張相杰 陳國俊 李涵 李芳柏 劉同旭

摘 要：中性厭氧的富鐵環(huán)境中，微生物驅(qū)動(dòng)硝酸鹽還原亞鐵氧化（NRFO）過程和異化鐵還原過程，然而異化鐵還原菌能否介導(dǎo)NRFO仍未知。選取異化鐵還原菌（Klebsiella pneumoniae L17、Shewanella oneidensis MR-1、Shewanella putrefaciens strain CN32）、亞鐵和硝酸鹽，構(gòu)建厭氧NRFO體系。結(jié)果表明：亞鐵氧化、硝酸鹽還原同步發(fā)生，主要是因?yàn)橄跛猁}還原產(chǎn)物亞硝酸鹽可以直接氧化亞鐵;亞鐵抑制了硝酸鹽還原，且該抑制作用隨亞鐵濃度升高而增強(qiáng);亞鐵對(duì)亞硝酸鹽的競(jìng)爭(zhēng)性還原導(dǎo)致了銨根大量減少;亞鐵氧化生成的次生礦物沉淀在細(xì)胞表面，阻礙硝酸鹽進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行還原。在低濃度亞鐵條件下，亞鐵的毒害和氧化成礦作用抑制L17還原硝酸鹽;亞鐵氧化成礦作用是抑制CN32還原硝酸鹽的主要原因;而亞鐵的毒害是抑制MR-1還原硝酸鹽的主要原因。在高濃度亞鐵條件下，亞鐵氧化導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)殼是抑制微生物硝酸鹽還原的主要原因。

關(guān)鍵詞：硝酸鹽還原亞鐵氧化;鐵還原微生物;亞鐵氧化成礦;細(xì)胞結(jié)殼

Abstract： Microbially-mediated nitrate-reducing Fe（Ⅱ） oxidation （NRFO）process and alienated iron reduction process are ubiquitous under neutral anaerobic iron-rich environments. However， it is still unknown whether NRFO can be mediated by dissimilatory iron reducing bacteria. In this study， anaerobic NRFO system is constructed by selecting dissimilatory iron-reducing bacteria（Klebsiella pneumoniae L17， Shewanella oneidensis MR-1， and Shewanella putrefaciens strain CN32）， ferrous and nitrate. The results show that nitrate reduction and Fe（Ⅱ） oxidation occurred simultaneously. The intermediate product nitrite during nitrate reduction is considered the dominant contributor to the overall Fe（Ⅱ） oxidation. The presence of Fe（Ⅱ） inhibited microbial nitrate reduction， and the inhibitory effect of Fe（Ⅱ） was more significant with the higher Fe（Ⅱ） concentration.Competitive reduction of nitrite by Fe（Ⅱ）resulted in the decrease of ammonium production. Fe（Ⅱ） oxidized secondary minerals precipitated on the cell surface，hindering nitrate from entering the cell for reduction. The toxicity and oxidation-mineralization of Fe（Ⅱ） inhibited nitrate reduction by L17 with low Fe（Ⅱ） concentration. Nitrate reduction by CN32 was inhibited by Fe（Ⅱ） oxidation-mineralization， while the inhibition of nitrate reduction by MR-1 was attributed to toxicity of Fe（Ⅱ）.Under high Fe（Ⅱ） concentration， microbial nitrate reduction was inhibited by cell encrustation.

Keywords： nitrate-reducing Fe（Ⅱ） oxidation; iron-reducing bacteria; Fe（Ⅱ） oxidation-mineralization; cell encrustation

鐵是地殼中第四豐富的元素，也是生物圈中最普遍存在的氧化還原活性金屬[1]。鐵長(zhǎng)期以來被認(rèn)為是生命所必須的，鐵氧化菌（FeOB）與鐵還原菌（FeRB）驅(qū)動(dòng)了鐵的生物地球化學(xué)循環(huán)。鐵循環(huán)過程控制著土壤有機(jī)物礦化、甲烷排放、重金屬的吸附固定、反硝化等環(huán)境過程，是連接土壤養(yǎng)分循環(huán)與污染物轉(zhuǎn)化的紐帶，是推動(dòng)物質(zhì)循環(huán)與能量代謝的重要引擎[2-6]。氮是核苷酸和氨基酸的基本組成元素，是構(gòu)成生命的基本元素，從根本上影響著大多數(shù)生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[7]。硝酸鹽作為氮循環(huán)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，在自然界氮循環(huán)過程中起著至關(guān)重要的作用。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，氮素的輸入至關(guān)重要，而微生物的反硝化作用會(huì)導(dǎo)致氮素的大量流失[8]。微生物通過反硝化過程、異化硝酸鹽還原成銨、厭氧氨氧化競(jìng)爭(zhēng)性還原硝酸鹽[9]。硝酸鹽還原的產(chǎn)物N2O作為重要的溫室氣體，超過60%的排放來自農(nóng)業(yè)土壤，而土壤中超過2/3的N2O排放可歸因于細(xì)菌和真菌生物與非生物反硝化過程共同作用的結(jié)果[10-11]。因此，微生物驅(qū)動(dòng)的硝酸鹽還原過程對(duì)元素地球化學(xué)循環(huán)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、溫室氣體排放等方面具有重要意義。

