天然食品防腐劑的抑菌機理研究進展

朱燕莉，王正莉，王衛(wèi)，吉莉莉，張佳敏，白婷，趙志平，侯薄，陳林

(成都大學肉類加工四川省重點實驗室，成都 610106)

世界范圍內(nèi)，有大約40%的食品腐敗變質(zhì)都是由微生物引起的，其中細菌和霉菌是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)、品質(zhì)下降的主要原因。為防止或延緩食品品質(zhì)下降，除了傳統(tǒng)的罐藏、冷凍、鹽漬等保藏方法以外，使用食品防腐劑也是延長食品保質(zhì)期非常普遍的方式。但越來越多的研究表明，有些化學添加劑具有致畸性、誘癌性等潛在的危害。考慮到化學合成防腐劑在使用過程中的安全局限性，天然抗菌物質(zhì)因其安全、高效、廣譜等特性逐漸成為研究熱點，被廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。本文主要介紹了存在于植物、動物和微生物中的天然物質(zhì)抗菌成分的抑菌機理以及目前國內(nèi)外的研究進展。

1 抗菌物質(zhì)的研究現(xiàn)狀

1.1 化學合成防腐劑

食品在加工和貯藏過程中的腐敗變質(zhì)現(xiàn)象是食品行業(yè)面臨的主要問題之一，目前普遍使用的抗菌物質(zhì)是化學合成防腐劑，如山梨酸鹽、亞硝酸鹽和苯甲酸鹽等，大多數(shù)化學防腐劑對人體有潛在的危害。Mamur等[1]研究發(fā)現(xiàn)，山梨酸鈉對人體外周血淋巴細胞(PBL)有一定的基因毒性，并且山梨酸鹽容易與蛋白質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生絡(luò)合物，對人體也有潛在的毒害作用。多種防腐劑不宜共同使用，有報道稱，在肉制品中，山梨酸鹽和亞硝酸鹽的共同使用存在形成誘變化合物的風險，不利于人體健康，在生產(chǎn)和加工中應(yīng)該盡量減少使用[2]。

1.2 具有抗菌性的天然物質(zhì)

隨著居民飲食安全意識的不斷提高，具有抗菌成分的天然物質(zhì)受到社會各界的廣泛關(guān)注，逐漸成為食品行業(yè)研究開發(fā)和廣泛應(yīng)用的熱點。天然抗菌物質(zhì)具有抗菌性強、熱穩(wěn)定性好和安全高效等優(yōu)點，其主要來源于植物、動物和微生物，常見的有肉桂酸、溶菌酶、殼聚糖和乳酸鏈球菌素(Nisin)等，其中肉桂酸是酚類物質(zhì)，酚類物質(zhì)一般具有抗菌、抗氧化、抗褐變、防止酸敗等作用，應(yīng)用更加廣泛，而非酚類物質(zhì)，如大豆球蛋白堿性抗菌肽、糖醇類脂肪酸酯和蒜素等，主要表現(xiàn)出抗菌性。安全穩(wěn)定的天然防腐劑可大大提高食品的品質(zhì)，更好地維護人體健康。目前天然抗菌物質(zhì)商業(yè)化應(yīng)用的局限性在于機制和原理的探究較少，提取、分離和純化等步驟繁雜，技術(shù)要求較高，且源于植物的天然物質(zhì)有明顯的季節(jié)性，在提取工藝中也需要加以考慮和調(diào)整。因此，探究抑菌機理是天然抗菌物質(zhì)提取工藝優(yōu)化和廣泛應(yīng)用的重要基礎(chǔ)。

2 不同來源的天然物質(zhì)抑菌機理

2.1 植物提取物

很多來源于植物的成分可作為天然抑菌物質(zhì)使用，如肉桂、丁香、迷迭香、辣椒等物質(zhì)的提取物，它們都具有很強的殺菌作用，可加工為天然防腐劑在食品中使用，有些也被制作為植物精油。

2.1.1 肉桂酸和肉桂醛

桂枝提取物可有效抑制菌體孢子的萌發(fā)，使細胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，膜的通透性增加，胞內(nèi)電解質(zhì)外泄，細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和菌體的物質(zhì)代謝被影響、擾亂，導(dǎo)致菌絲無法正常發(fā)育繁殖，甚至致死。

