復合氨基酸鋅、鐵螯合物的制備及抗菌和抗氧化性研究

蘇永成，丁志雯，武波飛，陳靜雯，張唯，張弘彧，房耀維 ，2，劉姝，2*

（1.江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222000）

氨基酸是生物體內大量存在的，同時具有氨基和羧基的雙官能團生命小分子配體，是構成生物體內蛋白質、酶的基本結構單元，能夠為生物體提供生長發(fā)育所需要的養(yǎng)分[1-2]。同時氨基酸也是一種具有氨基與羧基的天然小分子有機酸，具有多種特殊官能基團和多樣的結構，因此氨基酸在精細化工、醫(yī)藥、食品等領域有著廣泛的應用。鋅主要參與生物的生長、繁殖、免疫、發(fā)育、激素合成及機體的新陳代謝等，是保證組織、器官和系統(tǒng)正常功能的重要的微量元素[3-4]。鐵是血紅蛋白合成和維持機體正常生理機能所必需的微量元素。人體內缺乏鋅和鐵元素，會影響腦垂體和腎上腺的內分泌平衡，導致發(fā)育停滯、智力發(fā)育不良、貧血等病癥[5]。氨基酸螯合物是指利用金屬陽離子與氨基酸進行反應并形成配位鍵，并且金屬陽離子與氨基端和羧基端形成五元環(huán)或六元環(huán)等特殊的環(huán)狀分子結構，使得整個環(huán)狀分子內趨于電中性[6]。氨基酸鋅和氨基酸鐵作為人和動物的鋅、鐵補充劑，生物利用率高，在補充的鋅、鐵的同時還能補充氨基酸，因此，廣泛用于人體的鋅、鐵營養(yǎng)強化劑和飼料添加劑[7]。另外，氨基酸鋅和氨基酸鐵具有抗氧化和抗菌活性，用于食品的保鮮，延長食品的貨架期[8]。

水果和蔬菜采收后，由于微生物導致的腐敗而造成了巨大損失。目前，我國果蔬的腐爛損失率在20%左右[9]。使用抗生素和化學保鮮劑可顯著延長果蔬貨架期，但是存在高殘留、不易降解、導致細菌耐藥增加、危害公共衛(wèi)生安全等問題[10]。氨基酸鋅和氨基酸鐵綠色安全，在具有食品保鮮功能的同時，又具有營養(yǎng)強化功能，在果蔬保鮮方面極具應用潛力[11]。目前果蔬保鮮常采用涂膜保鮮，在果蔬表面形成一層薄膜，可以阻止微生物對果蔬的侵害，降低果蔬呼吸強度，延緩果蔬的生理代謝活動和營養(yǎng)的損失，達到延長果蔬貨架期的目的。但是，目前對復合氨基酸鋅和氨基酸鐵的抗菌活性和抗氧化活性的系統(tǒng)研究尚鮮有報道。

本研究以人體必需8種氨基酸作為配體，采用水體系合成法制備復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵，水體系合成法是螯合方法中最常用的一種方法，其螯合工藝一般為：氨基酸+金屬鹽→溶解→調節(jié)pH值→螯合→過濾→濾渣干燥→產品。并測定復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵對引起果蔬腐敗中常見細菌、酵母菌和霉菌的抗菌活性和DPPH·、O2-·、·OH的清除能力，為復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵作為果蔬保鮮劑的應用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus AS1.1846）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus AS1.2465）、大腸桿菌（Escherichia coli AS1.487）、黑曲霉（Aspergillus niger AS3.350）、釀酒酵母（Sacc haromyces cerevisiaeAS2.114）、擴展青霉（Penicillium expansum AS3.3703）：中國普通微生物菌種保藏中心；黃曲霉（Asper-gillus flavus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis AS1.140）：南京農業(yè)大學食品科技學院實驗室保藏；長形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus macroides）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、魯氏結合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）：江蘇海洋大學海洋微生物酶工程研究室分離保藏。

復合氨基酸（L-賴氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸）：上海易恩化學技術有限公司；七水合硫酸鋅、七水合硫酸亞鐵、氫氧化鈉、無水乙醇、冰乙酸（均為分析純）：南京化學試劑股份有限公司；DPPH試劑：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；抗壞血酸：國藥集團化學試劑有限公司；羥基自由基試劑盒、超氧陰離子自由基試劑盒：南京建成生物工程研究所。

LB 培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.0，121 ℃ 滅菌 20 min；PD 培養(yǎng)基（1 L）：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH值，121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

DHG-9245A型鼓風干燥箱：上海易研實驗設備有限公司；iMark型酶標儀：伯樂生命醫(yī)學產品（上海）有限公司；DK-80型電熱恒溫水槽、THZ-103B型恒溫培養(yǎng)搖床：上海一恒科學儀器有限公司；T6新世紀紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；AA240FS原子吸收分光光度計：美國瓦里安公司。

