史珂雨，趙慧琳，李明鑫，秦兆盈，吳迪，杜明，王聰

（1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學實驗儀器中心，遼寧 大連 116034）

目前，人工合成的降血壓藥物有200余種，但需要終身口服，而且大多存在引起低血壓、咳嗽、血鉀升高、胎兒畸形等副作用。因此，急需開發(fā)安全性更高的食源性血管緊張素轉換酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）抑制肽。

核桃具有很高的食用價值和藥用價值，在我國中醫(yī)藥學中有著廣泛的應用。核桃仁營養(yǎng)豐富，含有16%～19%的優(yōu)質蛋白質[1]。以核桃為基料的ACE抑制肽研究，在酶法水解工藝篩選、分離純化條件優(yōu)化等方面已經(jīng)積累了比較豐富的經(jīng)驗，在結構鑒定和構效關系方面也開始進行逐步深入的探討。隨著科技飛速進步，將新興的計算機生物信息技術與傳統(tǒng)多肽研究方法相結合的探索，即將展現(xiàn)出特有的優(yōu)勢。

生物信息學方法主要依賴于大量試驗數(shù)據(jù)建立的數(shù)據(jù)庫，以此為基礎對目標蛋白質的各種生物信息、活性功能、分子間作用機理進行分析判斷，可以減少生物制備純化鑒定的繁瑣工序和制備成本，加快試驗進程[2-5]。隨著ACE抑制肽的廣泛深入研究，蛋白一級序列數(shù)據(jù)庫的逐步建立，利用計算機模擬復合酶水解蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽的這種思路，對于實踐操作具有較好的指導作用。利用生物信息技術闡述ACE抑制肽分子特性，尤其是氨基酸在其中的分布規(guī)律，分析核桃蛋白酶解產(chǎn)物中降血壓肽的分布情況，對于ACE抑制肽的分離純化及構效關系研究具有重要的指導作用，對于核桃降血壓肽的深度開發(fā)具有重要的應用價值。

1 材料與方法

1.1 ACE抑制肽分子信息庫建立

ACE抑制肽的分子信息收集主要來自于兩部分，絕大部分從BIOPEP數(shù)據(jù)庫中獲得[6]，另外一部分從Web of Science等文獻數(shù)據(jù)庫中通過文獻檢索獲得。

1.2 ACE抑制肽的分子特性與結構分析

主要關注ACE抑制肽的幾方面信息：分子量、等電點、表面凈電荷、疏水性、N-末端氨基酸、C-末端氨基酸等，建立這些分子信息與ACE抑制活性之間的內(nèi)在規(guī)律性聯(lián)系。為后續(xù)ACE抑制肽的分離制備、活性分析及構效關系研究提供一定的理論參考。

1.3 虛擬酶切數(shù)據(jù)庫選擇

采用PeptideCutter軟件數(shù)據(jù)庫進行虛擬酶切位點分析，該數(shù)據(jù)庫的互聯(lián)網(wǎng)地址為https：//web.expasy.org/peptide_cutter/[7]。

1.4 核桃蛋白虛擬酶切位點分析

核桃種子儲藏蛋白（GeneBank：AAW29810.1）分子由507個氨基酸組成，序列從美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）蛋白數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ncbisearch）中獲得[8]。采用PeptideCutter進行虛擬酶切位點分析，主要選取胃腸消化道中常見的蛋白酶。通過酶切位點分析推測其酶切產(chǎn)物，進而將這些虛擬酶切產(chǎn)物的氨基酸序列作為產(chǎn)物活性判定的依據(jù)之一。

2 結果與分析

2.1 ACE抑制肽分子組成與活性關系分析

本研究經(jīng)過搜索數(shù)據(jù)庫以及文獻總結歸納，選取了目前報道的691條具有ACE抑制活性的肽段，針對這些ACE抑制肽的分子結構特點展開分析，建立了這些分子信息與ACE抑制活性之間的內(nèi)在規(guī)律性聯(lián)系。

ACE抑制肽的肽鏈長度和分子量的分布情況見圖1。

圖1 ACE抑制肽的肽鏈長度和分子量的分布情況Fig.1 Relationship of peptide chain length and ACE activity

研究顯示ACE抑制肽的降壓活性與其相對分子質量大小、肽鏈長度有關。本研究發(fā)現(xiàn)（如圖1），ACE抑制肽通常含有2個～20個氨基酸。由圖1a可知，長度在2個～5個氨基酸的肽有415條、6個～10個氨基酸的肽有230條、10個～15個氨基酸的肽有41條、16個～20個氨基酸的肽只有5條，分別占到所匯總ACE抑制肽總數(shù)的60.06%、33.28%、5.93%和0.72%。肽鏈含有2個～5個氨基酸的短肽出現(xiàn)的頻率最高。肽的分子量與肽鏈長度成正比，綜合考慮大部分肽的純化鑒定等研究中，均與分子量直接關聯(lián)，因此也應該針對分子量進行分析。

由圖1b可知，分子量分布在500 Da以下的肽有315條、500 Da～1 000 Da的肽有274條、1 000 Da～1 500 Da的肽有79條、1 500 Da～2 000 Da的肽有21條、而分子量大于2 000 Da的肽僅有2條，分別占到所匯總ACE抑制肽總數(shù)的45.58%、39.65%、11.43%、3.04%和0.29%。從統(tǒng)計學的規(guī)律來看，分子量小于1 000 Da的ACE抑制肽所占比例較大，其中分子量500 Da以下的ACE抑制肽比例最大。這說明小分子肽更容易進入到ACE活性中心，發(fā)揮抑制作用。而肽鏈長度過長，影響活性肽進入到ACE三級結構的內(nèi)部，可能由于空間位阻效應，不利于與ACE活性位點結合。

