干酪乳桿菌發(fā)酵制備酸奶味香精基料的研究

任文彬，李玉坤，汪薇，白衛(wèi)東

(仲愷農(nóng)業(yè)學(xué)院 食品輕工業(yè)學(xué)院，廣州 510225)

奶味香精，也可以稱作乳香香味劑或乳香香精，是食品工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的食品香精之一[1]，主要應(yīng)用于乳制品、糖果、冷食、飲料、烘焙食品等的增香。香基也稱基香劑或主香劑，因其不直接用于加香產(chǎn)品中，只作為香精的香氣主要組分，所以是配制香精的基礎(chǔ)，故稱它為香精的半成品[2]。

奶味香精的乳風(fēng)味主要來源于乳脂肪的分解。其次，蛋白質(zhì)和乳糖通過化學(xué)反應(yīng)、酶水解和微生物發(fā)酵作用產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)也是奶味香精乳風(fēng)味的重要來源[3]。制備奶味香精的方法主要有化學(xué)法和生物法。化學(xué)法主要是根據(jù)已確認(rèn)的香味物質(zhì),采用化學(xué)合成的方法制備單體香原料。

生物法制備奶味香精采用成本較低的奶作為原料，原料的利用率將近100%，整個(gè)生產(chǎn)過程對(duì)環(huán)境不會(huì)造成污染。生物法制備奶味香精又包括酶法和微生物發(fā)酵法[4-9]。

本研究利用干酪乳桿菌，對(duì)黃油在不同發(fā)酵體系中進(jìn)行發(fā)酵，催化生成酸奶味香精基料，探討工藝過程及合適的工藝條件，篩選出酸奶香味最好的酸奶味香精基料，為天然奶味香精的微生物法工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

酪乳桿菌凍干粉：廣東省微生物研究所；無鹽黃油：上海樂廚食品有限公司；乳清粉：河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；脫脂奶粉：內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；乳糖：上海源葉生物科技有限公司。

石油醚、異丙醇、氫氧化鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞指示劑等均為市售分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZQZY-75CS振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；DSX-280手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

稱取一定量的脫脂奶粉加入蒸餾水配制成濃度為10%的牛奶培養(yǎng)基，在高壓滅菌鍋中用115 ℃滅菌15 min，冷卻至40 ℃左右，在無菌條件下，接種干酪乳桿菌的凍干粉，再在37 ℃，150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，經(jīng)2～3次活化使其活力充分恢復(fù)后,放置于冰箱中備用。

1.2.2 發(fā)酵方法

稱取一定重量的黃油添加一定配比的輔底物，再加入適量的蒸餾水于85 ℃水浴滅菌15 min，冷卻至室溫，在無菌條件下接入適量活化好的干酪乳桿菌，于37 ℃，150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后在85 ℃下恒溫滅菌15 min，得到成品。

1.2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取黃油與乳清粉比例、底物濃度、菌種接種量、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素設(shè)計(jì)成4因素3水平進(jìn)行試驗(yàn)，選用 L9(34)正交表。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.4 感官評(píng)價(jià)

隨機(jī)選取感官評(píng)價(jià)小組成員中5人，組成本試驗(yàn)香精基料感官評(píng)價(jià)小組，對(duì)發(fā)酵所得的香精基料從奶香味強(qiáng)度、酸味強(qiáng)度、香氣協(xié)調(diào)度和留香時(shí)間4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分結(jié)果為四者之和，總分為10分。香精基料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 酸奶味香精基料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表Table 2 The sensory evaluation standard table for yogurt-flavor essence basic material

