吳照祥 劉巧麗 李輝虎 鐘永達 葉昌炎 余發(fā)新

摘要：為探討不同修復措施對南方典型退化紅壤細菌群落功能組成的影響，設(shè)置單施生物炭（B）、微生物有機肥（OF）、化學肥料（CF）、生物炭配施微生物有機肥（BO）、生物炭配施化學肥料（BC）以及空白對照（CK）等6種修復處理方式并進行車前草的盆栽試驗，采用細菌16S rRNA基因的高通量測序技術(shù)并結(jié)合PICRUSt功能預測分析，研究不同修復處理方式下退化紅壤細菌群落結(jié)構(gòu)及其功能組成的變化。結(jié)果表明，微生物有機肥和化學肥料對車前草根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與功能組成具有顯著的影響（F2，15=25.55，R2=0.773 1，P<0.001;F2，15=17.22，R2=0.696 6，P<0.001），而生物炭的作用不顯著（P>0.05）;微生物有機肥處理車前草根際土壤細菌物種多樣性顯著增加，增幅達到17.30%，但是化學肥料顯著降低細菌物種多樣性，降幅達21.25%;微生物有機肥增加生物代謝途徑和氮循環(huán)途徑功能基因豐度，促進氮異化還原、反硝化作用和固氮作用過程，有利于土壤氮素的維持和土壤質(zhì)量的改善，而化學肥料施用則相反。另外，根際土壤細菌物種多樣性跟土壤的pH值顯著正相關(guān)，跟堿解氮和有效磷等土壤養(yǎng)分含量顯著負相關(guān)。本研究明確了退化紅壤微生物群落功能組成以及氮循環(huán)相關(guān)功能基因?qū)π迯痛胧┑捻憫?，為南方退化紅壤的生態(tài)修復與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：PICRUSt;退化紅壤;生態(tài)修復;細菌群落;功能基因預測

中圖分類號：S154.38+1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2021）16-0060-07

土壤退化是一個全球性的問題，主要包括土壤鹽漬化、酸化、板結(jié)、重金屬污染、營養(yǎng)元素失衡、有機質(zhì)和微生物多樣性減少等。在過去40年里，世界上1/3的可耕地因為各種退化原因而無法耕種。紅壤是我國南方土壤的重要組成部分，占全國土地面積的21%以上[1]。江西省地處南方亞熱帶中部，是我國重要的紅壤分布區(qū)，全省71%的土地面積都是紅壤[2]。南方紅壤地區(qū)水、熱條件優(yōu)越，光照充足，是我國農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)的重要區(qū)域，其中福建省和江西省森林覆蓋率位列全國之首，但是早期森林的過度采伐、毀林墾地，以及過度放牧、化肥農(nóng)藥的過度施用和高強度多頻次耕作等不合理的土地利用[3]，導致紅壤肥力下降、水土流失、地力衰退等嚴重的土壤退化問題，也引發(fā)了一系列的民生、經(jīng)濟、社會和生態(tài)問題。

土壤退化問題自1971年由聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）提出以來，一直備受各界的廣泛關(guān)注，世界各國也都開展了土壤退化現(xiàn)狀、成因以及應對措施方面的研究。我國早在20世紀50年代就開始對華南退化坡地土壤侵蝕進行長期的觀測，并進行植被恢復的研究[4]。經(jīng)過幾十年的不懈努力，我國在土壤退化及其恢復理論與應用技術(shù)方面取得了豐碩的成果，針對不同區(qū)域、不同土壤、不同退化類型和程度的生態(tài)系統(tǒng)，探索并總結(jié)了包括物理、化學和生物的退化土壤修復技術(shù)體系。在南方紅壤區(qū)這一獨特的生態(tài)系統(tǒng)，也開展了以恢復植被、控制水土流失為目標的荒山綠化、水土流失綜合治理研究并取得顯著成效[5]。

