黃珍金，呂蕾，黃桂東，2，3，4，鐘先鋒，3，4，5*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231；2.廣東省傳統(tǒng)發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；3.廣東省食品流通安全控制工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；4.佛山市釀造工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；5.佛山農(nóng)業(yè)生物制造工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231）

人體腸道是個(gè)復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)。約有1 000種以上的細(xì)菌存在，有益菌和有害菌群之間的生態(tài)平衡直接影響宿主的健康[1-2]?！兑嫔目茖W(xué)共識(shí)（2020年版）》[3]指出益生菌可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道內(nèi)的菌群比例改善人體腸道健康。益生菌的“食物”稱(chēng)為益生元（prebiotics），它是一種被廣泛認(rèn)可的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有促進(jìn)腸道有益菌生長(zhǎng)從而形成有利的菌落結(jié)構(gòu)的功能[4-6]，益生元的概念最早由Giboson和Robefroid在1995年提出[7]，常見(jiàn)的益生元有低聚果糖、大豆低聚糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、低聚半乳糖以及水蘇糖等[8]。水蘇糖與普通益生元相比，能夠更高效地促進(jìn)腸道雙歧桿菌等有益菌的增殖[9]，被譽(yù)為“超強(qiáng)雙歧因子”，是近年來(lái)較熱門(mén)的腸道功能食品原料[10]。水蘇糖的分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，棉籽低聚糖家族的結(jié)構(gòu)關(guān)系見(jiàn)圖2。

圖1 水蘇糖的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of stachyose

圖2 棉籽低聚糖家族的結(jié)構(gòu)關(guān)系Fig.2 Strutural relationships of the raffinose oligosaccharides

水蘇糖是一種天然存在的四糖，屬于棉籽糖屬半乳糖苷類(lèi)非還原性功能低聚糖[11-12]，純品為白色粉末，微甜，甜度為蔗糖的22%[13]。水蘇糖的分子式為：C24H42O21，分子結(jié)構(gòu)為：半乳糖-半乳糖-葡萄糖-果糖（如圖1所示），是典型的棉籽低聚糖家庭成員[14-15]（如圖2所示），主要存在于唇形科水蘇屬植物中。近年來(lái)，水蘇糖的生理功能不斷被挖掘，目前已報(bào)道的功能有：機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、改善排便、預(yù)防化學(xué)性肝損傷、合成維生素B族、促進(jìn)腸道吸收微量元素、預(yù)防糖尿病等[16-21]。

水蘇糖被廣泛應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域[22]。國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求量不斷增大，具有廣闊的應(yīng)用前景，但由于缺乏高效的生產(chǎn)方法，導(dǎo)致高純度水蘇糖的造價(jià)昂貴，限制其應(yīng)用的發(fā)展，因此，探索出一個(gè)快速、高效、低成本的生產(chǎn)高純度水蘇糖的方法具有重要意義。

水蘇糖的制備主要分為提取和純化兩個(gè)階段。本文基于目前水蘇糖制備工藝的發(fā)展現(xiàn)狀，從水蘇糖的提取工藝及純化工藝兩方面的研究進(jìn)展作以綜述，討論不同制備工藝的優(yōu)劣性，以期為工業(yè)化生產(chǎn)水蘇糖的相關(guān)研究工作提供參考。

1 水蘇糖的制備概況

近年來(lái)，研究水蘇糖制備工藝的成果多達(dá)千余項(xiàng)，成果中涉及到的原料、方法以及提取效果不盡相同。目前國(guó)際市場(chǎng)上10余種低聚糖中，除大豆低聚糖、棉籽糖外，其余低聚糖主要采取酶法制備[23]，因酶法制備水蘇糖的成本較高，得率較低[24]，所以從天然植物中提取水蘇糖是目前制備水蘇糖的主流方法，更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。可作為提取水蘇糖的植物原料有：地黃、丹參、銀條（又稱(chēng)草石蠶）、澤蘭、大豆等[25-27]。傳統(tǒng)水蘇糖制備工藝流程見(jiàn)圖3。