1.2.5 酸價(jià)的測(cè)定

根據(jù)國標(biāo)GB 5009.229-2016《食品中酸價(jià)的測(cè)定》[10]中冷溶劑指示劑滴定法測(cè)定。

1.2.6 酥性餅干的制作1.2.6.1 工藝流程

原材料預(yù)處理→調(diào)制面團(tuán)→輥軋→成型→烘烤→ 冷卻→成品→感官評(píng)價(jià)。

1.2.6.2 餅干的制作

按照一定的比例稱取配料(低筋小麥粉100 g、油33 g、糖33 g、鹽0.5 g、水20 g、小蘇打0.32 g、香基1 g)，先將糖和鹽溶解在水中，然后加入油和香基，攪拌均勻，最后將小麥粉和小蘇打一起篩入，和成光滑的面團(tuán)。將面團(tuán)分成15 g左右一個(gè)的小面團(tuán)，搓圓、壓扁，擺在烤盤上。170 ℃預(yù)熱5 min，放入餅干烘烤20 min左右，取出冷卻，得到成品。同時(shí)做一批不添加香基的空白試樣。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輔底物對(duì)制備酸奶味香精基料的影響

以20%的黃油為底物，在此基礎(chǔ)上添加不同的輔底物(乳清粉、奶粉、乳糖)，黃油與輔底物的質(zhì)量比為2∶1，空白樣品僅以黃油為底物，再加入適量的蒸餾水于85 ℃水浴滅菌15 min，冷卻至室溫，在無菌條件下接入活化好的干酪乳桿菌，接種量為15%，于37 ℃、150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后在85 ℃下恒溫滅菌15 min，制成香精基料。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行感官評(píng)分，結(jié)果見圖1。

圖1 不同輔底物對(duì)制備酸奶味香精基料的影響Fig.1 Effect of different auxiliary substrates on yogurt-flavor essence basic material

由圖1可知，添加乳清粉所制得的香精基料感官評(píng)分值是最高的，此時(shí)酸奶風(fēng)味較濃郁、宜人，略帶甜香味，留香時(shí)間較長(zhǎng)；以奶粉作為輔底物時(shí)，有明顯的奶香味，但是酸味較淡，留香時(shí)間不長(zhǎng)；而以乳糖為輔底物時(shí)，奶味淡而且略帶有異味；空白樣品則只具有極淡的奶香味。此外，添加乳清粉的樣品與空白樣品對(duì)比，添加乳清粉后得到的產(chǎn)物口感變得更加細(xì)膩、香滑，更加適口。因此，選擇以乳清粉為輔底物進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 黃油與乳清粉比例對(duì)制備酸奶味香精基料的影響

以20%的黃油為底物，添加不同比例的乳清粉作為輔底物，比例分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1，再加入適量的蒸餾水于85 ℃水浴滅菌15 min，冷卻至室溫，在無菌條件下接入活化好的干酪乳桿菌，接種量為15%，于37 ℃，150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后在85 ℃下恒溫滅菌15 min，制成香精基料。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行感官評(píng)分以及酸價(jià)的測(cè)定，結(jié)果見圖2。

圖2 黃油與乳清粉比例對(duì)制備酸奶味香精基料的影響Fig.2 Effect of ratio of butter to whey powder on yogurt-flavor essence basic material

黃油中的主要成分是脂肪，此外，還含有酸類、內(nèi)酯類、酮類、醛類等揮發(fā)性物質(zhì)，形成黃油的獨(dú)特香氣和香味[11]。而乳清粉中的成分主要含有乳糖以及少量的乳清蛋白。脂肪和揮發(fā)性成分中的酯類和內(nèi)酯類物質(zhì)可被干酪乳桿菌分解生成少量的中短脂肪酸，乳糖可被轉(zhuǎn)化為葡萄糖、半乳糖甚至是乳酸，乳清蛋白也可被水解成肽或氨基酸等物質(zhì)，從而豐富產(chǎn)物的香味成分，同時(shí)改善口感[12]。由圖2可知，隨著黃油與乳清粉質(zhì)量比的增加，香精基料的酸價(jià)變化平緩，通過數(shù)據(jù)分析，黃油與乳清粉的質(zhì)量比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1制備的香精基料所測(cè)得的酸價(jià)兩兩之間并沒有顯著性差異(p>0.05)?？赡艿脑蚴屈S油與乳清粉的混合物經(jīng)干酪乳桿菌分解后，所得到的游離脂肪酸總含量并無太大區(qū)別。

