張倩

（1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)與新藥研發(fā)工程技術(shù)中心，廣東 廣州 510006）

黃茶是我國六大茶類之一[1]，屬輕發(fā)酵茶類，因其獨(dú)特的“悶黃”工藝而知名。黃茶中富含多種營養(yǎng)成分，比如茶多糖、茶多酚、甲基黃嘌呤類、氨基酸類和揮發(fā)性成分等[2-3]，近年來由于其具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂和護(hù)肝等豐富的保健療效[4-11]，逐漸引起了人們的關(guān)注。

對(duì)黃茶的研究主要集中在其加工工藝優(yōu)化和揮發(fā)性成分上[12-15]，對(duì)其保健功效的研究主要包括降脂、抗癌、抗氧化等。肖力爭(zhēng)[16]通過建立糖尿病大鼠模型并給予黃茶君山銀針，觀察相關(guān)指標(biāo)證明其可調(diào)節(jié)糖脂代謝。趙欣[17]通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR） 檢查Bax、Bcl-2 基因表達(dá)情況及 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI） 染色分析，得出黃茶對(duì)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞有較強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡的能力[17]。鄧瀟瀟等[18]通過動(dòng)物模型分析，研究表明一定濃度的黃茶對(duì)胃損傷有預(yù)防的效果。Andlauer W等[19]采用快速電流篩選法和化學(xué)發(fā)光法[測(cè)定鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）及DPPH·的清除作用]對(duì)黃茶的抗氧化活性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示黃茶提取物對(duì)體外氧化損傷具有較強(qiáng)的保護(hù)作用。Xu等[20]的研究發(fā)現(xiàn)黃茶的水提物和醇提物均具有較好的抗氧化效果。

黃茶中的多糖是一類重要的生物活性物質(zhì)，近年來，大量研究報(bào)道植物多糖可作為一種天然抗氧化劑來代替人工合成抗氧化劑，其通過清除體內(nèi)過量自由基以達(dá)到抗氧化的目的[21]。全吉淑等[22]研究發(fā)現(xiàn)茶多糖對(duì)ROO·、O2-·、·OH及H2O2均有清除作用。史敏等[23]對(duì)茶多糖通過抗氧化而延緩衰老的機(jī)制進(jìn)行了綜述，總結(jié)出茶多糖可通過清除活性自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、激活抗氧化防御系統(tǒng)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能達(dá)到延緩老化目的。

目前對(duì)黃茶多糖成分的提取分離和生物活性的研究相對(duì)較少。本文主要研究了黃茶多糖的提取工藝，并用常規(guī)抗氧化體系方法研究了黃茶多糖半純品體外清除 DPPH·、ABTS+·和羥自由基（·OH）的活性以及總還原力能力，以期為黃茶的藥理活性研究以及開發(fā)利用提供一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃茶（廣東大葉青）：廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；二乙胺基乙基纖維素 52（diethylaminoethyl cellulose52，DEAE-52）：美國通用電氣醫(yī)療公司；DPPH、ABTS、L-抗壞血酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其他相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LXJ-IIB型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；HL-2B恒流泵和BS-100自動(dòng)部分收集器：上海滬西分析儀器廠有限公司；JA5003N電子天平：上海菁海儀器有限公司；EYELAN-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本東京理化器械株式會(huì)社；FD-2型冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；1260高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃茶粗多糖的提取

取黃茶15 kg，加去離子水浸泡約12 h后于80℃下提取 3 次，3 h/次，其中料液比約為 1∶10（g/mL）。3 次提取后合并提取液，進(jìn)行減壓濃縮以減少溶劑體積，并將濃縮液進(jìn)行離心過濾（3 500 r/min，10 min），棄沉淀，取上清液，加入乙醇，不斷攪拌至乙醇濃度為70%，室溫（25±2）℃放置48 h，離心過濾后的沉淀物為黃茶70%乙醇醇沉部位的粗多糖P70。

1.3.2 黃茶粗多糖P70除蛋白

采用Sevag法除蛋白[24]。取一部分粗多糖P70用去離子水溶解后配制成水溶液和Sevag試劑（三氯甲烷∶正丁醇 =4∶1，體積比）按 5∶1 的體積比混合振搖，靜置分層。取上層清液，下層離心取上清液后與上層合并，再重復(fù)上述操作3次至下層蛋白質(zhì)絮狀物全部去除或近似全部去除。上清液經(jīng)減壓過濾后，于流動(dòng)水中用截留分子量為1 000 Da的透析袋透析48 h，然后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮以減少溶劑體積再進(jìn)行冷凍干燥，得脫蛋白后粗多糖P70的凍干粉末，命名為YT70。