圖3 傳統(tǒng)水蘇糖制備工藝流程Fig.3 Traditional preparation process of stachyose

如圖3所示，傳統(tǒng)的制備工藝流程是將植物原料經(jīng)浸提、脫色、脫鹽、干燥等操作后，得到水蘇糖提取物，在此基礎(chǔ)上，研究人員結(jié)合生物、物理、化學(xué)等技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件，以提高水蘇糖純度。常見(jiàn)的水蘇糖提取工藝主要分為三大類(lèi)型：溶液提取法、微生物發(fā)酵法、酶解提取法，常見(jiàn)的純化方法有膜分離法、柱層析純化法、結(jié)晶法等。

近期，Gerliani等[28]利用電活化技術(shù)結(jié)合植物酸堿溶液，提取大豆粉中的蛋白質(zhì)、可溶性碳水化合物和礦物質(zhì)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，獲得的分析物和催化物樣本中存在一定量的水蘇糖和棉籽糖，且它們的含量在一定電壓范圍內(nèi)，隨著陽(yáng)極液電壓的升高而增加，最高分別達(dá)到222.49 mg/g和34.29 mg/g，該試驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)可能為水蘇糖的提取提供新的技術(shù)研究方向。

2 水蘇糖的提取工藝研究進(jìn)展

2.1 溶液提取法

溶劑提取法是最傳統(tǒng)的提取方法，常用于提取天然植物中的有效成分。根據(jù)相似相溶的原理，選擇對(duì)提取物溶解度大的溶劑將其從溶解度小的溶劑中提取出來(lái)。常用于提取水蘇糖的溶劑是水和乙醇，根據(jù)不同的研究目的，來(lái)選擇適當(dāng)?shù)奶崛∫?、提取原料、提取工藝?/p>

2.1.1 單一提取法

以水作為提取溶劑時(shí)，提取成本低，且水對(duì)植物細(xì)胞的穿透性強(qiáng)。張敏等[29]以去離子水作為溶劑，提取地黃中的水蘇糖，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)探究最佳的提取條件，最終在浸提溫度為50°C的條件下，料液比 1∶12（kg/L），浸提時(shí)間 60 min為最佳，水蘇糖的提取率為58.84%。更多的研究人員選擇以草石蠶作為原料，因草石蠶中的水蘇糖含量高[30]，且其具有質(zhì)脆、含水量高的質(zhì)構(gòu)特點(diǎn)，姚紅等[31]采用鮮品勻漿法，利用機(jī)械和液力剪切將鮮草石蠶磨成漿，使有效成分流出，更有利于水蘇糖的提取，最終水蘇糖提取率達(dá)91.62%。經(jīng)過(guò)多步純化后，獲得純度達(dá)96.10%的水蘇糖粉末，該研究提取純度高、成本低，可望為工業(yè)化制備高純度水蘇糖提供參考，但以水作為提取液時(shí)，水質(zhì)易發(fā)霉變質(zhì)，不易保存。

以乙醇作為提取劑時(shí)，具有滲透性強(qiáng)、相對(duì)水提取液而言保存期更長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，但不同濃度的乙醇對(duì)提取出的成分影響較大，Zhong等[32]在提取銀條中的水蘇糖時(shí)，采用響應(yīng)面法探究不同因素對(duì)水蘇糖提取影響的大小，最終結(jié)果表明，影響大小為料液比＞乙醇體積比＞提取溫度＞提取時(shí)間，所以以乙醇作為提取液的關(guān)鍵是要探究并把控好最佳的乙醇提取濃度。

2.1.2 輔助提取法

單一的水提或醇提法，提取水蘇糖的效率不高且雜質(zhì)多，通常需要結(jié)合一些輔助技術(shù)提取。輔助提取法是指通過(guò)物理或生物技術(shù)輔助溶液提取的方法，例如借助超聲波、微波、超高壓等輔助技術(shù)，輔助技術(shù)是在單一提取法的基礎(chǔ)上，在浸出提取物環(huán)節(jié)加以輔助，后續(xù)經(jīng)過(guò)離心、上清液除雜精制等步驟，與圖3所示流程類(lèi)似，具體操作根據(jù)實(shí)際產(chǎn)生雜質(zhì)的性質(zhì)而定。利用輔助技術(shù)提取，可明顯促進(jìn)植物有效成分的流出[33-35]。