在厭氧環(huán)境中，微生物通過生物與非生物作用耦合鐵氮循環(huán)普遍存在，是鐵、氮氧化還原反應(yīng)中的重要過程[12]。1996年首次報(bào)道微生物介導(dǎo)的硝酸鹽還原亞鐵氧化過程（NRFO）[13]，在此后的二十多年里，人們證明了NRFO過程在土壤中、海洋、溫泉、地下水、深海、濕地沉積物和海底熱液噴口等環(huán)境中普遍存在[14-19];甚至在火星也可能存在潛在的NRFO過程[20]。在厭氧條件下，NRFO微生物將硝酸鹽作為電子受體，將Fe（Ⅱ）作為唯一或者輔助電子供體進(jìn)行生命代謝活動(dòng)，同時(shí)硝酸鹽還原的中間產(chǎn)物亞硝酸鹽通過化學(xué)反硝化作用氧化Fe（Ⅱ）[12， 21-22]。

由于中性厭氧環(huán)境微生物活動(dòng)的復(fù)雜性、物質(zhì)循環(huán)活動(dòng)的廣泛性以及元素之間的耦合過程，單獨(dú)的微生物種群進(jìn)行完全的反硝化過程不普遍，大量微生物種群只參與一個(gè)或者幾個(gè)NO-X還原反應(yīng)，這些微生物通常缺乏將硝酸鹽還原為氮?dú)獾耐暾緩交蚪M[8， 23]。目前主要是通過NRFO微生物這種模式菌研究硝酸鹽還原亞鐵氧化過程，例如Pseudogulbenkiania sp. strain 2002、Acidovorax sp. strain BoFeN1[21， 24-26]。實(shí)際上，很多微生物具備將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，進(jìn)而非生物氧化Fe（Ⅱ）的能力。因此，反硝化微生物（非模式菌）能夠驅(qū)動(dòng)NRFO過程[27]。大量鐵還原微生物具有參與硝酸鹽還原過程的酶，并能夠進(jìn)行硝酸鹽還原，鐵還原微生物是氮循環(huán)的重要參與者[28]。目前，研究者陸續(xù)從多種環(huán)境中分離出大量鐵還原微生物，如深海沉積物、銅礦、海底熱泉、森林沉積物和油田等環(huán)境，這些微生物能夠利用硝酸鹽作為電子受體進(jìn)行硝酸鹽還原。

[29-33]。目前的研究表明，F(xiàn)e（Ⅲ）和硝酸鹽能夠作為鐵還原微生物的電子受體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性還原，而且硝酸鹽的濃度影響微生物鐵還原速率[34-37]。然而，對(duì)于鐵還原微生物驅(qū)動(dòng)的硝酸鹽還原亞鐵氧化過程需要進(jìn)一步研究。

