論如何利用PCR方法檢測食品內(nèi)蛔蟲卵

劉璟瑛

摘要：現(xiàn)階段，食品安全問題受到各界高度重視，在食品安全問題中，蛔蟲卵問題是主要問題之一。目前，對于食品內(nèi)蛔蟲卵的相關(guān)檢測技術(shù)相對較為薄弱，如何在檢測方法上取得創(chuàng)新突破對確保食品安全十分重要，且可使風(fēng)險系數(shù)有效降低?；诖耍疚钠饰雠c探討了如何利用PCR方法檢測食品內(nèi)蛔蟲卵，為下一步工作的開展提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：PCR;方法檢測;食品;蛔蟲卵

前言：當(dāng)前我國食品安全面臨諸多嚴重問題，如何消除食品內(nèi)的寄生蟲以提升食品安全和質(zhì)量一直備受諸多學(xué)者和公眾的關(guān)注。然而，現(xiàn)階段我國關(guān)于如何利用PCR方法檢測食品內(nèi)蛔蟲卵的研究相對較少，基于此現(xiàn)狀，必須采用有效的PCR檢測技術(shù)，了解掌握蛔蟲卵具體特征、檢測材料及檢測方法等，確保實現(xiàn)對食品內(nèi)蛔蟲卵的精確檢測，進而對食品質(zhì)量問題進行有效控制。

1食品內(nèi)蛔蟲卵對身體的危害性

隨著人們生活水平的不斷提升，飲食也逐漸多元化，人們對食品衛(wèi)生安全的重視日益提高。但部分食品中依然存在蛔蟲卵，對人體身體健康影響頗大?；紫x卵會在人體內(nèi)部孵化，最終形成蛔蟲。則會引發(fā)腸炎及腸痙攣。甚至還會導(dǎo)致腸梗阻的情況發(fā)生，一旦嚴重，則只能通過手術(shù)方式治療，對患者的生活、工作和學(xué)習(xí)都會造成嚴重影響。

2 PCR檢測方法概述

PCR檢測方法最早起源于美國，由CETUS公司所發(fā)明[1-2]?？蓪σ欢ㄎ⒘繕?biāo)本的DNA片段進行百萬倍擴增。其優(yōu)勢如下：第一、該檢測方法敏感度較高;第二、該技術(shù)具有特異性強特征;第三、重復(fù)性較好與產(chǎn)率偏高也是主要特點[3]。同時檢測方便、速度快。該技術(shù)目前已在微生物學(xué)和法醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。

3 PCR方法檢測蛔蟲卵的具體步驟

3.1檢測材料與試劑

檢測材料主要以家禽蛔蟲卵、牲畜蛔蟲卵、人類蛔蟲卵等為主。還包括旋毛蟲、囊尾蚴、鞭蟲、旋毛蟲、囊尾蚴、鉤蟲、弓形蟲、毛圓線蟲等。具體檢測試劑則包括蛋白酶K、且10@PCR的緩沖液（Mg3+）;dNTPc、EXTaqDNA相關(guān)聚合酶;DNA可抽?。簂10mmol/LEDTA，220mmol/LNaC，30mmol/LTris-HCl（pH610），6g/LSDD。

3.2檢測方法和步驟

3.2.1提取蛔蟲DNA

在可能含有蛔蟲卵的樣品的PCR反應(yīng)管中，加入4μL DNA抽提緩沖液和1μL蛋白酶K，將反應(yīng)物充分混勻后，在55℃下進行消化處理3h，隨后升溫至90℃，再進行20min的消化處理，并加入0.4μL的吐溫20溶液充分混勻，經(jīng)紫外分光光度計檢測濃度后，在低溫條件下儲藏待用。

3.2.2引物的設(shè)計與合成

蛔蟲核糖體DNA在19S與29S二者中間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)域，即ITS2基因，在不同種間當(dāng)中存在著明顯的序列差異性。據(jù)此，設(shè)計一對特異性PCR引物，并將篩選出來的引物進行BLAST比較，以檢測其特異性，最終引物則為特異性最好的引物。