雖然不同學者對土壤退化定義的論述具有差異性，但是都著重強調(diào)土壤質(zhì)量的降低，土壤退化和土壤質(zhì)量具有千絲萬縷的聯(lián)系[6]。微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，幾乎所有的土壤過程都直接或間接與其有關(guān)，越來越受到科學家的密切關(guān)注[4，6]。土壤是微生物的重要棲息地，其理化性質(zhì)和養(yǎng)分含量對微生物群落具有重要影響，一定程度上決定了微生物的種類、數(shù)量和多樣性，而土壤微生物的結(jié)構(gòu)和多樣性的變化也可以反映土壤質(zhì)量的變化趨勢。微生物活動對健康和肥沃的土壤至關(guān)重要，是土壤質(zhì)量和退化土壤修復評價的一項重要指標[7]。

隨著生物學技術(shù)的進步和退化土壤修復研究的深入，人們對退化土壤微生物群落組成與多樣性以及修復措施對土壤微生物的影響等方面開展了廣泛的研究，但是對退化土壤中的微生物群落功能組成的系統(tǒng)研究還相對較少，多集中在微生物硝化作用、反硝化作用以及固氮能力等單一功能的研究。土壤微生物的分類學多樣性與功能多樣性有密切聯(lián)系，但并沒有顯著相關(guān)性[8-9]，所以土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能組成的系統(tǒng)研究有助于土壤微生態(tài)過程的全面揭示。因此，本研究通過室內(nèi)盆栽模擬野外退化土壤的修復，通過對細菌16S rRNA進行高通量測序并借助細菌PICRUSt基因功能預測技術(shù)，研究稻殼生物炭、微生物有機肥以及化學肥料施用等措施對南方退化紅壤土壤微生物功能組成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

南昌市黃馬鄉(xiāng)試驗基地位于116°1′3.57″E、28°22′28.28″N，土壤成土母質(zhì)是第四紀紅黏土，由于長期過度利用，造成水土流失、土壤板結(jié)、養(yǎng)分短缺等問題，土壤退化嚴重。挖取0～20 cm的表層土壤，過2 mm篩后風干備用，其基本理化性狀見表1。稻殼生物炭以干燥稻殼為原料，通過炭化爐在 500 ℃、無氧狀態(tài)下制備而成，pH值為8.36，養(yǎng)分包括48.59% C、1.87% N、1.53% P、2.94% K，含灰分11.43%。微生物有機肥是將畜禽糞便發(fā)酵完全后與多黏芽孢桿菌復合而成，化學肥料為史丹利農(nóng)業(yè)集團股份有限公司生產(chǎn)的硫酸銨型復合肥，均購買于當?shù)剞r(nóng)資市場。微生物有機肥含44.20%的有機質(zhì)和2.35% N、0.62% P、4.49% K，多黏芽孢桿菌活菌數(shù)為3×108 CFU/g，化學復合肥中N、P、K含量分別為12.0%、5.24%、9.96%。本試驗采用室內(nèi)模擬盆栽方式進行，分別添加稻殼生物炭（B）、微生物有機肥（OF）以及化學肥料（CF）、生物炭配施微生物有機肥（BO）、生物炭配施化學肥料（BC）等方式對退化紅壤進行修復，以空白作為對照（CK），共設(shè)置6個試驗處理，詳細設(shè)計方案和養(yǎng)分添加見表2，每個處理重復3次。2019年8月25日以塑料花盆（口徑15 cm×高12 cm，底部有孔）作為栽培容器，裝填1.0 kg混合均勻的基質(zhì)后移栽2株1月齡健壯車前幼苗。試驗在江西省科學院智能人工氣候室中進行。試驗期間保持室內(nèi)溫度為20～25 ℃，空氣濕度為60%。植物生長期間定期澆灌去離子水，稱質(zhì)量法保持土壤含水量在20%（最大田間持水量60%）。植物生長90 d后，移除植物地上部和根系后，收集土壤樣品，過2 mm土壤篩，混勻后分成2份，一份自然風干用于土壤理化性狀測定，一份真空冷凍干燥后置于-80 ℃超低溫保藏，用于土壤細菌分子生態(tài)學分析。