肉桂酸的主要抑菌機理是抑制菌體的孢子萌發(fā)，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，擾亂其物質(zhì)代謝，并影響三羧酸循環(huán)(TCA)的過程，使菌體的能量代謝途徑受到不同程度的阻礙，從而達到抑菌殺菌的效果。王秋亞等[3]研究發(fā)現(xiàn)，肉桂酸能夠破壞菌體表面的磷脂雙分子層，使得細胞膜的通透性增強，導(dǎo)致胞內(nèi)滲出大量的電解質(zhì)，增加胞內(nèi)液體的電導(dǎo)率，蛋白質(zhì)及其糖類隨之減少，菌體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性從而遭到破壞，其物質(zhì)代謝過程被擾亂，致使菌絲無法正常生長發(fā)育。遭到破壞的菌絲往往呈畸形，表面常有皺縮、膨大的現(xiàn)象出現(xiàn)，菌絲扭結(jié)纏繞在一起或者斷裂。謝麗玲等[4]研究表明，肉桂酸對菌體的呼吸代謝作用也可產(chǎn)生較大影響，對于能量代謝相關(guān)酶如琥珀酸脫氫酶(SDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)有較好的抑制效果，使氧化磷酸化過程以及電子能量傳遞等代謝途徑受阻，從而影響、阻礙菌體生長，最后致使菌體死亡。在實際應(yīng)用中將肉桂酸與巴氏殺菌助劑復(fù)配，能夠顯著增強殺菌防腐效果。

肉桂醛(C9H8O)是一種醛類有機化合物，大量分布于肉桂等植物體內(nèi)。由于其分子結(jié)構(gòu)為一個丙烯醛與一個苯基相連，因此被認為是丙烯醛的一種衍生物，自然界中存在的肉桂醛均為反式結(jié)構(gòu)。

Shreaz等[5]研究表明，肉桂醛的抑菌機制不僅僅是單方面起作用，而是通過很多方面影響微生物的正常發(fā)育和代謝，并且不同濃度的肉桂醛對細菌細胞的抑制機理有差異，彼此間呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。高濃度的肉桂醛通過對細菌細胞膜脂肪酸的分布產(chǎn)生影響，從而抑制酶活性，改變細胞膜的流動性，滲透作用增強的同時，細胞內(nèi)物質(zhì)外滲，導(dǎo)致菌體死亡；中等濃度的肉桂醛通過影響細胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)蛋白酶，抑制其活性，細胞內(nèi)能量供應(yīng)途徑受阻，生物膜的合成遭到破壞，從而起到抑菌作用；低濃度的肉桂醛與菌體細胞內(nèi)的物質(zhì)相結(jié)合，如蛋白質(zhì)、激素等因子，影響細胞的正常分裂，抑制菌體細胞的生長繁殖，從而達到抗菌的效果。

He等[6]研究發(fā)現(xiàn)，肉桂醛能夠深入滲透到菌體細胞的內(nèi)部，與細胞內(nèi)DNA發(fā)生作用，阻礙DNA的正常合成。此外，還有一些研究表明，肉桂醛能夠改變細菌內(nèi)部的離子(Ca2+、K+和H+等)平衡，從而使細菌細胞死亡。

2.1.2 大豆球蛋白堿性抗菌肽(GAP)

抗菌肽原指昆蟲體內(nèi)經(jīng)過誘導(dǎo)而產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)。自然界中的抗菌肽可分為植物抗菌肽、細菌抗菌肽和昆蟲抗菌肽等若干種，幾乎存在于所有生命體中。馮林慧等[7]在天然防腐劑的研究中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)抗菌肽來源于食物本身，例如GAP就是從豆粕中提取出來的一種植物來源的陽離子肽，它具有廣譜抑菌的特性，且不會對人體健康產(chǎn)生危害和毒副作用。關(guān)于抗菌肽的殺菌抑菌機理，現(xiàn)在普遍的觀點是膜損傷機理和膜內(nèi)物質(zhì)損傷機理。

膜損傷機理認為，抗菌肽通常作用于菌體細胞膜。Dean等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽具有陽離子特性和兩親性，當抗菌肽接觸細胞膜時，彼此識別聚集到一起，在靜電作用的吸引下，抗菌肽與帶負電的磷脂細胞膜相結(jié)合，疏水基團進入細胞膜深處的疏水層，疏水端暴露，細胞膜的通透性發(fā)生改變，其結(jié)構(gòu)和完整性也遭到破壞，胞內(nèi)物質(zhì)泄露，膜電位隨之降低，細胞的能量代謝過程被影響，生存能力受到威脅，嚴重時導(dǎo)致細胞死亡。