超聲波輔助提取實(shí)際上是利用超聲波具有空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)的特點(diǎn)，加快分子的運(yùn)動(dòng)速度和增大介質(zhì)的穿透力，達(dá)到加快有效成分溶出的目的[36]。王啟為等[37]利用超聲波輔助水提法提取草石蠶中的水蘇糖，結(jié)果表明，對(duì)提取率影響從大到小為提取時(shí)間＞超聲波功率＞提取溫度；胡斌杰等[38]的研究發(fā)現(xiàn)，在超聲波技術(shù)的輔助下，水提法的提取時(shí)間可縮短3/4，多糖提取率提高30.00%。但超聲波技術(shù)需要控制好超聲時(shí)間，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)，使糖鏈斷裂，導(dǎo)致提取率降低。

微波法輔助的原理是利用細(xì)胞內(nèi)的極性物質(zhì)，吸收并轉(zhuǎn)化微波能為熱能，使胞內(nèi)溫度快速上升，水分氣化，增大胞內(nèi)壓力，從而沖破細(xì)胞膜和細(xì)胞壁形成裂縫或孔洞，進(jìn)而加速胞外提取劑進(jìn)入胞內(nèi)，溶解有效物質(zhì)然后流出胞外。陳傳云等[39]發(fā)明了一種利用微波輔助提取水蘇糖的方法，從50 kg新鮮草石蠶中，獲得15 kg水蘇糖，水蘇糖的純度為90.02%，該方法具有提取時(shí)間短，效率高的特點(diǎn)。微波輔助法的使用前提是，被處理的物料需具有良好吸水性，且產(chǎn)物熱穩(wěn)定性良好。

超高壓輔助提取天然植物中的生物活性成分是一項(xiàng)新興技術(shù)。該技術(shù)可以有效地加快傳質(zhì)速率、植物細(xì)胞破裂以提高提取率，縮短處理時(shí)間、減少溶劑消耗。Wu等[40]采用高壓輔助提取法從灰樹(shù)花菌絲體中提取多糖和β-葡聚糖，與常規(guī)搖晃浸泡的提取液相比，高壓處理過(guò)的提取液中，多糖含量更高且活性更強(qiáng)。

汽爆輔助法是利用高溫高壓-瞬時(shí)泄壓的方法，使?jié)B進(jìn)植物組織內(nèi)部的蒸汽分子的內(nèi)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，破壞生物質(zhì)組織細(xì)胞層間，從而使細(xì)胞內(nèi)容物加速流出[41]。與微波輔助法原理相似，均是利用物理壓強(qiáng)變化促進(jìn)提取物的溶出，避免了化學(xué)處理導(dǎo)致的二次污染，具有低成本、無(wú)污染的特點(diǎn)。洪楓等[41]利用汽爆技術(shù)從玉米秸桿中提取木低聚糖，試驗(yàn)表明，汽爆液中的糖類(lèi)主要是低聚糖及一些可溶性聚糖，在1.60 MPa和2.00 MPa蒸汽壓下維壓5 min，最終低聚糖得率為36.00%～59.00%。該方法目前沒(méi)有應(yīng)用于水蘇糖的制備，但木低聚糖與水蘇糖結(jié)構(gòu)功能相似，具有可參比性，且水蘇糖熱穩(wěn)定性好，汽爆法可能成為輔助提取水蘇糖的新途徑。

2.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵是目前最經(jīng)濟(jì)的提純水蘇糖的方法，近年來(lái)，以微生物發(fā)酵法制備水蘇糖的研究不斷涌現(xiàn)，微生物發(fā)酵法是利用微生物選擇性地消耗某些糖類(lèi)，以此作為代謝繁殖的生長(zhǎng)源，該方法具有優(yōu)先消耗非功能性低聚糖的特點(diǎn)，從而提高目標(biāo)成分的功能性低聚糖純度。微生物發(fā)酵法的關(guān)鍵在于控制影響微生物生長(zhǎng)代謝的因素[42]，例如，微生物的種類(lèi)及數(shù)量（純種或混菌）、酶活性、發(fā)酵環(huán)境（溫度、氧氣、pH值等）等。