鐵還原微生物驅(qū)動(dòng)NRFO過程中，亞硝酸鹽和亞鐵發(fā)生化學(xué)反硝化生成N2O排放到大氣中，并造成厭氧環(huán)境中的氮損耗。因此，鐵還原菌驅(qū)動(dòng)的NRFO過程對(duì)于研究微觀尺度溫室氣體排放具有重要的意義[38-41]。以往對(duì)模式菌驅(qū)動(dòng)NRFO過程的研究表明，亞鐵的存在促進(jìn)了Acidovorax sp. BoFeN1硝酸鹽還原，但抑制了Pseudogulbenkiania sp. strain 2002硝酸鹽還原，不同微生物生成的次生礦物類型也存在差別，說明不同的NRFO微生物對(duì)亞鐵的響應(yīng)不同[42]。因此，不同鐵還原微生物驅(qū)動(dòng)的硝酸鹽還原亞鐵氧化過程反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和礦物學(xué)有可能也存在明顯區(qū)別。不同鐵還原微生物硝酸鹽還原過程相關(guān)酶促反應(yīng)不同。研究表明，Shewanella loihica strain PV-4硝酸鹽還原過程中，能夠通過亞硝酸鹽還原酶NirK將亞硝酸鹽還原為N2O，也能夠通過亞硝酸鹽異化還原成銨酶NrfA，將亞硝酸鹽還原為NH+4[43]。Shewanella putrefaciens MR-1硝酸鹽還原過程中，通過硝酸鹽還原酶Nap將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，然后通過亞硝酸鹽異化還原為銨酶NrfA將亞硝酸鹽還原為NH+4[44-45]。說明不同希瓦氏菌，其硝酸鹽代謝酶促反應(yīng)途徑不同，有可能導(dǎo)致硝酸鹽還原亞鐵氧化動(dòng)力學(xué)和礦物學(xué)的區(qū)別。

筆者選取發(fā)酵型和呼吸型兩種鐵還原菌作為模式菌株，研究其驅(qū)動(dòng)NRFO過程。設(shè)置不同鐵還原微生物驅(qū)動(dòng)NRFO過程的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，對(duì)反應(yīng)物和生成物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析，對(duì)不同處理組的次生礦物進(jìn)行對(duì)比，研究目的包括：探究不同類型鐵還原菌、硝酸鹽還原菌的NRFO過程動(dòng)力學(xué)和礦物學(xué)差異，揭示鐵還原菌驅(qū)動(dòng)的NRFO過程的反應(yīng)機(jī)制和影響因素。該研究可拓展NRFO過程的微生物范疇，揭示厭氧環(huán)境微生物驅(qū)動(dòng)的NRFO過程中的微生物功能與貢獻(xiàn)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)采用的微生物為發(fā)酵型兼性厭氧鐵還原菌Klebsiella pneumoniae L17[46]、呼吸型兼性厭氧鐵還原菌Shewanella oneidensis MR-1[47]，來自海洋微生物菌種保藏管理中心（Marine Culture Collection of China， MCCC）;呼吸型兼性厭氧鐵還原菌Shewanella putrefaciens strain CN32[48]，來自廣東省微生物菌種保藏中心（Guangdong Microbial Culture Collection Center， GDMCC）。好氧培養(yǎng)基成分為NaCl 5 g/L、牛肉浸膏5 g/L、蛋白胨10 g/L，pH值調(diào)至7.0，并對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高溫高壓滅菌處理。將-80 ℃冰箱中保存的微生物（1 mL）取出解凍后，在超凈工作臺(tái)倒入好氧培養(yǎng)基中，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)14 h （30 ℃，180 r/min），然后放置在超凈工作臺(tái)，取1 mL菌液轉(zhuǎn)接到好氧培養(yǎng)基中，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)14 h （30 ℃，180 r/min）。對(duì)100 mL西林瓶、純水用100% N2充氣30 min排氧，并高溫高壓滅菌，然后在厭氧工作站中配制亞鐵母液（FeSO4 1 mol/L），用橡膠塞壓緊并用鋁蓋進(jìn)一步密封，平衡24 h后，用0.22 μm濾頭過濾并進(jìn)行避光保存。配制葡萄糖母液（1 mol/L）、乳酸鹽母液（1 mol/L），并用0.22 μm濾頭過濾，然后用100% N2充氣30 min排氧。微量元素儲(chǔ)備液SL14和維生素儲(chǔ)備液V10的具體配方參考文獻(xiàn)[49]，用0.22 μm濾頭過濾之后，再用100% N2充氣30 min排氧。配制30 mmol/L的哌嗪-1，4-二乙磺酸（PIPES）作為洗菌和實(shí)驗(yàn)體系的緩沖液（pH=7.0）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案及測(cè)試方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方案 在體系厭氧培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)前，對(duì)要用到的所有的容器耗材和溶液進(jìn)行高溫高壓滅菌。在超凈工作臺(tái)上取微生物懸液，經(jīng)8 000 r/min于4 ℃離心8 min后，用30 mmol/L PIPES（pH=7.0）緩沖液洗滌重懸浮，重復(fù)3次后，配成菌懸液（OD600=1.0），在超凈工作臺(tái)上用100% N2充氣30 min，排氧，用橡膠塞壓緊并迅速用鋁蓋密封待用。30 mmol/L PIPES、5 mmol/L NaNO3分裝于100 mL西林瓶中，100% N2充氣30 min，排氧后進(jìn)行高溫高壓滅菌，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移到厭氧工作站中，根據(jù)不同處理組（處理組見表1）配制反應(yīng)體系，反應(yīng)體系溶液總體積為80 mL，包括：4 mL已制備的菌懸液、5 mmol/L NO-3、10 mmol/L碳源、微量元素10 mL/L、維生素10 mL/L、5 mmol/L （1 mmol/L）FeSO4、30 mmol/L PIPES。反應(yīng)體系在生化培養(yǎng)箱中（30±0.5 ℃） 避光靜置培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間進(jìn)行取樣，并測(cè)定反應(yīng)物、生成物濃度。