1.3.3 黃茶粗多糖YT70的糖含量測(cè)定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱定10mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，以去離子水為溶劑，將其定容到100mL容量瓶。分別移取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 于容量瓶中，用去離子水配至2.0mL，加入6%苯酚溶液1.0mL，搖勻后加入濃硫酸5.0mL，充分搖均。將其置于室溫（25±2）℃下30min，使其充分反應(yīng)后，于紫外可見分光光度儀在490nm處測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值。

樣品溶液的制備：精密稱取凍干粉末YT70約5 mg，以去離子水為溶劑，將其定容到100 mL容量瓶。移取0.5 mL多糖溶液，用去離子水配至2.0 mL，加入6%苯酚溶液1.0 mL，混勻，加入5.0 mL濃硫酸，充分搖均。將其置于室溫（25±2）℃下30 min，使其充分反應(yīng)后，于紫外可見分光光度儀在490 nm處測(cè)定其吸光度值，并由所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算YT70的糖含量。

1.3.4 黃茶粗多糖YT70的分離純化

將所得黃茶粗多糖YT70用陰離子交換柱進(jìn)行分離。陰離子交換柱的填料選用DEAE-52，層析柱選用?2.5 cm×40 cm規(guī)格。稱取500 mg黃茶粗多糖YT70樣品溶于10mL去離子水中，于10000r/min下離心10 min，取上清液上樣，依次用 0、0.05、0.2 mol/L 的 NaCl溶液洗脫，用苯酚-硫酸法[25]將洗脫液顯色后，于紫外可見分光光度計(jì)在490 nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)其吸光度值，并繪制洗脫曲線，根據(jù)吸光度值收集洗脫液。將收集到的洗脫液通過減壓濃縮后，使用截留分子量為3 500 Da的透析袋于流動(dòng)水中透析24 h，再通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減少溶劑的體積后進(jìn)行冷凍干燥，得純化后黃茶多糖的凍干粉末，命名為YT70-1。

1.3.5 單糖組成分析

樣品的制備：精密稱取黃茶多糖凍干粉末YT70-1約5 mg，加入2 mol/L的TFA溶液2 mL后封口于120℃油浴反應(yīng)6 h，隨后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮至干，再加甲醇約3 mL使干燥物溶解后繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸干，重復(fù)上述操作3次后加1 mL去離子水溶解，取0.1 mL溶液于4 mL的試管中加入PMP-甲醇溶液200 μL及0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液200 μL，在70℃下水浴反應(yīng)30 min，冷卻至室溫（25±2）℃后加入 210 μL 0.3 mol/L的氯化氫溶液，用1 mL的氯仿萃取，振蕩均勻后10 000 r/min離心5 min。離心后取上層清液，重復(fù)操作3次。最后用0.45 μm的濾膜過濾，用于高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)。

混合標(biāo)準(zhǔn)單糖PMP衍生化：取9種標(biāo)準(zhǔn)單糖，包括甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸，分別用去離子水配成2 mmol/L溶液，分別取50 μL混合于離心管，加PMP甲醇溶液200 μL和0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液200 μL，70℃水浴反應(yīng)30 min，冷卻至室溫（25±2）℃后加210 μL 0.3 mol/L氯化氫溶液中和，用1 mL氯仿萃取，振蕩均勻后10 000 r/min離心5 min。離心后取上層，重復(fù)操作3次。最后0.45 μm濾膜過濾，用于HPLC檢測(cè)。

色譜條件：色譜柱為AgilentZORBAXEclipseXDBC18（?4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液-乙腈（體積比 83∶17）；流速為 1 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。

1.3.6 黃茶多糖YT70-1的純度分析

采用高效液相凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）測(cè)試多糖樣品的均一性。稱取YT70-15 mg溶于1 mL的超純水中，用0.45 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。色譜條件為高效液相色譜儀Waters2695，色譜柱：TSK-GELG-3000PWXL凝膠柱串聯(lián)，檢測(cè)器：Waters2414示差檢測(cè)器，流動(dòng)相：0.02mmol/LKH2PO4溶液，進(jìn)樣量：10μL，流速：0.5mL/min。

1.4 黃茶多糖的抗氧化活性測(cè)定

1.4.1 黃茶多糖對(duì)DPPH·的清除效果

DPPH溶液（0.1 mmol/L）的制備：稱取0.003 9 g DPPH，以無水乙醇為溶劑，定容至10 mL，將定容液稀釋10倍即得，避光保存于0～4°C。

DPPH自由基的清除效果測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[26]的方法，根據(jù)實(shí)際做一些修改。稱取一定量的YT70-1，將其配制成不同濃度梯度的多糖溶液（0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、5、10、20 mg/mL），移取 20 μL 于 96 孔板中，加入 200 μL DPPH 溶液（0.1 mmol/L）。充分搖勻，于黑暗處放置30 min，在517 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1。多糖溶液用去離子水代替，其他條件和操作不變，在517 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)2。DPPH溶液用無水乙醇代替，其他條件和操作不變，在517 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)3。以VC為陽性對(duì)照[27]。每個(gè)濃度梯度平行操作3次。清除效果根據(jù)以下公式計(jì)算。