1.3 方法

1.3.1 復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵的制備

復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵制備工藝參考文獻[12-14]等報道的制備方法并加以改進。分別稱取適量復合氨基酸（L-賴氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸，復合氨基酸濃度為0.1 mol/L），加入到蒸餾水中，加熱攪拌使其完全溶解，得到飽和溶液。按照摩爾比2∶1與硫酸鋅或者硫酸鐵（濃度為0.05 mol/L）混合，用6 mol/L氫氧化鈉或1 mol/L硫酸調節(jié)溶液酸堿度，pH7.0～7.5，在75℃水浴下螯合1 h。5 000 r/min離心10 min后，收集沉淀。采用有機溶劑沉淀法分離螯合物，按照螯合濃縮液∶有機溶劑1∶10的體積比加入無水乙醇，5 000 r/min離心10 min后收集沉淀，在60℃干燥箱中烘干，得到復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵。

1.3.2 鋅、鐵元素的測定

配制不同濃度的鋅和鐵標準溶液，將鋅和鐵標準溶液按照質量濃度由低到高的順序分別導入火焰原子化器，制作標準曲線；將復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵溶解，將空白溶液、復合氨基酸鋅溶液和復合氨基酸鐵溶液分別導入火焰原子化器，測得金屬離子的含量[15]。螯合率計算公式如下。

螯合率/%=（螯合態(tài)金屬離子含量/金屬離子總含量）×100

1.3.3 菌懸液的制備

將受試菌進行斜面活化后，用接種環(huán)挑取菌體，通過無菌生理鹽水稀釋，調整菌液濃度為1×107cfu/mL。

1.3.4 復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵抗菌活性的測定

參照Dubey等[16]所述的試管二倍稀釋法，稍作修改，進行各受試樣品最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定。樣品為復合氨基酸、復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵，在無菌操作臺中對試管按1～8號依次編號，首先在每支試管中加入3 mL無菌LB或PD液體培養(yǎng)基，在1號管加入3 mL樣品溶液，充分混勻后吸取3 mL加入2號管中混勻，按照此法依次稀釋到6號管，棄去6號管溶液3 mL，此時各試管中樣品濃度依次為 2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25、0.078 125 mg/mL，接下來每個試管依次加入菌懸液0.1 mL。7號管加入0.1 mL菌懸液，不加樣品液作為陽性對照管。8號管不加樣品液也不加菌懸液作為陰性對照管。細菌37℃振蕩培養(yǎng)1 d，酵母菌30℃振蕩培養(yǎng)1 d，霉菌28℃振蕩培養(yǎng)2 d。每一濃度梯度做3組平行試驗，以陽性對照管液體渾濁、陰性對照管液體澄清為標準，觀察試管液體是否為透明。再利用酶標儀在600 nm波長下檢測細菌和酵母菌在不同濃度梯度樣品中的生長情況，綜合肉眼觀察得到的結果，最終判定MIC。

1.3.5 復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵抗氧化性的測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測定

采用DPPH比色法進行測定[17-18]。樣品為復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵，取離心管3支，編號1～3，1號管加2 mL樣品溶液和2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，振蕩混勻后，暗處、室溫25℃條件下靜置反應30 min，測OD517，記作A1；2號管加2 mL樣品溶液和2 mL無水乙醇混勻，測OD517，記作A2；3號管加2 mL無水乙醇和2 mL 0.1 mmol/L DPPH 溶液混勻，測OD517，記作A3。以不同質量濃度的VC水溶液作陽性對照，吸取不同濃度樣品溶液均按以上操作分別測定DPPH自由基清除能力。自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A3]×100。

1.3.5.2 超氧陰離子自由基（O2-·）和羥基自由基（·OH）的清除能力測定

吸取不同質量濃度的復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵溶液，采用羥基自由基試劑盒和超氧陰離子自由基試劑盒的方法，分別測定其自由基清除能力。計算自由基清除率[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 24.0軟件進行差異性顯著分析，利用Origin 2018軟件進行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結果與分析

2.1 復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵螯合率的測定

復合氨基酸鋅、復合氨基酸鐵的螯合率見表1。

表1 復合氨基酸鋅、復合氨基酸鐵的螯合率Table 1 Chelation rates of compound amino acid zinc and compound amino acid iron