1.2.2 測(cè)試分析方法

實(shí)驗(yàn)采取連續(xù)性取樣，每次取樣1.5 mL，迅速進(jìn)行Fe（Ⅱ）的測(cè)定。采用鄰菲羅啉顯色法進(jìn)行亞鐵的測(cè)定，使用酶標(biāo)儀測(cè)定在波長(zhǎng)510 nm處吸光值。然后將樣品充氧氣15 min，充分氧化樣品中的Fe（Ⅱ），用0.22 μm濾頭過濾保存于-20 ℃。取樣完成后，用配備離子色譜柱（IonPacAS14A 4×250 mm）的離子色譜儀（Dionex ICS-90）測(cè)定其中的NO-3、NO-2濃度，采用連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定NH+4。使用X射線衍射儀（D2 phaser）（Co靶、衍射角10°～80°、掃描速度0.2 （°）/min）測(cè)定生成礦物晶體結(jié)構(gòu)，使用掃描電子顯微鏡觀察微生物和礦物形貌。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 硝酸鹽還原動(dòng)力學(xué)

不同亞鐵濃度條件下，3種異化鐵還原菌的硝酸鹽還原動(dòng)力學(xué)曲線見圖1，3種異化鐵還原菌的硝酸鹽還原準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)見表2。結(jié)果表明，不加亞鐵情況下，L17和CN32體系的硝酸鹽在1.6 d時(shí)被完全還原，硝酸鹽還原的準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)分別為1.772、1.672/d（表2），說明L17和CN32的硝酸還原能力接近。MR-1體系與L17和CN32不同，在0～16 h硝酸鹽迅速還原，在16～64 h硝酸鹽還原速率變慢，在第3天，硝酸鹽被完全還原。硝酸鹽還原準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)0.674/d，顯著低于L17和CN32。分別在體系中添加1、5 mmol/L亞鐵，結(jié)果顯示，硝酸鹽的還原均受到顯著抑制。亞鐵為1 mmol/L條件下，微生物硝酸鹽還原速率明顯高于高濃度亞鐵條件，反應(yīng)在第7天已達(dá)到穩(wěn)定，L17菌在第7天將硝酸鹽完全還原;CN32體系的硝酸鹽在第4天基本被還原;說明低濃度亞鐵抑制了L17、CN-32硝酸鹽還原速率，但硝酸鹽最終能被完全還原。在MR-1體系，初始階段硝酸鹽還原速率較快，之后迅速達(dá)到平衡，硝酸鹽被還原30%，說明低濃度亞鐵顯著的抑制了MR-1硝酸鹽還原過程。綜上所述，在低濃度亞鐵條件下，微生物硝酸鹽還原速率為CN32（0.563/d）>L17 （0.179/d）>MR-1 （0.034/d）。在高濃度5 mmol/L亞鐵條件下，L17處理組僅僅有0.7 mmol/L硝酸鹽被還原，CN32處理組在反應(yīng)12 d后，1 mmol/L硝酸鹽被還原，MR-1處理組在反應(yīng)12 d后，1.6 mmol/L硝酸鹽被還原，其準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)分別為0.010/d、0.014/d、0.010/d，顯著低于1 mmol/L亞鐵處理以及不加亞鐵的處理。3種菌在高濃度亞鐵條件下，反應(yīng)前期少量的硝酸鹽被還原，之后硝酸鹽還原過程停滯，表明了高濃度亞鐵對(duì)微生物硝酸鹽還原具有顯著的抑制作用。綜上所述，亞鐵的添加抑制了微生物硝酸鹽還原過程，而隨著亞鐵濃度的升高，對(duì)微生物還原硝酸鹽的抑制作用增強(qiáng)，亞鐵對(duì)不同類型鐵還原微生物硝酸鹽還原的抑制程度存在差異。