式中：A1為多糖溶液+DPPH·工作液吸光度值；A2為去離子水+DPPH工作液吸光度值；A3為多糖溶液+去離子水吸光度值。

1.4.2 測(cè)定黃茶多糖對(duì)ABTS+·的清除效果

ABTS母液的制備（21mmol/L）：稱取0.1152gABTS，以去離子水為溶劑，移至10mL容量瓶中并定容。

過硫酸鉀溶液的制備（7.35 mmol/L）：稱取過硫酸鉀0.019 9 g，以去離子水為溶劑，定容到10 mL容量瓶中。

ABTS儲(chǔ)備液的制備：各取5 mL ABTS母液和過硫酸鉀溶液，混勻后加入5 mL去離子水，搖勻，并避光放置12 h（僅限第2天使用）。

ABTS+·的清除效果測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[28]的方法，并根據(jù)實(shí)際情況做了一些修改。用去離子水將ABTS儲(chǔ)備液稀釋成ABTS工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用，734 nm處測(cè)得的吸光度為0.7±0.02），置于30°C平衡30 min。稱取一定量的YT70-1，將其配制成不同濃度的多糖溶液（0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20 mg/mL）。向96孔板中加入20 μL多糖溶液及200 μL ABTS工作液?；靹蚝蟊芄夥胖?0 min，于734 nm處測(cè)定吸光度A4。以去離子水分別代替多糖溶液、ABTS工作液，重復(fù)上述操作，于734 nm處測(cè)定吸光值分別為A5、A6，以VC為陽性對(duì)照。每個(gè)濃度梯度平行操作3次。清除效果根據(jù)以下公式計(jì)算。

式中：A4為多糖溶液+ABTS工作液吸光度；A5為去離子水+ABTS工作液吸光度；A6為多糖溶液+去離子水吸光度。

1.4.3 測(cè)定黃茶多糖對(duì)羥自由基的清除效果

稱取一定量的YT70-1，將其配制成不同濃度的多糖溶液（0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20mg/mL），各取2 mL于具塞試管，分別加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL和6mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL，用8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL啟動(dòng)反應(yīng)，37℃水浴條件下反應(yīng)30 min后于510 nm處測(cè)定吸光度。以VC為陽性對(duì)照。每個(gè)濃度梯度平行操作3次。清除效果根據(jù)以下公式計(jì)算。

式中：A7為樣品吸光度值；A8為以蒸餾水代替樣品的對(duì)照吸光度值；A9為以去離子水代替樣品和H2O2的吸光度值。

1.4.4 測(cè)定黃茶多糖的總還原力試驗(yàn)

取磷酸緩沖液（pH6.6）與1.0%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，充分混勻后，分別加入1.0 mL不同濃度的多糖溶液（0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20 mg/mL），混勻，50℃水浴加熱20 min。隨后加入蒸餾水2.0 mL與 0.1%FeCl3溶液 2.0 mL，混勻后室溫（25±2）℃靜置10 min，700 nm處測(cè)定其吸光度。以去離子水代替多糖溶液作為空白對(duì)照，以VC為陽性對(duì)照。每個(gè)濃度梯度平行操作3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 提純結(jié)果

2.1.1 黃茶多糖的提取

采用熱水浸提、70%乙醇沉淀的方法得到黃茶70部位的粗多糖P70，采用Sevag法脫蛋白、透析及凍干后得37.169 g的黃茶粗多糖YT70。

2.1.2 黃茶多糖的糖含量測(cè)定

以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到A=4.521 4C-0.010 9（其中A為吸光度，C為濃度），R2=0.999 1的回歸方程，如圖1所示。根據(jù)葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算所得黃茶粗多糖YT70的糖含量為43.3%。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard cure of glucose

2.1.3 黃茶多糖的洗脫曲線

YT70的DEAE-52柱層析洗脫曲線見圖2。

圖2 YT70的DEAE-52柱層析洗脫曲線Fig.2 Elution profile of YT70 on DEAE-52

由圖2可知，黃茶粗多糖YT70經(jīng)DEAE-52柱分離得到3個(gè)組分，將其命名為YT70-1、YT70-2、YT70-3，分別是用水、0.05 mol/L和0.2 mol/L的氯化鈉溶液洗脫得到。其中YT70-1吸光度值高，且峰型很窄，表示其糖含量及純度較高。而YT70-2和YT70-3的吸光度值偏低，峰型寬，有明顯拖尾現(xiàn)象，表明它們的糖含量不高且雜質(zhì)偏多。故收集YT70-1，進(jìn)行濃縮、透析并凍干。