關(guān)于膜內(nèi)物質(zhì)損傷機理的研究和報道很少。抗菌肽不僅可以破壞細胞膜，還可以損害細胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，進而影響菌體細胞的代謝等正常生理活動。研究發(fā)現(xiàn)，有些抗菌肽能與大腸桿菌的DNA結(jié)合，改變其結(jié)構(gòu)，從而影響菌體細胞的正常生理功能，但是大腸桿菌的細胞膜不會遭到明顯的破壞。

大豆球蛋白堿性抗菌肽(GAP)是陽離子型抗微生物肽，GAP通過改變細菌細胞膜的通透性，使細胞內(nèi)鈣、鉀離子泄露至細胞外，引起細胞局部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變形成細槽，從而導(dǎo)致細胞的塌陷。研究表明，GAP可明顯抑制大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和單增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)等。

GAP能夠破壞單增李斯特氏菌的細胞形態(tài)，影響其生理代謝。首先，Vidal等[9]在研究中發(fā)現(xiàn)，GAP通過自身所帶的正電荷中和單增李斯特氏菌表面所帶的負電荷，引起電勢差的減小，菌體細胞膜出現(xiàn)去極化現(xiàn)象，從而使細胞膜的完整性遭到破壞。其次，GAP對單增李斯特氏菌細胞膜的作用使其通透性發(fā)生改變，進一步導(dǎo)致細胞內(nèi)物質(zhì)的泄露，致使DNA遭到破壞，隨之降解。此外，GAP可以抑制單增李斯特氏菌呼吸鏈脫氫酶和ATP酶的活性。最后，GAP也可以通過影響菌體細胞呼吸代謝途徑中的EMP途徑，使菌體的呼吸代謝遭到抑制和破壞[10]。

GAP對金黃色葡萄球菌具有較強的抗菌活性。Yang等[11]研究表明，GAP會嚴重破壞金黃色葡萄球菌的細胞膜，導(dǎo)致細菌膜的滲漏和胞內(nèi)物質(zhì)的流出。此外，GAP能夠抑制金黃色葡萄球菌非特異性酯酶和ATP酶的活性，擾亂細菌正常的生長和繁殖。對于金黃色葡萄球菌來說，GAP的抑菌活性取決于其對細胞膜的破壞程度以及胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生劑量。GAP誘導(dǎo)細菌活性氧的產(chǎn)生，而產(chǎn)生的活性氧則會使菌體出現(xiàn)不同程度的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Aruldass等[12]在研究中發(fā)現(xiàn)，低劑量的活性氧可減輕細胞損傷，而高劑量的活性氧則會使一些細胞大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、DNA等變性和降解，細胞的結(jié)構(gòu)和細胞內(nèi)介導(dǎo)的功能遭到破壞，從而導(dǎo)致活性氧介導(dǎo)的細菌細胞凋亡，達到抗菌效果。

2.2 動物提取物

來源于動物的抑菌提取物是指主要從與動物相關(guān)的物質(zhì)中提取得到的具有天然抗菌成分的物質(zhì)，如魚精蛋白、殼聚糖和動物型溶菌酶等。

2.2.1 溶菌酶

溶菌酶(Lysozyme)是一種水解酶類，可專門作用于微生物的細胞壁。它是由18種、129個氨基酸殘基組成的單肽鏈蛋白質(zhì)，可以分解N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)殘基之間的β-1,4糖苷鍵，是許多生物先天免疫系統(tǒng)的重要組成成分。溶菌酶作為一種天然抗菌物質(zhì)，由于可在腸胃內(nèi)被消化吸收，不會危害人體健康，因此被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和飼料等領(lǐng)域。

人們普遍認為，溶菌酶的抑菌機理主要是通過破壞微生物的細胞壁，對細菌骨架物質(zhì)——聚糖的降解反應(yīng)進行催化，從而導(dǎo)致菌體細胞裂解而死亡。

根據(jù)溶菌酶作用對象的不同和菌體細胞壁成分的不同，可將其分為細菌型細胞壁溶菌酶和真菌型細胞壁溶菌酶。對于細菌來說，溶菌酶主要作用于兩個部位：一是肽聚糖的β-1,4糖苷鍵處；二是肽鏈的酰胺部分和“尾”端。Yu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，C型溶菌酶主要存在2個結(jié)構(gòu)域，高度保守的天門冬氨酸52和谷氨酸35殘基組成其催化位點，與肽聚糖底物在裂縫內(nèi)深處結(jié)合，NAM和NAG之間的糖苷鍵遭到破壞，從而導(dǎo)致細菌的裂解死亡。對于真菌來說，溶菌酶的主要作用對象為酵母細胞壁的β-1,3-D-葡聚糖、β-1,6-D-葡聚糖、甘露聚糖和霉菌細胞壁的殼多糖，它對于酵母菌和霉菌有一定的溶解作用。由此，溶菌酶發(fā)揮作用的特異性很強，菌種不同，作用的底物和部位也會有差異。