2.2.1 微生物種類(lèi)及數(shù)量

研究分析某種微生物的發(fā)酵特性，將其合理運(yùn)用，可有效提高目的產(chǎn)物的純度[43]。王智榮[44]探究了乳酸菌、3種酵母、米曲霉和裂褶菌等菌株發(fā)酵提純水蘇糖的效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，其中米曲霉和裂褶菌適合作為水蘇糖發(fā)酵提純菌株，以裂褶菌效果最佳：裂褶菌經(jīng)48 h發(fā)酵后，水蘇糖保留率為93.31%，占總糖含量的87.04%。舒丹陽(yáng)等[45]的試驗(yàn)記錄了黑曲霉、米曲霉、干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌、鼠李糖乳桿菌這5種不同的菌株對(duì)草石蠶中單、雙糖及水蘇糖的降解情況，為初步探索微生物發(fā)酵制備水蘇糖的領(lǐng)域提供選菌參考依據(jù)。

在發(fā)酵食品和酶制劑行業(yè)中，多菌混合發(fā)酵效果比純種發(fā)酵更佳[46]。混合發(fā)酵具有多菌共生、酶系互補(bǔ)、相輔相成的優(yōu)點(diǎn)，可以克服純種發(fā)酵中間產(chǎn)物濃度過(guò)大的問(wèn)題。將混菌發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用到提純水蘇糖的研究中，可有效提高提純水蘇糖的效率。王雪等[47]利用日本曲霉與乳酸菌的混菌組合發(fā)酵提純銀條中的水蘇糖，結(jié)果表明，經(jīng)混菌發(fā)酵后，提取液中的蔗糖及單糖組分比純種發(fā)酵有所降低，蔗糖及單糖的總量降至3.00%，水蘇糖保留率在95.00%以上，占總糖含量的90.00%，結(jié)合工業(yè)色譜分離技術(shù)進(jìn)一步純化水蘇糖，最終獲得水蘇糖純度為90.00%～95.00%（占總糖），該方法已被國(guó)內(nèi)多個(gè)著名企業(yè)應(yīng)用。

2.2.2 酶活性

酶是微生物發(fā)酵的重要影響因素之一，可以通過(guò)添加促進(jìn)單、雙糖消耗，或抑制水蘇糖降解的酶抑制劑，以快速提高水蘇糖的純度，縮短提取時(shí)間。周文斯等[48]以草石蠶為原料，探究了乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）和抗壞血酸（ascorbic acid/Vitamin C，VC）這 2 種蔗糖酶抑制劑對(duì)黑曲霉發(fā)酵提純水蘇糖的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)添加適量的蔗糖酶抑制劑可以有效降低水蘇糖被蔗糖酶降解的概率，從而提高水蘇糖含量。其中EDTA-2Na對(duì)蔗糖酶的抑制效果更優(yōu)于VC。該研究通過(guò)單因素試驗(yàn)，探究出最佳的EDTA-2Na添加量為提取液質(zhì)量的0.01%，在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，最終獲得水蘇糖的純度為80.43%。

2.2.3 發(fā)酵環(huán)境

微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中，發(fā)酵環(huán)境所提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量直接影響目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成效率和質(zhì)量，所以需要對(duì)所選菌種的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行探究。謝瑾[49]的研究中，較全面地探究了影響微生物發(fā)酵的條件。在該研究中，以0.01%黑曲霉和0.01%乳酸菌作為最佳混菌發(fā)酵組合，試驗(yàn)結(jié)果顯示發(fā)酵36 h后，同步發(fā)酵組的水蘇糖保留率比滯后發(fā)酵組高出10.12%，因?yàn)槲⑸镏g存在協(xié)同作用，所以同步發(fā)酵比滯后發(fā)酵更有利于提高提取液中水蘇糖純度；發(fā)酵液pH值在5.5～7.0，有利于減緩水蘇糖的降解且不影響微生物消耗蔗糖；與靜置發(fā)酵相比，搖床發(fā)酵可以提供更多氧氣供微生物代謝，提高反應(yīng)效率；帶渣發(fā)酵比過(guò)濾發(fā)酵提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更全面，微生物生長(zhǎng)更協(xié)調(diào)。

