、3%和4%的膽固醇降解率顯著高于1%和5%(P<0.05)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，接種量間的膽固醇降解率差異逐漸縮小，但總體呈現(xiàn)接種量為3%時(shí)的膽固醇降解率為最佳。

2.4.4 pH的優(yōu)化

將植物乳桿菌LZ-2-12分別在pH 3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0下培養(yǎng)，在培養(yǎng)后的24 h和48 h取樣測定發(fā)酵液中膽固醇的含量，分析接種量對植物乳桿菌LZ-2-12降解膽固醇的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 不同pH值對菌株LZ-2-12降膽固醇能力的影響Fig.7 Effect of different pH values on cholesterol-reducing ability of strain LZ-2-12

由圖7可知，當(dāng)pH值在3.0～7.0之間時(shí)，菌株LZ-2-12的膽固醇降解率隨著pH的增加而增大；當(dāng)pH值為7.0時(shí)，菌株LZ-2-12的降膽固醇能力達(dá)到最高，pH值大于7.0時(shí)，菌株LZ-2-12的膽固醇降解率隨pH值的增加而減小。兩兩比較pH間的差異顯著性，結(jié)果見表6。

表6 pH值間的差異性分析 Table 6 The difference analysis among the pH values

由表6可知，培養(yǎng)24 h時(shí)，pH 5.0，6.0，7.0間的膽固醇降解率無顯著性差異(P>0.05)，培養(yǎng)48 h時(shí)，pH 7.0的膽固醇降解率顯著高于pH 6.0和pH 7.0(P<0.05)。因此,中性環(huán)境有利于菌株LZ-2-12對膽固醇的降解，植物乳桿菌LZ-2-12代謝產(chǎn)生的酸環(huán)境不利于其對膽固醇的降解。

2.4.5 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

將植物乳桿菌LZ-2-12分別在不同溫度下培養(yǎng)，在培養(yǎng)后的24 h和48 h取樣測定發(fā)酵液中膽固醇的含量，分析溫度對植物乳桿菌LZ-2-12對降膽固醇的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 不同溫度對菌株LZ-2-12降膽固醇能力的影響Fig.8 Effect of different temperatures on cholesterol-reducing ability of strain LZ-2-12

由圖8可知，當(dāng)溫度在22～37 ℃之間時(shí)，菌株LZ-2-12的降解率隨著溫度的升高而增大；當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)，菌株LZ-2-12的降膽固醇能力最佳，在24 h和48 h的膽固醇降解率分別為30.17%和39.97%；當(dāng)溫度大于37 ℃時(shí)，菌株LZ-2-12的膽固醇降解率隨著溫度的升高而減小。兩兩比較不同溫度對膽固醇降解率的影響，結(jié)果見表7。

表7 溫度間的差異性分析 Table 7 The difference analysis among the temperatures

由表7可知，溫度為37 ℃時(shí)膽固醇降解率顯著高于32 ℃和42 ℃(P<0.05)，因此菌株LZ-2-12降解膽固醇的最佳溫度為37 ℃。

3 結(jié)論

本研究從柳州自然發(fā)酵酸筍中分離純化獲得一株降膽固醇能力較好的菌株LZ-2-12，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定其為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。該菌株在MRS培養(yǎng)基中生長良好，采用MRS培養(yǎng)基的其他組分及其濃度，以葡萄糖為唯一碳源(添加量為20 g/L)、細(xì)菌學(xué)蛋白胨為唯一氮源(添加量為10 g/L)、接種量為3%、pH值為7.0、溫度為37 ℃的條件下，最適合植物乳桿菌LZ-2-12對膽固醇的降解。該菌株源于廣西發(fā)酵酸筍，將其用于酸筍發(fā)酵具有安全性高的顯著特點(diǎn)，此外，該菌株在37 ℃和中性環(huán)境下降膽固醇效果較好，有在人體腸道定殖的良好基礎(chǔ)，該菌株的獲得在開發(fā)降膽固醇的功能性酸筍以及其他食品方面有良好的應(yīng)用價(jià)值。