由于溶菌酶能夠?qū)ｉT作用于菌體細胞壁，而不會影響干擾細胞其他部位，革蘭氏陽性菌的細胞壁約90%都是肽聚糖組成的，因此溶菌酶對革蘭氏陽性菌的抑制效果十分顯著。此外，溶菌酶對于枯草芽孢桿菌有極其顯著的分解作用，對大腸桿菌等革蘭氏陰性菌也有溶解作用。

溶菌酶對微生物細胞壁的破壞并不是它抑菌的唯一機制，研究表明，溶菌酶能夠迅速增加大腸桿菌外膜的滲透性，使外膜形成孔洞結(jié)構(gòu)，對大腸桿菌的內(nèi)膜也具有直接的抑制作用[14]。

2.2.2 殼聚糖

殼聚糖(Chitosan)的分子式為(C6H11NO4)n。其天然儲備量較為豐富，常來源于蟹蝦、昆蟲等動物硬殼。殼聚糖是一種天然堿性多糖物質(zhì)，通過脫乙?；磻?yīng)從甲殼素中提取，因其具有無毒、可降解、抗微生物等優(yōu)良特性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和工業(yè)降解等領(lǐng)域。

國內(nèi)外學者對殼聚糖的抗菌機制做了大量實驗與研究驗證，目前被廣泛認可的機理有以下4種：

第一，殼聚糖的抗菌活性源自其氨基(NH2)所帶的正電荷(NH3+)。Costa等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)，當pH

第二，Obianom等[17]通過研究殼聚糖對不同酶基因的表達，發(fā)現(xiàn)其分子降解的產(chǎn)物可以經(jīng)過多層相互交聯(lián)的細胞壁屏障到達細胞內(nèi)部，干擾細胞內(nèi)DNA，抑制蛋白質(zhì)和mRNA等物質(zhì)的合成，導(dǎo)致基因表達發(fā)生變化，關(guān)鍵酶的活性降低，影響微生物的正常生長和代謝。

第三，Sebti等[18]研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖還具有螯合金屬離子的能力。當pH>pKa(6.3)時，殼聚糖能夠非常好地吸收螯合金屬陽離子，同時作用于帶有陰離子的細胞膜，從而改變細胞膜的滲透性，使菌體表面形態(tài)被破壞，導(dǎo)致細胞內(nèi)物質(zhì)泄漏。

第四，根據(jù)其聚合成膜的特性，殼聚糖還可以形成一層不透氣的涂膜來抑制微生物生長。該膜阻止營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞的同時也阻止了O2的進入，從而起到了抑制好氧型微生物生長繁育的作用。

但是，殼聚糖在中性和堿性條件下的抗菌效果不如酸性環(huán)境條件下的。對此，有學者對殼聚糖的改性進行了研究，如殼聚糖交聯(lián)改性、殼聚糖?；男院蜌ぞ厶酋セ男缘龋型岣咂湟志阅?。

2.3 微生物類抗菌物質(zhì)

微生物類抗菌物質(zhì)是一類具有抑菌活性的物質(zhì)，由微生物生長代謝產(chǎn)生， 主要包括多肽和有機酸等。這些物質(zhì)分子量小，結(jié)構(gòu)緊密，能夠輕易進入到細胞內(nèi)部，可以較好地抑制一些微生物的生長繁殖。

乳酸鏈球菌素(Nisin)是由乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)產(chǎn)生的一類兩親性陽離子多肽。在代謝過程中，通過核糖體的相關(guān)合成機制產(chǎn)生具有殺菌效果的多肽或蛋白，Nisin的化學式為C143H230N42O37S7，由34個氨基酸殘基組成。它對革蘭氏陽性菌和芽孢桿菌的孢子均具有強烈的抑制作用，是目前世界上唯一允許被用作食品添加劑的細菌素。