因此得知，微生物發(fā)酵提純水蘇糖具有生產(chǎn)成本低、工藝簡(jiǎn)單，但產(chǎn)物成分較復(fù)雜、產(chǎn)物質(zhì)量受到多方面因素影響等特點(diǎn)。

2.3 酶解提取法

酶解提取法是利用酶催化分解植物細(xì)胞的細(xì)胞壁成分，使得細(xì)胞壁破裂，胞內(nèi)物質(zhì)溶出，從而達(dá)到提取目的的一種方法。常用作提取水蘇糖的酶有果膠酶和纖維素酶，以及復(fù)合酶。鐘先鋒等[50]于2019年獲得授權(quán)的發(fā)明專(zhuān)利“一種從銀條中提取高純度水蘇糖的方法”，該方法利用木瓜蛋白酶和植物復(fù)合酶結(jié)合醇提法，經(jīng)過(guò)一系列除雜、精制工藝后獲得純度為95.00%～99.90%的水蘇糖，可見(jiàn)酶提取法具有物料成本低，工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和提取率高等優(yōu)點(diǎn)。但也具有一定的局限性，主要原因是影響酶活性的因素較多，例如溫度和pH值等，若要使得酶活性達(dá)到最高，其最佳反應(yīng)條件都在一個(gè)很小的范圍內(nèi)，需要精確把控，否則酶活性大大降低，影響提取效果。各種提取方法的比較見(jiàn)表1。

表1 各種提取方法的比較Table 1 Comparison of various extraction methods

3 水蘇糖的純化工藝研究進(jìn)展

3.1 膜分離法

水蘇糖經(jīng)粗提后，提取液中存在許多雜質(zhì)，主要有蛋白質(zhì)、色素、鹽類(lèi)、氨基酸等，膜分離法需要根據(jù)雜質(zhì)性質(zhì)，選擇除雜效果好、可回收的濾膜。

膜分離法的原理是利用膜的選擇透過(guò)性，實(shí)現(xiàn)不同物質(zhì)的分離與純化。研究中常見(jiàn)的分離膜有超濾膜、反滲透膜、納濾膜、電滲析膜等。其中超濾膜、納濾膜、反滲透膜都屬于過(guò)濾膜，超濾膜的孔徑在1 nm～300 nm，可用于截留一些生物大分子和膠狀物；納濾膜可截留相對(duì)分子量在300～1 000的物質(zhì)；反滲透膜的原理是通過(guò)向高濃度一端施加一定的壓力，在膜兩側(cè)形成壓力差，使得溶劑分子從高濃度向低濃度一端轉(zhuǎn)移。張敏等[29]以去離子水作為溶劑，提取地黃中的水蘇糖，結(jié)合納濾膜及反滲透膜技術(shù)進(jìn)行純化。試驗(yàn)中使用到的納濾膜和反滲透膜經(jīng)過(guò)清理后可反復(fù)利用，它們的膜通透恢復(fù)率分別為95.52%、97.22%。

電滲析膜實(shí)質(zhì)上是一種帶電離子交換膜[51]。電滲析膜設(shè)在溶液電場(chǎng)的陰陽(yáng)極之間，當(dāng)電場(chǎng)運(yùn)作時(shí)，溶液中的陰陽(yáng)離子定向運(yùn)動(dòng)，通過(guò)具有離子選擇性的電滲析膜，從而實(shí)現(xiàn)去除某些帶電離子的作用。電滲析膜的脫鹽效率高，因此常用于工業(yè)化脫鹽，如海水淡化[52]、廢水處理[53]等。在食品工業(yè)中可應(yīng)用于去除無(wú)機(jī)鹽離子、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，段舒然等[54]利用電滲析法純化棉籽糖提取液，在該研究中他們探究了操作電壓和循環(huán)流量的變化對(duì)純化效果、能耗大小的影響。最終結(jié)果表明，脫鹽率最高可達(dá)到91.20%，棉籽糖回收率達(dá)94.50%。