由感官評(píng)分曲線可知，當(dāng)黃油與乳清粉的質(zhì)量比為1∶1時(shí)，香精基料的感官評(píng)分最高，酸奶風(fēng)味濃郁，奶香味濃厚，協(xié)調(diào)性最好，留香時(shí)間最長(zhǎng)；然而隨著黃油與乳清粉的質(zhì)量比增大，感官評(píng)分逐漸降低，增加至5∶1時(shí)，所制得的香精基料感官評(píng)分最低，奶味與酸味的協(xié)調(diào)性差且有刺鼻的氣味產(chǎn)生；質(zhì)量比再繼續(xù)升高至7∶1時(shí)，感官評(píng)分又逐漸升高，此時(shí)由于黃油的量增加，乳清粉的量減少，香精基料的奶香味濃厚但是酸味淡，出現(xiàn)甜奶味，無其他異味。綜合考慮黃油的價(jià)格比較昂貴，因此最適的黃油與乳清粉的比例為1∶1。

2.3 底物濃度對(duì)制備酸奶味香精基料的影響

在6個(gè)50 mL的三角瓶中添加適量的黃油作為底物，使黃油濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%，控制黃油與乳清粉的比例為1∶1，再加入適量的蒸餾水于85 ℃水浴滅菌15 min，冷卻至室溫，在無菌條件下接入活化好的干酪乳桿菌，接種量為15%，于37 ℃、150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后在85 ℃下恒溫滅菌15 min，制成香精基料。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行感官評(píng)分以及酸價(jià)的測(cè)定，結(jié)果見圖3。

圖3 底物濃度對(duì)制備酸奶味香精基料的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on yogurt-flavor essence basic material

由圖3可知，隨著底物濃度的增加，香精基料的酸價(jià)變化平緩，通過數(shù)據(jù)分析，黃油濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%制備的香精基料所測(cè)得的酸價(jià)兩兩之間并沒有顯著性差異(p>0.05)。可能的原因是黃油與乳清粉的混合物經(jīng)干酪乳桿菌分解后，所得到的游離脂肪酸總含量并無太大區(qū)別。

由感官評(píng)分曲線可知，當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?0%時(shí)，隨著底物濃度的不斷遞增，所制得的香精基料感官評(píng)分明顯提高。這可能是因?yàn)殡S著底物濃度的增加，黃油和乳清粉的含量增加，其被干酪乳桿菌分解后所產(chǎn)生的香味物質(zhì)的量也逐漸增加，使酸奶味的濃郁度和純度也隨之提高。然而當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂?0%時(shí)，隨著底物濃度的進(jìn)一步增加，所產(chǎn)生的酸奶味香氣強(qiáng)度并沒有進(jìn)一步提高，帶有干酪的風(fēng)味，掩蓋了酸奶風(fēng)味?？赡苁怯捎诘孜餄舛冗^高對(duì)干酪乳桿菌產(chǎn)生了抑制作用。綜合成本價(jià)格考慮，最佳的底物濃度為20%。

2.4 接種量對(duì)制備酸奶味香精基料的影響

以20%的黃油為底物，黃油與乳清粉比例為1∶1，再加入適量的蒸餾水于85 ℃水浴滅菌15 min，冷卻至室溫，在無菌條件下選擇不同的干酪乳桿菌接種量，其接種量分別為5%、10%、15%、20%、25%，于37 ℃、150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后在85 ℃下恒溫滅菌15 min，制成香精基料。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行感官評(píng)分以及酸價(jià)的測(cè)定，結(jié)果見圖4。

圖4 接種量對(duì)制備酸奶味香精基料的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on yogurt-flavor essence basic material