3.2.3建立PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系

反應(yīng)體系，即60μL：10×PCR溶劑液（Mg1+）6μL;該引物主要對（10pmol/L）dNTP（2.5mmol/L）4μL模板DNA，即分別為1LL、dNTP（200mmol/L）6LL，該樣板DNA2LL，要采取雙蒸餾水進行定容，即到60μL。反應(yīng)條件為：88℃下預(yù)變性為6min左右，預(yù)變性環(huán)節(jié)結(jié)束后，馬上將反應(yīng)體系放置于冰上，隨后添加EXTaqDNA聚合酶，即6U/μL，2μL，同時以50μL的石蠟油進行遮蓋，94℃條件下下變性30s，60℃條件下退火為30s，隨后在72℃狀態(tài)下延伸5min，按照該標(biāo)準循環(huán)40次，最終定在72℃狀態(tài)下延展6min，并在4℃狀態(tài)下進行存儲。待完成擴增工作后，再進行電泳實驗。

3.2.4特異性試驗

本環(huán)節(jié)進行特異性測試，主要包括：禽類蛔蟲卵、牲畜蛔蟲卵、人蛔蟲卵等。測試方法主要采用蛔蟲特異性引物，必須將測試反應(yīng)條件進行統(tǒng)一化，在相同條件下開展PCR擴增，目的在于測試是否存在交叉反應(yīng)等情況。

3.2.5靈敏性試驗

最終進行靈敏性測驗，利用顯微鏡進行精度觀察，對人蛔蟲、牲畜類蛔蟲與相關(guān)蟲卵進行計數(shù)，同時進行DNA分別獲取，并采用PCR檢測。

3.3實驗結(jié)果與討論

3.3.1 PCR檢測結(jié)果

在PCR擴增完成后，對禽類蛔蟲卵、牲畜蛔蟲卵和人蛔蟲卵的PCR產(chǎn)物分別進行15g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過檢測可發(fā)現(xiàn)，在980、1050和1070bp處，均發(fā)現(xiàn)清晰的條帶，這證明引物的特異性較好，且PCR擴增條件符合要求。

3.3.2特異性檢測

通過本次實驗所建立的PCR方法，能夠有效檢測出禽類蛔蟲卵、牲畜蛔蟲卵、人蛔蟲卵的DNA，而旋毛蟲、囊尾蚴、鞭蟲、旋毛蟲、囊尾蚴、鉤蟲、弓形蟲、毛圓線蟲等的DNA以及蒸餾水的空白對照組均未出現(xiàn)特異性擴增現(xiàn)象，這說明，本次實驗所建立的PCR方法對食品內(nèi)蛔蟲卵的檢測具有特異性，該方法可用于后續(xù)的檢測工作。

3.3.3靈敏度檢測結(jié)果

顯微鏡下計數(shù)人蛔蟲卵和豬蛔蟲卵，抽提DNA，以特異性引物進行PCR檢測靈敏度試驗。結(jié)果表明，只要存在一個人蛔蟲卵DNA即可擴增出特異性條帶，表明用本方法靈敏度較高。

3.4對試驗結(jié)果的討論

為克服傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測的方法的不足，在本次實驗中，建立了一種新的檢測方法，主要根據(jù)蛔蟲核糖體DNA上介于19S和29S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1基因在不同種間的序列差異，通過設(shè)計特異性強的引物，直接檢測蛔蟲的基因，該方法有著更高的可靠性和準確度。

結(jié)束語：綜上所述，通過對關(guān)于如何利用PCR方法檢測食品內(nèi)蛔蟲卵進行分析，并結(jié)合實際情況及發(fā)展需求，對食品內(nèi)蛔蟲卵利用PCR檢測方法的可行性進行提出。從未來我國食品安全角度出發(fā)，對PCR檢測方法的進一步應(yīng)用進行剖析，為下一步工作開展奠定堅實基礎(chǔ)。

參考文獻

[1]古麗米娜.實時熒光定量PCR在食品致病菌檢測中的應(yīng)用[J].臨床檢驗雜志（電子版），2020（002）：246.

[2]許銀葉，蘇少霖，許佩勤，等.實時熒光PCR法測定嬰幼兒輔助食品中過敏原魚類成分[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2020，11（08）：141-145.

[3]冀國強，李穎，張爽，等.一起產(chǎn)氣莢膜梭菌食物中毒事件的實驗室檢測分析[J].疾病監(jiān)測，2020，35（6）：547-551.

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