與傳統(tǒng)抗生素相比，Nisin的抑菌機制十分獨特。章銀良等[19]在防腐劑抑菌性能的研究中發(fā)現(xiàn)，Nisin主要作用于繁殖體的細胞膜，阻礙細胞膜磷脂化合物的合成途徑，使硫氫基團的活性降低甚至失去活性，造成細胞膜功能的損害，從而導(dǎo)致了細胞的裂解，胞內(nèi)物質(zhì)泄露，同時也抑制了細菌細胞壁中肽聚糖的合成。Bauer等[20]研究認為，Nisin對菌體的抑制作用主要是在于脂II(Lipid-II)分子結(jié)合的過程中形成孔洞復(fù)合物，這種Nisin-Lipid-II孔洞復(fù)合物能夠在納摩爾級的濃度下對細胞膜造成損害，例如在膜上穿孔，胞內(nèi)氨基酸、ATP和離子的泄露等，最后導(dǎo)致菌體死亡。脂Ⅱ分子在細菌細胞壁合成的過程中起著非常重要的作用，是一種不可或缺的中間體。因此，Nisin與脂II分子的結(jié)合會嚴重干擾細胞壁的合成，從而起到抑菌的作用。在實踐中，高溫滅菌與Nisin同時搭配使用，能夠大幅度提升此效果。

Nisin對于芽孢的抑制作用主要是在芽孢萌發(fā)的前期破壞它的膜結(jié)構(gòu)，抑制其發(fā)芽，而不是殺死芽孢。但是Nisin對革蘭氏陰性菌的作用不大，對酵母菌和霉菌幾乎沒有任何影響，可能的原因是革蘭氏陰性菌細胞壁中含有的脂多糖在對抗Nisin時發(fā)揮了屏障作用，有效阻擋了Nisin對細胞膜的破壞。在取代化學添加劑的可能性方面，實驗證明，不同質(zhì)量分數(shù)的Nisin、殼聚糖和植物提取物復(fù)配，在川菜中的抑菌效果與添加一定量的山梨酸鉀相當，能夠有效抑制微生物的生長繁殖，甚至作為天然防腐劑代替山梨酸鉀。同時，Nisin也可參與發(fā)酵過程，在白酒發(fā)酵過程中適當加入Nisin，可有效抑制白酒中乳酸菌的生長，在醬油中加入Nisin也能夠抑制一些特定菌種的生長繁殖，使醬油的品質(zhì)得以提升[21]。

3 不同天然物質(zhì)的抑菌效果

不同天然物質(zhì)抗菌成分的抑菌機理可以分為以下幾種：

(1)對菌體細胞壁或者細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，破壞其屏障功能，使胞內(nèi)物質(zhì)泄漏；

(2)作用于細胞內(nèi)部的核酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，影響其表達和合成，使細胞喪失生長的物質(zhì)基礎(chǔ)；

(3)抑制菌體內(nèi)能量相關(guān)酶的活性，使其代謝過程受阻，影響細胞的呼吸作用和正常生長。

以上若干種天然抗菌物質(zhì)中，肉桂酸和肉桂醛對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等有明顯的抑制作用，此外，肉桂酸抑制真菌的效果最好。大豆球蛋白堿性抗菌肽(GAP)對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特氏菌均具有明顯的抑制效果。溶菌酶對革蘭氏陽性菌的作用效果十分顯著，對革蘭氏陰性菌僅有一定的溶解作用，效果較弱，研究發(fā)現(xiàn)，溶菌酶和Nisin對革蘭氏陽性菌具有協(xié)同作用。殼聚糖對細菌、真菌甚至病毒都有較好的抑制效果，但是殼聚糖的水溶性很差，只能少量地溶解于稀酸溶液，抗菌能力較溫和。乳酸鏈球菌素(Nisin)對革蘭氏陽性菌的抑制效果非常顯著，對酵母菌和霉菌幾乎沒有明顯的作用，最近研究表明，Nisin聯(lián)合EDTA一起使用，對沙門氏菌和革蘭氏陰性菌也有較為明顯的抑制作用。

4 結(jié)語

我國天然物質(zhì)資源豐富，目前雖然已經(jīng)開發(fā)出數(shù)十種天然防腐劑，但實際能夠高效投入使用的并不多，在對天然抑菌物質(zhì)的開發(fā)和應(yīng)用方面仍然存在許多問題：

(1)植物型抗菌物質(zhì)有明顯的季節(jié)性和地域性，分離和提取工藝受到諸多限制；

(2)天然抗菌物質(zhì)的作用機理和抗菌譜的研究不夠明了；

(3)缺乏對天然提取物純品的毒理學評價；

(4)研究開發(fā)和投入使用的成本過高。

探究天然抗菌物質(zhì)的抑菌機理，并對其進行改進、復(fù)配或者工藝優(yōu)化，對今后在食品生產(chǎn)加工領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，減少甚至替代使用化學合成防腐劑具有重大意義，對后續(xù)的相關(guān)研究和課題也提供了新的思路和應(yīng)用價值。