3.2 柱層析純化法

柱層析法，又稱(chēng)色層法或色譜法，是科學(xué)試驗(yàn)中經(jīng)典的分離多組分混合物的方法，可用于物質(zhì)的定性、定量、純化操作。層析柱通常由固定相、流動(dòng)相兩部分組成，根據(jù)不同的柱內(nèi)填充物可以將其分很多類(lèi)，如碳-鈣色譜柱[55]、高效陰離子交換色譜柱[56]，N-苯基-苯基氨基-β-環(huán)糊精-粘結(jié)手性固定相-高效液相色譜[57]等。它們的工作原理相同，在樣品進(jìn)入柱子后，根據(jù)各組分在流動(dòng)相、固定相之間分配系數(shù)不同、固定相的吸附能力不同，使得各組分以不同速度向下遷移，按一定順序流出并收集，達(dá)到分離純化的目的。

當(dāng)柱層析法用于含量檢測(cè)時(shí)，常與質(zhì)譜法聯(lián)用，高效液相色譜法是檢測(cè)低聚糖含量較為準(zhǔn)確的方法[58]，該方法具有分析時(shí)間短、選擇性高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。Wang等[59]建立了一種同時(shí)測(cè)定地黃中環(huán)烯醚苷和低聚糖（蔗糖、蜜二糖、棉籽糖、甘露糖和水蘇糖）的方法。該研究利用親水性相互作用液相色譜法對(duì)7種分析物進(jìn)行快速分離，最后用三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)分析物進(jìn)行靈敏和選擇性檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有分析物的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，具有良好的線性，精密度偏差小于5.00%，回收率在93.80%～105.50%之間。

當(dāng)柱層析法用于純化水蘇糖時(shí)，常用的固定相填充物有樹(shù)脂、活性炭等。樹(shù)脂又分為離子交換樹(shù)脂、大孔吸附樹(shù)脂、凝膠型樹(shù)脂，其原理是利用樹(shù)脂的吸附作用將特定組分截留，然后進(jìn)行洗脫以達(dá)到樣品組分分離的目的，該方法具有脫鹽率高、脫色效果好、可自動(dòng)化進(jìn)行、重復(fù)循環(huán)使用等優(yōu)勢(shì)。離子交換樹(shù)脂和大孔吸附樹(shù)脂常用于去除水蘇糖提取液中鹽分、色素、蛋白質(zhì)、氨基酸等雜質(zhì)。謝瑾[49]在提取干基草石蠶中的水蘇糖研究中，利用D001型大孔強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和D301型大孔弱堿性陰離子交換樹(shù)脂在流速為3.77 BV/h，溫度為35℃時(shí)，蛋白質(zhì)洗脫率為93.70%，灰分洗脫率為97.81%，脫色率高達(dá)99.50%。劉聰?shù)萚60]利用HW-40C凝膠為固定相去除蛋白，純化棉籽糖。該研究在最佳工藝條件下，獲得純度達(dá)89.10%的棉籽糖，收率為64.80%。凝膠型樹(shù)脂具有分離效率高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，但需要注意的是，凝膠型樹(shù)脂孔隙較小，若提取液中含有較多色素時(shí)，應(yīng)先去除，否則凝膠樹(shù)脂易被色素大分子堵塞出現(xiàn)樹(shù)脂“中毒”現(xiàn)象。

活性炭屬于多孔介質(zhì)，其吸附疏水性有機(jī)物能力強(qiáng)，常用于脫色。其原理是利用靜電力將小分子有機(jī)物或疏水性分子，物理吸附在活性炭的微孔中，達(dá)到去除流動(dòng)相雜質(zhì)的目的。Bao等[61]利用活性炭吸附分離棉子糖和蔗糖，通過(guò)吸附-解吸循環(huán)，最終得到棉籽糖純度大于90.00%、回收率為79.20%。Bernal等[62]在濃度為5 g/L的諾利特粉末活性炭（norit powdered activated charcoal，NPAC），超濾跨膜壓力為 100 kPa，進(jìn)料流量為4.24 L/h，pH 3的條件下，對(duì)甜菜糖蜜進(jìn)行脫色處理，最終甜菜糖蜜的顏色降低了96.50%以上，該研究還用NaOH復(fù)原活性炭，其除色能力損失低于10.00%。