由圖4可知，隨著干酪乳桿菌接種量的增加，測(cè)定的香精基料的酸價(jià)逐漸提高，當(dāng)接種量為5%和10%時(shí)，所測(cè)得的酸價(jià)沒有顯著性差異(p>0.05)；當(dāng)接種量為15%時(shí)，樣品的酸價(jià)與接種量為10%的樣品酸價(jià)存在顯著性差異(p<0.05)，而當(dāng)接種量大于15%后差異開始減小?？赡艿脑蚴窍嗤|(zhì)量的黃油與乳清粉混合物隨著干酪乳桿菌菌數(shù)的增加被分解得越徹底，得到的游離脂肪酸含量越高，所測(cè)得的酸價(jià)也就越高。

由感官評(píng)分曲線可知，當(dāng)干酪乳桿菌接種量為15%時(shí)，所制得的香精基料的感官評(píng)分最高，此時(shí)，酸奶風(fēng)味濃郁，奶香味濃厚，協(xié)調(diào)性最好，留香時(shí)間最長(zhǎng)；當(dāng)接種量低于15%時(shí)，隨著接種量的增加，感官評(píng)分也隨之提高，這可能是因?yàn)榻臃N量少時(shí)，黃油與乳清粉的混合物被利用分解的少，導(dǎo)致香氣成分的含量少，此時(shí)制備的香精基料保留較多黃油本身的香味，酸味不夠；當(dāng)接種量大于15%時(shí)，隨著接種量的進(jìn)一步增加，香精基料的酸味加重，與奶香味協(xié)調(diào)性差，甚至有異味產(chǎn)生，導(dǎo)致感官評(píng)分降低。綜合考慮，選擇干酪乳桿菌接種量為15%為宜。

2.5 發(fā)酵溫度對(duì)制備酸奶味香精基料的影響

以20%的黃油為底物，黃油與乳清粉的比例為1∶1，再加入適量的蒸餾水于85 ℃水浴滅菌15 min，冷卻至室溫，在無菌條件下接入活化好的干酪乳桿菌，接種量為15%，放置于不同溫度的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，以150 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24 h，其中溫度分別為29，33，37，41，45 ℃，然后在85 ℃下恒溫滅菌15 min，制成香精基料。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行感官評(píng)分和酸價(jià)的測(cè)定，結(jié)果見圖5。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)制備酸奶味香精基料的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on yogurt-flavor essence basic material

由圖5可知，奶味香精基料的酸價(jià)隨著溫度的變化而變化，當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，測(cè)得的酸價(jià)與其他溫度相比均具有顯著性差異(p<0.05)。當(dāng)發(fā)酵溫度小于37 ℃時(shí)，隨著溫度的上升，所測(cè)得的奶味香精基料的酸價(jià)也進(jìn)一步提高；當(dāng)發(fā)酵溫度大于37 ℃時(shí)，隨著溫度的進(jìn)一步上升，酸價(jià)的值反而下降。這可能是因?yàn)楦衫胰闂U菌的最適發(fā)酵溫度為37 ℃，低于或高于這個(gè)溫度，菌的代謝活力都較差，分解出的游離脂肪酸較少，因此酸價(jià)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。

由感官評(píng)分曲線可知，當(dāng)發(fā)酵溫度從27 ℃上升至37 ℃時(shí)，干酪乳桿菌的細(xì)胞代謝活力隨之增強(qiáng)，所制得的酸奶味香精基料的感官評(píng)分明顯提高。當(dāng)溫度從37 ℃繼續(xù)上升時(shí)，由于溫度過高，使得菌種細(xì)胞內(nèi)的酶系和細(xì)胞器等受到一定的破壞，細(xì)胞的代謝功能明顯下降，導(dǎo)致制得的香精基料酸奶風(fēng)味變差，因此感官評(píng)分降低。因此，選擇最適的發(fā)酵溫度為37 ℃。