2.1.4 單糖組成分析

將混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液以及多糖樣品溶液進(jìn)行液相分析。單糖組成分析結(jié)果見圖3。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)混合單糖的HPLC分析圖譜和YT70-1的HPLC分析圖譜Fig.3 HPLC analysis of the mixture of standard monosaccharide and HPLC analysis of the monosaccharide of YT70-1

如圖3A和圖3B所示，與混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析圖譜作對(duì)照，可知YT70-1的單糖組成包括甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖及巖藻糖8種糖，相對(duì)含量分別為20.35%、11.71%、3.17%、20.99%、17.54%、7.62%、15.90%、2.71%。其中，葡萄糖和甘露糖的含量比較高，而葡萄糖醛酸和巖藻糖的含量很少。

2.1.5 黃茶多糖YT70-1的純度驗(yàn)證

YT70-1的HPGPC色譜圖見圖4。

圖4 YT70-1的HPGPC色譜圖Fig.4 HPGPC analysis of YT70-1

如圖4所示，YT70-1的HPGPC圖譜呈現(xiàn)為單一對(duì)稱峰，但是仍有一些殘存雜質(zhì)。表明YT70-1為半純多糖，略帶雜質(zhì)。

2.2 抗氧化測(cè)定結(jié)果

2.2.1 黃茶多糖對(duì)DPPH·的清除效果

YT70-1對(duì)DPPH·的清除能力見圖5。

圖5 YT70-1對(duì)DPPH·的清除能力Fig.5 The scavenging effects of YT70-1 on DPPH·

從圖5可以看出，隨著濃度的增加，黃茶多糖YT70-1對(duì)DPPH·的清除率逐漸增大。當(dāng)YT70-1的濃度達(dá)到20 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率為48.7%。雖然明顯不及VC的（IC50為0.063 22 mg/mL）的清除能力，但仍然表明YT70-1具有一定的抗氧化作用。

2.2.2 黃茶多糖對(duì)ABTS+·的清除效果

YT70-1對(duì)ABTS+·的清除能力見圖6。

圖6 YT70-1對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.6 The scavenging effects of YT70-1 on ABTS+·

由圖6可知，隨著濃度的增加，YT70-1對(duì)ABTS+·清除率逐漸增大。當(dāng)濃度在5 mg/mL～10 mg/mL時(shí)，YT70-1對(duì)ABTS+·的清除率為60%～80%，之后隨濃度增加，清除效果變化不大，趨于穩(wěn)定。以樣品的濃度對(duì)ABTS+·清除率作圖并進(jìn)行線性擬合后計(jì)算得到陽性對(duì)照藥VC的IC50為0.050 52 mg/mL，YT70-1的IC50為3.87 mg/mL。YT70-1呈現(xiàn)出良好的ABTS+·清除能力。

2.2.3 黃茶多糖對(duì)羥自由基（·OH）的清除效果

YT70-1對(duì)OH自由基的清除能力見圖7。

圖7 YT70-1對(duì)OH自由基的清除能力Fig.7 The scavenging effects of YT70-1 on·OH

由圖7可知，YT70-1清除OH自由基的能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)YT70-1的濃度達(dá)到20 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率為39.67%。陽性對(duì)照VC對(duì)·OH的清除率可達(dá)到96.33%。因此YT70-1表現(xiàn)出了對(duì)OH自由基的清除活性。

2.2.4 黃茶多糖的總還原力

YT70-1的總還原力見圖8。

圖8 YT70-1的總還原力Fig.8 Reducing power of YT70-1

如圖8所示，隨著濃度的增加，黃茶多糖YT70-1的還原力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)YT70-1的濃度達(dá)到20 mg/mL時(shí)，OD700nm為0.415，雖然明顯不及陽性對(duì)照VC（2.64）的還原力（吸光度越大表示還原能力越強(qiáng)），但仍然表明黃茶多糖具有一定的抗氧化作用。

3 結(jié)論

黃茶經(jīng)水提醇沉除蛋白后得到黃茶的粗多糖成分YT70，其糖含量為43.3%，再經(jīng)DEAE-52柱層析分離純化得到黃茶多糖YT70-1，其主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖及巖藻糖等單糖組成，隨后運(yùn)用一系列多糖抗氧化化學(xué)檢測(cè)方法測(cè)定分析了黃茶多糖YT70-1的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，YT70-1具有一定的體外抗氧化活性，體外能夠清除DPPH·、ABTS+·和·OH，清除能力隨多糖濃度的增大而增加，其中相較DPPH·和·OH，YT70-1對(duì)ABTS+·的清除能力更強(qiáng)，效果更好。