3.3 結(jié)晶法

結(jié)晶法的原理是根據(jù)不同物質(zhì)的結(jié)晶條件不同，將被提取物質(zhì)從飽和溶液中析出結(jié)晶，而其他雜質(zhì)依然留在溶液中，以此達(dá)到純化的目的。在水蘇糖制備研究領(lǐng)域中，張金澤等[63]以利用重結(jié)晶、活性炭吸附的方法純化水蘇糖，重結(jié)晶是指晶體的二次結(jié)晶，即將晶體溶解或熔融后，再?gòu)娜芤夯蛉垠w中結(jié)晶的過(guò)程，重結(jié)晶可以使物質(zhì)高度純化，用此方法制得的水蘇糖晶體純度高于99.00%，該方法于2016年獲得中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利授權(quán)。宋建民等[64]發(fā)明的“一種高純度水蘇糖的制備方法”是以草石蠶為原料，通過(guò)水提法、微生物發(fā)酵法、醇提法等多重提取方法，結(jié)合堿沉、過(guò)濾、活性炭脫色、冷卻結(jié)晶的純化方法獲得純度高于99.00%的水蘇糖晶體。結(jié)晶法純化水蘇糖具有產(chǎn)物純度高、溶劑環(huán)保、工藝簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，可用于水蘇糖商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品的制備，但自然冷卻結(jié)晶周期長(zhǎng)，效率低。3種純化方法的比較見(jiàn)表2。

表2 3種純化方法的比較Table 2 Comparison of various purification methods

4 總結(jié)和展望

水蘇糖較其他低聚糖，可以更有效地促進(jìn)腸道益生菌的生長(zhǎng)繁殖，應(yīng)用前景廣闊，水蘇糖的生產(chǎn)制備是目前較為熱門(mén)的研究方向，本文從提取工藝和純化工藝兩方面，綜述了制備水蘇糖的技術(shù)研究現(xiàn)狀。從經(jīng)濟(jì)效益層面來(lái)說(shuō)，微生物發(fā)酵法是目前最經(jīng)濟(jì)的水蘇糖提純方法，較適合工業(yè)化生產(chǎn)，其中混菌發(fā)酵優(yōu)于單菌發(fā)酵，且多菌同步發(fā)酵優(yōu)于滯后發(fā)酵，發(fā)酵環(huán)境的pH值根據(jù)不同的發(fā)酵菌而定，通常pH值在5.5～7.0為合適；搖床發(fā)酵優(yōu)于靜置發(fā)酵；帶渣發(fā)酵優(yōu)于過(guò)濾發(fā)酵。此外，還可以通過(guò)添加一些酶抑制劑調(diào)節(jié)提純速率，實(shí)現(xiàn)低成本、高效率地大批量生產(chǎn)水蘇糖。

但微生物發(fā)酵法存在產(chǎn)物雜質(zhì)多的缺點(diǎn)，需在后期精制過(guò)程中多步除雜。雖然我國(guó)在水蘇糖純化領(lǐng)域，部分工藝制備的水蘇糖純度已達(dá)到國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，可用于生產(chǎn)高純度的試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品，但是存在一定局限性。如膜分離法、柱層析純化法存在耗材成本高、處理量小的問(wèn)題；結(jié)晶法的時(shí)間成本與生產(chǎn)量成正比，與蒸發(fā)面積（場(chǎng)地面積）成反比，均不適合大規(guī)模純化水蘇糖。因此，建立一個(gè)高效、低成本的純化水蘇糖的方法，以應(yīng)用于工業(yè)化大批量生產(chǎn)，是水蘇糖加工應(yīng)用領(lǐng)域今后需要繼續(xù)研究探討的方向。