1.2 土壤理化性狀測定

土壤pH值和電導率采用PHS-3C型酸度計測定（測定pH值的水土比為2.5 ∶ 1，測定電導率的水土比為 5 ∶ 1，F(xiàn)E20-Five Easy PlusTM，Switzerland）;土壤有機碳含量采用重鉻酸鉀氧化還原滴定法[10]測定;土壤可溶解有機碳含量采用沸水浸提法[11]測定;采用硼酸吸收鹽酸滴定法測定土壤堿解氮含量[12];土壤有效磷含量采用氟化銨-鹽酸溶液浸提，鉬藍比色法測定[13];土壤速效鉀含量采用中性醋酸銨溶液浸提，火焰光度計法測定。

1.3 高通量測序

每個土壤樣品準確稱取冷凍干燥后的土壤 500 mg。使用試劑盒Fast DNA SPIN Kit for Soil（Q BIOgene Inc.，Carlsbad，CA，USA）提取土壤總DNA，按照試劑盒內(nèi)的操作流程進行。提取的DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer（NanoDrop Technologies）檢測后保存于-20 ℃冰箱中備用。

合成帶有barcode標簽序列（用于區(qū)分不同的樣品）及接頭序列的特異引物515F/806R（前引物515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′;后引物806R：5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′），采用PCR擴增技術(shù)對土壤細菌16S rRNA基因高變區(qū)的V4-V5進行擴增。PCR擴增采用25 μL反應體系，包括1 μL的模板DNA（10 ng/L）、1 μL上下游引物[10 pmol/μL，生工生物工程（上海）股份有限公司]、12.5 μL 2×PCR緩沖液（TaKaRa公司，大連）、0.5 μL DNA Taq 聚合酶（2.5 U/μL，TaKaRa公司），最后加滅菌超純水至25 μL。反應條件為：95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，35個循環(huán);72 ℃再延伸10 min。每個樣品3個重復，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后使用QIAEXDNA（QIAGEN Inc，USA）膠純化試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，并用Nanodrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer（NanoDrop Technologies）對回收產(chǎn)物進行檢測。按照每個樣品的測序量要求，進行相應比例混合并構(gòu)建MiSeq文庫，在Illumina MiSeq （PE×300）平臺上進行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對MiSeq測序得到的數(shù)據(jù)進行拼接，同時對序列的質(zhì)量和拼接效果進行質(zhì)控過濾，并根據(jù)序列末端的box序列校正序列方向。拼接后的數(shù)據(jù)用QIIME （version 1.8.0）軟件[14]進一步質(zhì)控：序列長度小于200 bp，連續(xù)5個堿基平均測序質(zhì)量小于30，含有模糊堿基，引物堿基中有超過1個的錯配，以及無法被任何barcode 識別的序列，所有包含這些條件的序列都會被丟棄。采用UCHIME[15]借助16S核糖體基因序列的Silva數(shù)據(jù)庫（version 119）[16]檢測并去除嵌合體序列;采用Usearch對所有序列參照Greengenes數(shù)據(jù)庫以97%的相似度進行OTU聚類分析，得到OTU列表并對其進行序列數(shù)量標準化，借助PICRUSt軟件對細菌16S rRNA基因功能進行預測。每個土壤樣品的細菌群落豐富度是通過計算每個樣品的OTU獲得的。細菌物種數(shù)和土壤理化性狀之間的相關(guān)關(guān)系采用線性回歸方法進行分析。擬合適合度采用調(diào)整的R2和P值進行判定?；贐ray-Curtis 相似性矩陣的PCoA 分析用于分析土壤細菌群落組成和預測基因功能多樣性的變異，并用多元的相似性分析方法ADONIS（Adonis test，Vegan package in R）檢驗變異的顯著程度[17]。應用統(tǒng)計分析軟件SPSS 18.0計算微生物多樣性指數(shù)，預測功能基因豐度平均值和標準差，并進行獨立樣本t檢驗，確定各處理樣品間微生物多樣性和預測功能基因差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細菌多樣性