2.2 亞硝酸鹽和銨根生成動(dòng)力學(xué)

實(shí)驗(yàn)選取的鐵還原微生物硝酸鹽代謝途徑存在差異，亞硝酸鹽是鐵還原微生物還原硝酸鹽的次級(jí)產(chǎn)物。L17不僅能將硝酸鹽還原為N2O和NO，也能夠還原為NH+4[30]。CN32還原硝酸鹽的產(chǎn)物為N2O和NO，MR-1還原硝酸鹽的產(chǎn)物為NH+4[45]。亞硝酸鹽、銨根的生成動(dòng)力學(xué)結(jié)果如圖2所示。對(duì)于生物處理組cell+NO-3，L17在第1.5天的亞硝酸鹽積累達(dá)到4.8 mmol/L，隨后被持續(xù)還原，在第12天亞硝酸鹽剩余1.7 mmol/L。銨根作為L(zhǎng)17還原亞硝酸鹽的產(chǎn)物，在第0～5天生成速率較慢，在第12天積累量為1.4 mmol/L。對(duì)于cell+NO-3+ Fe2+處理組，加入1 mmol/L亞鐵后，亞硝酸鹽持續(xù)生成并在第7天積累量為4 mmol/L。添加5 mmol/L亞鐵條件下，亞硝酸鹽在第2.6天積累量達(dá)到最大0.74 mmol/L;亞鐵的添加抑制了銨根的生成，在1 mmol/L亞鐵條件下銨根的最高生成量?jī)H僅0.09 mmol/L，而5 mmol/L亞鐵條件下未發(fā)現(xiàn)銨根的生成。圖2（b）結(jié)果表明，CN32生物處理組在反應(yīng)第2天亞硝酸鹽生成量達(dá)到最高，之后還原速率減慢，亞硝酸鹽在第12天僅僅被還原9.8%，說明CN32硝酸鹽還原速率顯著高于亞硝酸鹽還原速率。低濃度亞鐵條件下，CN32亞硝酸鹽在第4天生成量達(dá)到最高4.6 mmol/L，之后亞硝酸鹽被持續(xù)還原。而高濃度亞鐵濃度顯著的抑制了CN32亞硝酸鹽的生成，其亞硝酸鹽最高生成量為0.91 mmol/L。CN32處理組未發(fā)現(xiàn)銨根的生成。圖2（c）結(jié)果表明，MR-1迅速還原硝酸鹽，導(dǎo)致了亞硝酸鹽大量積累，在16 h亞硝酸鹽積累量達(dá)到3.98 mmol/L，之后被持續(xù)還原。研究表明，亞硝酸鹽的添加抑制了MR-1的生長(zhǎng)，證明亞硝酸鹽對(duì)MR-1代謝活動(dòng)的抑制作用[44]。因此，高濃度的亞硝酸鹽積累抑制了MR-1的硝酸鹽還原過程。銨根在第12天積累量達(dá)到3.97 mmol/L，表明亞硝酸鹽基本上被異化還原為銨。而含有亞鐵的處理組中，亞硝酸鹽的積累量為1 mmol/L左右。在低濃度亞鐵條件下，銨根的最大生成量為0.23 mmol/L;而在高濃度亞鐵條件下，沒有發(fā)現(xiàn)銨根的生成，說明亞鐵顯著抑制了亞硝酸鹽異化還原為銨。上述結(jié)果表明，3種微生物處理組中，亞鐵的添加減少了亞硝酸的積累，一方面是因?yàn)閬嗚F抑制了微生物硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，另一方面是因?yàn)閬嗚F與亞硝酸鹽化學(xué)反硝化作用消耗了一部分亞硝酸鹽[38， 42， 50]。亞鐵抑制了L17和MR-1銨根的生成，隨著亞鐵濃度的升高，微生物硝酸鹽異化還原為銨越少，原因是NRFO過程中，亞硝酸鹽一方面被微生物還原，另一方面被亞鐵化學(xué)反硝化過程還原。相比于亞硝酸鹽的生物還原過程，亞硝酸鹽和亞鐵之間化學(xué)反應(yīng)相對(duì)較快[51]。這導(dǎo)致了亞鐵添加條件下銨根生成量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于生物處理組銨根生成量。

2.3 亞鐵氧化動(dòng)力學(xué)