2.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)制備酸奶味香精基料的影響

以20%的黃油為底物，黃油與乳清粉比例為1∶1，再加入適量的蒸餾水于85 ℃水浴滅菌15 min，冷卻至室溫，在無菌條件下接入活化好的干酪乳桿菌，接種量為15%，于37 ℃、150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間，培養(yǎng)時(shí)間分別為12，16，20，24，28 h，然后在85 ℃下恒溫滅菌15 min，制成香精基料。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行感官評(píng)分以及酸價(jià)的測(cè)定，結(jié)果見圖6。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)制備酸奶味香精基料的影響Fig.6 Effect of fermentation time on yogurt-flavor essence basic material

由圖6可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，所測(cè)得的奶味香精基料的酸價(jià)略微有變化，呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵時(shí)間為12 h和16 h所制備的樣品測(cè)得的酸價(jià)不具有明顯差異(p>0.05)，而當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過20 h之后，樣品測(cè)得的酸價(jià)與16 h時(shí)的均具有顯著性差異(p<0.05)。這可能是因?yàn)樵谄渌嗤瑮l件下，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，黃油與乳清粉的混合物經(jīng)干酪乳桿菌發(fā)酵分解后得到的游離脂肪酸含量隨之增多。

由感官評(píng)分曲線可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，所制得的香精基料的感官評(píng)分隨之逐漸提高，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到28 h時(shí)，感官評(píng)分最高，酸奶風(fēng)味濃郁，奶香味濃厚，協(xié)調(diào)性最好，留香時(shí)間最長(zhǎng)。可能是由于隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，黃油與乳清粉的混合物被干酪乳桿菌發(fā)酵分解得越徹底，產(chǎn)生的香氣成分越多，而且大部分乳糖都被分解成乳酸，使得酸味濃郁，與奶味協(xié)調(diào)性好，沒有產(chǎn)生不良?xì)馕?，因此感官評(píng)分高。綜合各方面因素考慮，最佳的發(fā)酵時(shí)間為28 h。

2.7 正交試驗(yàn)及結(jié)果

2.7.1 正交試驗(yàn)

由表3 可知，最佳的工藝組合為 A3B2C2D2，即當(dāng)?shù)孜餄舛葹?5%，黃油與乳清粉比例為2∶1，菌種接種量為15%，發(fā)酵時(shí)間為28 h時(shí)，該工藝下干酪乳桿菌發(fā)酵制得的酸奶味香精基料風(fēng)味最好。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results oforthogonal test

表4 方差分析表Table 4 The variance analysis

由表4可知，各因素對(duì)酸奶味香精基料的影響大小順序?yàn)锽>C>D>A，說明黃油與乳清粉的比例對(duì)該試驗(yàn)的影響最大，其次依次為菌種接種量、發(fā)酵時(shí)間，底物濃度對(duì)試驗(yàn)的影響最小。

2.7.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

由于通過正交試驗(yàn)得出的最佳工藝條件不在正交設(shè)計(jì)的9個(gè)試驗(yàn)中，因此還需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。以正交試驗(yàn)最佳工藝組合 A3B2C2D2進(jìn)行試驗(yàn)和感官評(píng)價(jià)，其結(jié)果為8.5。

2.8 以酥性餅干為例的香精基料應(yīng)用試驗(yàn)

對(duì)烘焙出來的餅干從外觀、色澤、風(fēng)味和留香等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果見表5。

表5 烘焙餅干感官評(píng)價(jià)Table 5 The sensory evaluation for baked biscuit

3 結(jié)果與討論

本試驗(yàn)通過以黃油為主要底物，搭配輔底物在不同條件下利用干酪乳桿菌對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵分解，生成天然酸奶味香精基料，最佳工藝條件：黃油與乳清粉的比例為2∶1，黃油濃度為25%，干酪乳桿菌的接種量為15%，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時(shí)間為28 h。通過烘焙試驗(yàn)驗(yàn)證本產(chǎn)品能賦予餅干明顯的酸奶味，持香較久。

通過食品級(jí)原料制備的天然奶味香精基料，不僅具有更好的香味和口感，賦予產(chǎn)品更加豐富的香氣，而且賦予奶味香精產(chǎn)品豐富的營養(yǎng)成分，對(duì)消費(fèi)者來說不僅安全，更有利于健康。