由表1可知，復合氨基酸鋅中鋅含量占12.83%，螯合率為81.27%。復合氨基酸鐵中鐵含量為11.29%，螯合率為68.19%。周燕芳等[20]報道使用中性蛋白酶對魚蛋白粉進行酶解，以酶解后得到的氨基酸與鋅離子標準溶液螯合制備復合氨基酸鋅，所得螯合率為83.58%。也有報道以花生粕為原料制備復合氨基酸螯合鋅，螯合率83.46%[21]。廉宜君等[22]利用棉籽粕復合氨基酸與氯化亞鐵進行螯合制備復合氨基酸鐵螯合物，螯合率為73.76%。螯合率的不同可能是因為氨基酸與金屬離子配位比、體系pH值、螯合反應溫度及時間等因素有關。

2.2 復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵抗菌活性的測定分析

通過試管二倍稀釋法測定了復合氨基酸、復合氨基酸鋅、復合氨基酸鐵對細菌、酵母菌和霉菌的MIC，結果見表2。

表2 復合氨基酸、復合氨基酸鋅、復合氨基酸鐵的MIC值Table 2 MIC values of compound amino acid，compound amino acid zinc and compound amino acid iron

由表2可知，復合氨基酸對供試菌無顯著抗菌作用。復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵對B.subtilis、S.aureus均有較好的抗菌效果，MIC均為0.313 mg/mL，二者 對 L.macroides、B.cereus、P.aeruginosa、E.coli、Z.rouxii、S.cerevisiae的 MIC均為 0.625 mg/mL。對 A.flavus、P.expansum、A.niger無顯著抗菌作用。吳菁[23]研究發(fā)現(xiàn)復合氨基酸鐵、復合氨基酸鋅對S.aureus、E.coli的生長有抑制作用，對S.aureus的MIC分別為0.25、0.25 mg/mL，對E.coli的 MIC分別為0.5、0.5 mg/mL。對S.aureus、E.coli的MIC與本文研究結果相比略低，這可能是因為不同螯合物中鋅、鐵含量不同導致的結果。龔毅等[24]研究報道甘氨酸鋅、蘇氨酸鋅、蛋氨酸鋅和賴氨酸鋅對E.coli、B.subtilis、S.aureus具有抗菌活性。甘氨酸鋅、蘇氨酸鋅、蛋氨酸鋅和賴氨酸鋅對E.coli的MIC 分別為 0.176、0.253、0.272、0.373 mg/mL，對B.subtilis的 MIC 分別為 0.176、0.253、0.272、0.373 mg/mL，對S.aureus的MIC分別為0.176、0.253、0.272、0.373mg/mL。

2.3 復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵對DPPH自由基清除能力

復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵對DPPH自由基清除能力結果見圖1。

圖1 復合氨基酸鋅、復合氨基酸鐵對DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rates of compound amino acid zinc and iron on DPPH radical

由圖1可以看出，復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵對DPPH自由基清除率隨著濃度的增加而增大。質量濃度在0.5 mg/mL～2.5 mg/mL時，復合氨基酸鋅對DPPH自由基清除率由5.79%提高到34.52%，復合氨基酸鐵對DPPH自由基的清除率由3.75%提高到30.46%。

2.4 復合氨基酸鋅、復合氨基酸鐵對超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除能力

復合氨基酸鋅、復合氨基酸鐵對超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除能力結果見圖2和圖3。

圖2 復合氨基酸鋅、復合氨基酸鐵對超氧陰離子自由基的清除率Fig.2 Scavenging rates of compound amino acid zinc and iron on superoxide radical

圖3 復合氨基酸鋅、復合氨基酸鐵對羥基自由基的清除率Fig.3 Scavenging rates of compound amino acid zinc and iron on hydroxyl radical

由圖2和圖3可知，復合氨基酸鋅、復合氨基酸鐵對超氧陰離子自由基和羥基自由基有一定的清除能力，質量濃度在0.5 mg/mL～2.5 mg/mL范圍內，其清除能力逐漸增強。質量濃度為2.5 mg/mL時，復合氨基酸鋅對超氧陰離子自由基和羥基自由基清除率達到23.93%和22.36%，復合氨基酸鐵對超氧陰離子自由基和羥基自由基清除率達到20.63%和20.05%，與VC比較而言，復合氨基酸鋅、復合氨基酸鐵對超氧陰離子自由基和羥基自由基清除能力相對較弱。

3 結論

本研究制備了復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵，螯合率分別達到81.27%和68.19%。測定了復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵對供試細菌、酵母菌和霉菌的抗菌活性，復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵對細菌和酵母菌具有抗菌活性，其中對B.subtilis、S.aureus的抑制作用最明顯，MIC均為0.313 mg/mL，而對霉菌的抗菌作用不顯著。復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基均具清除作用，對DPPH自由基的清除作用最好，復合氨基酸鋅和復合氨基酸鐵的抗氧化能力弱于VC。