亞鐵氧化動(dòng)力學(xué)如圖3所示。在未添加硝酸鹽的條件下，L17、CN32和MR-1均不能生物氧化亞鐵;而加入硝酸鹽后，在1、5 mmol/L Fe2+的體系中均發(fā)生了氧化，在厭氧無催化劑存在的條件下，亞鐵和硝酸鹽不能直接發(fā)生化學(xué)反應(yīng)[31， 51]。說明鐵還原條件下的亞鐵氧化是由硝酸鹽還原導(dǎo)致的。對(duì)于1 mmol/L Fe2+，在L17體系中，亞鐵在第4天接近完全氧化; CN32體系亞鐵完全氧化耗時(shí)6 d;MR-1體系中，直到第7天亞鐵僅氧化14.4%。其準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)分別為L(zhǎng)17 （0.066/d）、CN32 （0.051/d）、MR-1 （0.034/d） （表2）。在5 mmol/L Fe2+條件下，第12天L17、CN32、MR-1體系中分別有57.1%、51.4%、34.1%的亞鐵發(fā)生氧化，其準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)分別為L(zhǎng)17 （0.066/d）、CN32 （0.051/d）、MR-1 （0.034/d）。上述結(jié)果表明，3種鐵還原菌的亞鐵氧化速率為L(zhǎng)17>CN32>MR-1，亞鐵氧化速率不同的原因是，不同微生物的硝酸鹽還原速率的差異以及代謝途徑的不同。在L17和CN32體系中，高濃度亞鐵不完全氧化，但低濃度亞鐵可以完全氧化;MR-1在不同的亞鐵濃度下均表現(xiàn)為亞鐵的不完全氧化。

2.4 次生礦物表征

亞硝酸鹽與亞鐵化學(xué)反硝化作用生成的次生礦物分為3部分，一部分沉淀于細(xì)胞周圍環(huán)境（綠色箭頭所示），一部分粘附在細(xì)胞表面但結(jié)合并不緊密（藍(lán)色箭頭所示）;一部分沉淀生成在細(xì)胞表面或者外膜，形成細(xì)胞結(jié)殼（紅色箭頭所示）。如圖4所示。

在Fe2+濃度為5 mmol/L的條件下，次生礦物大量附著在細(xì)胞表面，3種微生物均發(fā)生了明顯的細(xì)胞結(jié)殼，導(dǎo)致在高濃度亞鐵條件下硝酸鹽還原速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于低濃度亞鐵濃度。在Fe2+濃度為1 mmol/L條件下，如圖5所示。

L17和CN32亞鐵氧化生成鐵氧化物并沉淀在細(xì)胞表面，會(huì)阻礙硝酸鹽進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)進(jìn)行還原。然而，大部分微生物沒有結(jié)殼，所以，在反應(yīng)后期，硝酸鹽仍然能被完全還原;而且L17細(xì)胞表面沉淀的次生礦物明顯多于CN32，導(dǎo)致L17硝酸鹽還原速率明顯低于CN32。低濃度亞鐵條件下，MR-1處理組亞鐵幾乎沒有被氧化，所以，未收集到次生礦物，這可能是因?yàn)閬嗚F的添加導(dǎo)致了細(xì)胞活性降低，從而抑制了硝酸鹽還原過程。同時(shí)，對(duì)次生礦物類型進(jìn)行了XRD表征，如圖6所示，結(jié)果表明，在高濃度亞鐵條件下，3種鐵還原微生物處理組生成的結(jié)晶態(tài)礦物主要為針鐵礦。亞鐵與亞硝酸鹽化學(xué)反應(yīng)生成的鐵氧化物主要為針鐵礦和纖鐵礦[50]。在低濃度亞鐵條件下，生成的鐵氧化物除了針鐵礦之外，還生成了結(jié)晶度較差的水鐵礦，說明亞鐵氧化成礦的結(jié)晶度與亞鐵濃度正相關(guān)。

綜上所述，亞鐵氧化成礦并附著在細(xì)胞表面，能影響微生物硝酸鹽還原。隨著亞鐵濃度的提高，細(xì)胞結(jié)殼逐漸增加，次生礦物結(jié)晶度提高，阻礙硝酸鹽進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)進(jìn)行還原，導(dǎo)致了硝酸鹽還原速率明顯降低甚至完全停滯，從而抑制了微生物的代謝活動(dòng)[52]。