本研究包括18個土壤樣品，測序下機數(shù)據(jù)通過拼接、質(zhì)控后共計得到1 201 631條有效序列，根據(jù)97%的相似度劃分為3 669個OTU。平均每個樣品獲得66 757條序列，每個樣品的序列數(shù)在43 548～74 917條之間。經(jīng)過比對、注釋和分類統(tǒng)計得到32個細菌門分類單元，其中優(yōu)勢分類門（>細菌群落總豐度的1%）分別為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、Patescibacteria、WPS-2菌門、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes），占總序列數(shù)的95%以上。優(yōu)勢分類門在不同土壤修復措施下具有顯著差異，其中變化最大的為厚壁菌門。

對不同修復措施下土壤細菌物種數(shù)的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，生物有機肥的施用顯著提高了土壤細菌物種數(shù)，化學復合肥料的施用顯著降低了土壤細菌物種數(shù)，而稻殼生物炭的施用沒有產(chǎn)生顯著的影響（圖1）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，土壤細菌物種數(shù)（OTU）與土壤pH值呈正相關(guān)，而與土壤堿解氮和有效磷含量呈負相關(guān)（圖2），都達到了極顯著的水平（P<0.01）。

2.2 土壤細菌群落結(jié)構(gòu)變化

基于Bray-Curtis距離的細菌群落組成，在PCoA分析的第一、第二排序軸上明顯區(qū)分成3個大的區(qū)域（圖3），分別為不施肥組、施用微生物有機肥組、施用化學復合肥組（Adonis F2，15=25.55，R2=0.773 1，P<0.001），解釋率達到68.7%。各大組均包括施用生物炭和不施用生物炭，但是無法根據(jù)生物炭施用與否進行進一步的劃分（P>0.05）。

2.3 土壤細菌功能組成

基于KEGG數(shù)據(jù)對比樣品中的細菌一級功能分類，各個修復處理間細菌一級功能基因豐度差異見圖4。已知的六大類生物代謝通路中，代謝（Metabolism）相關(guān)基因豐度最高，其次是遺傳信息處理和環(huán)境信息處理，而細胞過程、有機系統(tǒng)和人類疾病相關(guān)基因豐度很低。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，化學肥料（CF和BC）施用顯著降低代謝和環(huán)境信息處理相關(guān)基因豐度（P<0.05），有機肥（OF和BO）的施用對其豐度提升不顯著。有機肥和化學肥料的施用對遺傳信息處理、人類疾病和細胞過程相關(guān)基因豐度的影響不顯著（P>0.05）。另外，化學肥料的施用還顯著降低了有機系統(tǒng)相關(guān)基因豐度。稻殼生物炭單獨或與肥料混合施用都對細菌一級功能基因豐度無顯著影響。

上述生物代謝通路可以進一步細分為二級功能層，共包含40種子功能，根據(jù)Bray-Curtis距離計算出預測功能基因β多樣性，通過PCoA分析發(fā)現(xiàn)，所研究的18個土壤樣品的區(qū)分不明顯（圖5），大致可以區(qū)分為對照組、化學肥料組以及其他（Adonis F2，15=17.22，R2=0.6966，P<0.001）。

2.4 土壤細菌氮循環(huán)

進一步研究不同類型肥料施用下車前根際土壤細菌參與氮循環(huán)途徑（三級功能層，ko00910）的基因差異，發(fā)現(xiàn)有機肥施用顯著提高氮循環(huán)途徑基因豐度，化學肥料施用降低其豐度，而稻殼生物炭單獨施用或與肥料混合施用都沒有表現(xiàn)出明顯的影響（圖6）。