2.5 反應(yīng)機(jī)制與環(huán)境意義

大量的異化鐵還原菌具有還原硝酸鹽的功能[31， 34， 43， 53-55]。在厭氧富鐵環(huán)境中，微生物還原硝酸鹽的中間產(chǎn)物NO-2一方面與亞鐵發(fā)生化學(xué)反硝化，另一方面亞硝酸鹽被微生物還原，亞硝酸鹽還原產(chǎn)物為NO和N2O，亞鐵氧化形成鐵氧化物并沉淀在細(xì)胞表面[36， 56]。然而，微生物不能將亞鐵作為電子供體進(jìn)行氧化。不同異化鐵還原菌介導(dǎo)的硝酸鹽還原-亞鐵氧化過程機(jī)制存在差異，由動(dòng)力學(xué)結(jié)果和礦物學(xué)表征的結(jié)果分析得到3種異化鐵還原菌的反應(yīng)機(jī)制，如圖7所示。L17菌介導(dǎo)的硝酸鹽還原亞鐵氧化過程機(jī)制如圖7（a）所示，硝酸鹽進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)被硝酸鹽還原酶（Nap）還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽有3種代謝途徑，一方面能夠被亞硝酸鹽還原酶（NirK和NrfA）還原為N2O和NH+4，另一方面被亞鐵化學(xué)還原。CN32菌介導(dǎo)的硝酸鹽還原亞鐵氧化過程機(jī)制如圖7（b）所示，硝酸鹽進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)被硝酸鹽還原酶（Nap）還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽有兩種代謝途徑，一方面能夠被亞硝酸鹽還原酶（NirK）還原，另一方面被亞鐵化學(xué)還原。MR-1菌介導(dǎo)的硝酸鹽還原亞鐵氧化過程機(jī)制如圖7（c）所示，硝酸鹽進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)被硝酸鹽還原酶（Nap）還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽通過生物與非生物共同作用被還原，微生物還原亞硝酸鹽（NrfA途徑）的產(chǎn)物只有NH+4，另一方面亞硝酸鹽被化學(xué)還原為N2O。亞鐵氧化生成鐵氧化物，鐵氧化物能夠被鐵還原菌還原。以往研究表明，即使是較小濃度亞鐵也會(huì)抑制微生物的NO-X還原[36]。所以，鐵還原菌硝酸鹽還原途徑和對(duì)亞鐵毒害響應(yīng)的差異，導(dǎo)致了硝酸鹽還原和亞鐵氧化速率的明顯差異。亞鐵競(jìng)爭(zhēng)性還原亞硝酸鹽抑制了NH+4的生成，促進(jìn)了N2O的生成。亞鐵氧化形成的鐵氧化物沉淀在細(xì)胞表面，阻礙了硝酸鹽進(jìn)入細(xì)胞被還原，抑制了微生物硝酸鹽還原過程，亞硝酸鹽生成的減少進(jìn)一步影響了亞鐵氧化速率。隨著亞鐵濃度的提高，亞鐵氧化速率升高并導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)殼，硝酸鹽無法進(jìn)入細(xì)胞被還原，導(dǎo)致硝酸鹽還原亞鐵氧化過程停滯。亞鐵氧化主要生成的是針鐵礦，隨著亞鐵濃度的提高，鐵礦的結(jié)晶度也越高。

鐵還原菌還原鐵主要通過3種途徑：鐵還原菌與鐵氧化物直接接觸;細(xì)胞分泌胞外螯合物提高鐵礦物溶解性，促進(jìn)鐵還原過程;細(xì)胞分泌或者利用周圍環(huán)境的電子穿梭體，通過胞外電子傳遞過程進(jìn)行鐵還原[57]。鐵還原菌介導(dǎo)的Fe-N循環(huán)已有報(bào)道，鐵氧化物作為電子受體被微生物還原為亞鐵，亞鐵被亞硝酸鹽化學(xué)氧化，生成的鐵氧化物仍然能夠作為鐵還原菌的電子受體被還原，實(shí)現(xiàn)鐵的氧化還原循環(huán)。對(duì)于亞硝酸鹽來說，一方面被亞鐵化學(xué)還原，另一方面能夠作為微生物的電子受體，被生物還原[58-59]。說明鐵還原菌介導(dǎo)的鐵氧化還原循環(huán)和硝酸鹽的持續(xù)還原理論上可行。但研究當(dāng)中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的鐵還原過程，其主要原因可能是：1）細(xì)胞結(jié)殼一方面限制微生物的運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)物的攝入，導(dǎo)致微生物鐵還原相關(guān)酶活性的降低，阻礙鐵還原菌胞外電子傳遞。另一方面微生物不能有效地利用細(xì)胞表面鐵氧化物作為電子受體[36， 60]。2）硝酸鹽還原過程抑制了鐵還原過程。目前的研究表明，細(xì)胞色素CymA能夠參與多種電子受體的還原過程，微生物更傾向于利用硝酸鹽作為電子受體，所以硝酸鹽還原CymA的電子傳遞過程可能導(dǎo)致鐵還原速率的減慢，表現(xiàn)為硝酸鹽和鐵的競(jìng)爭(zhēng)性還原[44， 61]。3）由于較高濃度亞硝酸鹽的存在，導(dǎo)致鐵還原生成亞鐵發(fā)生再氧化。4）體系殘留的亞鐵吸附在鐵氧化物表面，導(dǎo)致鐵活性的降低，微生物無法進(jìn)行生物鐵還原過程。

研究表明，厭氧環(huán)境中多種微生物群落參與NRFO過程[62]。本研究強(qiáng)調(diào)了在厭氧富鐵環(huán)境中非模式菌驅(qū)動(dòng)的NRFO過程，表明在厭氧環(huán)境中NRFO過程并不是單一微生物驅(qū)動(dòng)的，非亞鐵氧化功能菌也能夠驅(qū)動(dòng)NRFO過程。在低氮肥施加水稻土和厭氧沉積物中，微生物硝酸鹽異化還原為銨（DNRA）在硝酸鹽代謝途徑中占有主導(dǎo)地位[63-64]。鐵還原菌DNRA生成銨根，然后被植物或者其他微生物吸收利用，有利于厭氧環(huán)境氮沉積和再循環(huán)。厭氧富鐵環(huán)境中亞鐵顯著抑制微生物DNRA過程，亞鐵競(jìng)爭(zhēng)性還原亞硝酸鹽導(dǎo)致微生物產(chǎn)銨的大量減少，生成的NO和N2O釋放到大氣中，造成厭氧環(huán)境中氮損耗[39]。細(xì)胞結(jié)殼阻礙硝酸鹽等電子受體進(jìn)入細(xì)胞還原，導(dǎo)致硝酸鹽的不完全還原，同時(shí)限制微生物的運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入[60]。該研究表明，細(xì)胞結(jié)殼抑制了異化鐵還原菌介導(dǎo)的NRFO過程，細(xì)胞結(jié)殼對(duì)不同鐵還原菌的抑制機(jī)制不同。本工作豐富了硝酸鹽還原亞鐵氧化的研究思路，加深了對(duì)微生物驅(qū)動(dòng)的NRFO反應(yīng)機(jī)制的理解。

3 結(jié)論

鐵還原菌能夠通過硝酸鹽還原的中間產(chǎn)物亞硝酸鹽與亞鐵的化學(xué)反硝化作用實(shí)現(xiàn)亞鐵氧化過程。亞鐵抑制了微生物硝酸鹽還原、亞硝酸鹽和銨根的生成。低濃度亞鐵條件下，亞鐵降低了L17和CN32硝酸鹽還原速率，而亞鐵完全抑制了MR-1硝酸鹽還原，其抑制順序?yàn)镸R-1>L17>CN32。亞鐵嚴(yán)重抑制了硝酸鹽異化還原成銨過程。在高濃度亞鐵條件下，亞鐵氧化成礦明顯抑制了微生物硝酸鹽還原過程。在低濃度亞鐵條件下，對(duì)于L17和CN32來說，亞鐵氧化生成的鐵氧化物抑制了微生物的硝酸鹽還原，但大部分微生物沒有完全結(jié)殼，所以，硝酸鹽最終能被完全還原，且CN32硝酸鹽還原速率明顯高于L17。亞鐵毒害作用抑制了L17硝酸鹽還原過程，也是影響MR-1硝酸鹽還原的主要原因。隨著亞鐵濃度的升高，微生物細(xì)胞結(jié)殼程度越高，細(xì)胞的完全結(jié)殼是硝酸鹽還原停滯的主要原因。本研究拓展了硝酸鹽還原亞鐵氧化過程的微生物類型，加深了對(duì)微生物介導(dǎo)的硝酸鹽還原亞鐵氧化的理解，對(duì)研究微生物介導(dǎo)的鐵-氮循環(huán)過程具有重要的意義。

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（編輯 王秀玲）