結(jié)果表明，本試驗中稻殼生物炭對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與功能組成無顯著性影響，所以接下來對氮循環(huán)5個階段（氮異化還原、氮同化還原、反硝化作用、固氮作用和硝化作用）相關(guān)功能基因豐度分析只在施用有機肥（OF）、化學肥料（CF）的修復處理和空白對照（CK）之間進行。總體而言，退化紅壤車前根際細菌的氮異化還原、氮同化還原以及反硝化作用相關(guān)基因豐度最高，固氮作用次之，硝化作用最低（圖7）。在車前根際土壤細菌氮異化還原過程中，亞硝酸還原酶基因nirB、硝酸還原酶基因narL和異化還原酶基因nrfA對各修復處理的響應基本一致，有機肥顯著提升其豐度，而化學肥料處理其豐度顯著降低或降低不顯著?；瘜W肥料施用顯著降低亞硝酸還原酶基因nirD豐度，而有機肥無顯著影響。氮同化還原過程中，硝酸還原酶基因nasA和nirA豐度高于nasB和narB，nasA和nirA豐度均表現(xiàn)為CK>OF>CF。反硝化作用過程中，化學肥料施用顯著增加亞硝酸還原酶基因nirK和一氧化氮還原酶基因norB豐度，降低一氧化氮還原酶基因narC、亞硝酸還原酶基因narH以及硝酸還原酶基因napA和napB豐度，而有機肥施用顯著增加亞硝酸還原酶基因narH和氧化亞氮還原酶基因nosZ豐度。固氮作用過程的固氮酶基因nifD、nifH、anfG和nifK豐度大小均表現(xiàn)為OF>CK>CF處理。硝化作用過程相關(guān)基因豐度明顯低于其他氮循環(huán)過程，其中羥胺脫氫酶基因hao豐度表現(xiàn)為CK>OF>CF處理，其他基因豐度無顯著差異。

3 討論與結(jié)論

植物根際土壤微生物是根部最活躍的部分，能夠敏感地反映出土壤生態(tài)系統(tǒng)的變化[4，6，18]。本研究發(fā)現(xiàn)，有機肥施用顯著增加退化紅壤車前根際細菌物種數(shù)，提升代謝和環(huán)境信息處理通路基因豐度，特別是土壤氮循環(huán)途徑基因豐度，調(diào)控土壤氮循環(huán)過程?；瘜W肥料的施用基本上發(fā)揮了相反的作用，而稻殼生物炭的影響不明顯。根際土壤細菌物種數(shù)以及生物代謝途徑基因豐度，反映了土壤同化和礦化的能力及方向，在土壤養(yǎng)分循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化過程中起著重要作用，是土壤生態(tài)系統(tǒng)肥力的重要生物學指標[19]，表明有機肥施用能對退化紅壤起到很好的修復作用，提升土壤質(zhì)量和土地生產(chǎn)力。

相關(guān)研究表明，生物炭和肥料的單獨施用都對土壤微生物群落組成表現(xiàn)出較強的調(diào)節(jié)作用[20-21]，有效提升土壤質(zhì)量。本研究將生物炭與微生物有機肥以及化學肥料相結(jié)合，并應用于退化紅壤的生態(tài)修復，結(jié)果表明，微生物有機肥能顯著增加細菌群落物種多樣性，而化學肥料表現(xiàn)出相反的作用，與前人研究結(jié)果[22]一致。施用微生物有機肥向土壤補充活潑的碳源，促進異養(yǎng)微生物群落發(fā)展壯大，增強其代謝活性[23]，這可能是微生物有機肥提升土壤微生物群落的重要原因。然而，稻殼生物炭對細菌群落多樣性沒有顯著的影響。細菌群落主成分（PCoA）分析結(jié)果也顯示，所有樣品可以根據(jù)肥料類型劃分為3類，包括微生物有機肥相關(guān)修復、化學肥料相關(guān)修復以及不施肥對照，生物炭施用與否區(qū)分不明顯。

稻殼生物炭施用對退化紅壤中細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性沒有表現(xiàn)出顯著的影響，這也體現(xiàn)在土壤微生物群落功能組成上，包括基于KEGG的生物代謝通路功能基因豐度、氮循環(huán)途徑功能基因豐度以及氮循環(huán)過程相關(guān)功能基因豐度。已有研究發(fā)現(xiàn)，多種類型生物炭的施用對土壤微生物群落具有很好的調(diào)節(jié)作用[20，24-25]，這可能是由生物炭自身特性及劑量、土壤類型、環(huán)境條件與微生物表征方法等差異引起的，本試驗中生物炭施用對土壤微生物群落沒有發(fā)揮顯著作用的原因還有待進一步深入研究。

基于16S rRNA基因的高通量測序，比對KEGG數(shù)據(jù)庫對細菌群落功能組成進行預測分析，結(jié)果表明，施用不同類型肥料對微生物群落功能組成具有顯著的影響，施用微生物有機肥能顯著增加生物代謝通路功能基因豐度，提升代謝途徑中的氮循環(huán)途徑功能基因豐度（ko00910），而化學肥料的施用基本表現(xiàn)出相反的作用。肥料施用對細菌群落功能組成的影響與其對細菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響基本一致，說明基于肥料施用的退化紅壤的修復效應是深遠的，微生物有機肥的施用能夠明顯改善退化土壤質(zhì)量，也將顯著提升土地的生產(chǎn)力。

對氮循環(huán)過程相關(guān)的功能基因分析結(jié)果表明，微生物有機肥增加氮異化還原、氮固定以及部分反硝化作用相關(guān)的功能基因豐度，究其原因可能是反硝化、固氮等微生物多為異養(yǎng)微生物，有機物料可以為土壤提供更均衡和穩(wěn)定的營養(yǎng)供應，促進它們生長繁殖[26]，這有利于促進土壤中氮素養(yǎng)分的維持[27]，而化學肥料表現(xiàn)出顯著的抑制作用。大量研究表明，農(nóng)田土壤中施加氮肥可以顯著提高參與反硝化作用過程的nirK和norB基因豐度[28-29]，與本研究結(jié)果一致。nirK和norB是反硝化作用過程的2個關(guān)鍵基因[27]，化學肥料的施用通過增加它們的豐度，促進土壤氮素向空氣中擴散，這不利于環(huán)境保護和土壤質(zhì)量。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)合細菌16S RNA基因高通量測序和PICRUSt功能基因預測，分析并比較了稻殼生物炭、微生物有機肥和化學肥料在典型南方退化紅壤修復中對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能組成的影響。微生物有機肥對退化紅壤的修復增加車前根際土壤細菌群落多樣性，有效調(diào)節(jié)細菌的微生物群落結(jié)構(gòu)，而化學肥料施用則表現(xiàn)出相反的作用。微生物有機肥施用顯著改善了土壤微生物群落功能組成，提高生物代謝途徑和氮循環(huán)途徑功能基因豐度。另外，微生物有機肥的施用還調(diào)節(jié)了氮循環(huán)過程相關(guān)基因豐度，有利于土壤氮素的維持，改善土壤質(zhì)量，而化學肥料施用則相反。稻殼生物炭單獨施用或與肥料混合施用對微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性無顯著影響，表現(xiàn)在土壤微生物群落功能組成上。

參考文獻：

[1]李慶逵. 中國紅壤[M]. 北京：科學出版社，1983.

[2]江西土地資源管理局. 江西土壤[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社，1991.

[3]吳 卓，戴爾阜，林媚珍. 氣候變化和人類活動對南方紅壤丘陵區(qū)森林生態(tài)系統(tǒng)影響模擬研究——以江西泰和縣為例[J]. 地理研究，2018，37（11）：2141-2152.

[4]余作岳，彭少麟，丁明懋. 熱帶亞熱帶退化生態(tài)系統(tǒng)植被恢復生態(tài)學研究[M]. 廣州：廣東科技出版社，1996.

[5]黃小春，宋小妹. 江西低丘紅壤水土流失區(qū)植被恢復策略及理論探討[J]. 江西林業(yè)科技，2008（6）：42-47.

[6]Doran J W. Defining soil quality for sustainable environment[M]. Wisconsin：Soil Science Society of America，1994.

[7]Cruz-Paredes C，Wallander H，Kjller R，et al. Using community trait-distributions to assign microbial responses to pH changes and Cd in forest soils treated with wood ash[J]. Soil Biology and Biochemistry，2017，112：153-164.

[8]Harsch M A，Hulme P E，McGlone M S，et al. Are treelines advancing？ A global meta-analysis of treeline response to climate warming[J]. Ecology Letters，2009，12（10）：1040-1049.

[9]Shen C C，Shi Y，Ni Y Y，et al. Dramatic increases of soil microbial functional gene diversity at the treeline ecotone of Changbai Mountain[J]. Frontiers in Microbiology，2016，7：1184.

[10]Yuan C L，Mou C X，Wu W L，et al. Effect of different fertilization treatments on indole-3-acetic acid producing bacteria in soil[J]. Journal of Soils and Sediments，2011，11（2）：322-329.

[11]Chantigny M H. Dissolved and water-extractable organic matter in soils：A review on the influence of land use and management practices[J]. Geoderma，2003，113：357-380.

[12]Cornfield A H. Ammonia released on treating soils with N sodium hydroxide as a possible means of predicting the nitrogen-supplying power of soils[J]. Nature，1960，187：260-261.

[13]Gyaneshwar P，Kumar G N，Parekh L J，et al. Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants[M]//Food security in nutrient-stressed environments：exploiting plants genetic capabilities. Netherlands：Springer，2002.

[14]Caporaso J G，Kuczynski J，Stombaugh J，et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nature Methods，2010，7（5）：335-336.

[15]Edgar R C，Haas B J，Clemente J C，et al. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection[J]. Bioinformatics，2011，27（16）：2194-2200.

[16]Pruesse E，Quast C，Knittel K，et al. SILVA：a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB[J]. Nucleic Acids Research，2007，35（21）：7188-7196.

[17]R Development Core Team. R：a language and environment for statistical computing[M]. Vienna：the R Foundation for Statistical Computing，2012.

[18]李蘭君，劉玳含，劉建斌，等. 連作對設(shè)施番茄土壤微生物及酶活性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2018，46（18）：130-134.

[19]王 濤，喬衛(wèi)花，李玉奇，等. 輪作和微生物菌肥對黃瓜連作土壤理化性狀及生物活性的影響[J]. 土壤通報，2011，42（3）：578-583.

[20]Kolton M，Graber E，Tsehansky L，et al. Biochar-stimulated plant performance is strongly linked to microbial diversity and metabolic potential in the rhizosphere[J]. The New Phytologist，2017，213（3）：1393-1404.

[21]Qiu M H，Zhang R F，Xue C，et al. Application of bio-organic fertilizer can control Fusarium wilt of cucumber plants by regulating microbial community of rhizosphere soil[J]. Biology and Fertility of Soils，2012，48（7）：807-816.

[22]Zhen Z，Liu H T，Wang N，et al. Effects of manure compost application on soil microbial community diversity and soil microenvironments in a temperate cropland in China[J]. PLoS One，2014，9（10）：e108555.

[23]Fierer N，Bradford M A，Jackson R B. Toward an ecological classification of soil bacteria[J]. Ecology，2007，88（6）：1354-1364.

[24]Zhang Y C，Wang X，Liu B J，et al. Comparative study of individual and co-application of biochar and wood vinegar on blueberry fruit yield and nutritional quality[J]. Chemosphere，2020，246：125699.

[25]方 明，李 潔，賴 欣，等. 短期生物炭刺激對紅壤和潮土微生物群落的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2020，48（11）：250-258.

[26]任靈玲. 長期施肥棕壤中氮代謝功能基因的變化特征[D]. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學，2019.

[27]Welsh A，Chee-Sanford J C，Connor L M，et al. Refined NrfA phylogeny improves PCR-based nrfA gene detection[J]. Applied and Environmental Microbiology，2014，80（7）：2110-2119.

[28]陳 晨，許 欣，畢智超，等. 生物炭和有機肥對菜地土壤N2O排放及硝化、反硝化微生物功能基因豐度的影響[J]. 環(huán)境科學學報，2017，37（5）：1912-1920.

[29]Yin C，F(xiàn)an F L，Song A L，et al. Different denitrification potential of aquic brown soil in Northeast China under inorganic and organic fertilization accompanied by distinct changes of nirS-and nirK-denitrifying bacterial community[J]. European Journal of Soil Biology，2014，65：47-56.