2.2 ACE抑制肽末端氨基酸與活性關系分析

ACE抑制肽的末端氨基酸分布情況見圖2。

圖2 ACE抑制肽的末端氨基酸分布情況Fig.2 Relationship of amino acid properties of peptides and ACE activity

目前，ACE抑制肽的結構和功能的關系還沒有徹底闡明，但是研究普遍認為，ACE抑制肽的抑制活性和其自身的結構和氨基酸順序有關。由圖2a可知，對ACE抑制肽的N-末端氨基酸分布情況進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)有8種氨基酸在ACE抑制肽的N-末端出現(xiàn)的頻率較高，它們分別為 Leu、Val、Tyr、Ala、Ile、Gly、Pro和Phe。其中Leu出現(xiàn)頻率最高為12.15%，其余7種氨基酸的出現(xiàn)頻率分別為9.69%、8.83%、8.10%、7.81%、7.67%、7.23%和6.08%。同時，從中也發(fā)現(xiàn)Asp、Trp和Cys在ACE抑制肽的N-末端出現(xiàn)頻率很低，分別為1.59%、1.30%、0.43%，說明這些氨基酸在肽鏈的N-末端時，其降血壓活性可能處在較低水平。

由圖2b可知，對691種ACE抑制肽的C-末端氨基酸進行分析研究，Pro表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，在C-末端出現(xiàn)頻率達到29.96%。此外，還有7種主要氨基酸在ACE抑制肽的C-末端出現(xiàn)的頻率較高，它們分別為Tyr、Lys、Arg、Leu、Phe、Ala 和 Gly，對應出現(xiàn)頻率分別為 10.27% 、8.25% 、6.22% 、5.93% 、5.64% 、5.21% 和5.06%，主要為芳香族氨基酸（Tyr、Phe）、帶正電荷的堿性氨基酸（Lys、Arg）或側鏈脂肪烴氨基酸（Leu、Ala和Gly），同時，從圖中也發(fā)現(xiàn) Met、Asp、Asn、Ile 和 His在ACE抑制肽的C-末端出現(xiàn)頻率很低，對應出現(xiàn)頻率分別為0.29%、0.87%、1.16%、1.30%和1.30%，而Cys在C-末端甚至沒有出現(xiàn)，說明這些氨基酸在肽鏈的C-末端時，其降血壓活性可能不高。

2.3 ACE抑制肽分子表面電荷與活性關系分析

ACE抑制肽的等電點及凈電荷分布情況見圖3。

圖3 ACE抑制肽的等電點及凈電荷分布情況Fig.3 Relationship of pI and charge of peptides and ACE activity

在對ACE抑制肽分子特性與構效關系的研究中，關于肽的等電點和凈電荷對ACE抑制活性的作用效果的探討很少見。由圖3a可以看出，等電點在pH 7以下的肽共有460條，占所統(tǒng)計肽總數(shù)的66.57%；等電點在pH 8以上的肽共有224條，占所統(tǒng)計肽總數(shù)的32.42%；等電點在pH 7～8即生理pH左右的肽僅有7條，僅占所統(tǒng)計肽總數(shù)的1.01%。由圖3b可以看出，691種ACE抑制肽的凈電荷規(guī)律以不帶電或者帶一個正電荷為主，帶正電荷的肽有286條，占所統(tǒng)計肽總數(shù)的41.39%；不帶電荷的肽有325條，占所統(tǒng)計肽總數(shù)的47.03%；而帶有負電荷的肽僅有80條，占所統(tǒng)計肽總數(shù)的11.58%。因此推測負電荷對抑制活性的促進作用不明顯?？傮w來看，不帶電或帶有少量正電荷更有利于發(fā)揮ACE抑制活性。

ACE抑制肽的等電點數(shù)值基本集中在pH 5～7和pH 8～10兩個范圍內(nèi)，分別占比55.86%和28.94%。在pH 7.3左右的范圍內(nèi)，具有活性的ACE抑制肽非常少。分析這種情況可知，活性肽在等電點附近會聚集變性，不能與ACE分子順利結合而失去生理活性，而等電點pH5～7或pH8～10的ACE抑制肽則可以在生理pH條件下帶正電荷或者負電荷，有帶電荷和羧酸基團的肽與ACE更容易形成氫鍵[9]。這樣更容易與ACE分子之間形成氫鍵或者凈電荷相互作用，有利于肽與ACE之間形成穩(wěn)定的復合結構。

2.4 ACE抑制肽疏水性與活性關系分析

ACE抑制肽的親水指數(shù)和親水氨基酸分布情況見圖4。

圖4 ACE抑制肽的親水指數(shù)和親水氨基酸分布情況Fig.4 Relationship of hydrophilicity of peptides and ACE activity

疏水性是活性肽的重要分子特性之一，肽段的親水疏水值可能會影響其與ACE結合的效果。由圖4a可見，據(jù)本研究涉及的ACE抑制肽統(tǒng)計可知，其肽段整體親水性值小于0的有465條，占所分析總數(shù)的67.29%；整體親水性值大于0的有181條，占所分析總數(shù)的26.19%。說明這些ACE抑制肽中，親水性較弱而疏水性相對較強的肽段所占比重較大。圖4b顯示，ACE抑制肽氨基酸組成中所含有的親水氨基酸含量并不高，肽鏈中親水氨基酸百分比含量小于50%的567條肽，在全部統(tǒng)計肽段中占比82.05%；而親水氨基酸含量大于或等于50%的肽段只有124條，在全部統(tǒng)計肽段中占比17.94%。即大部分的ACE抑制肽中親水性氨基酸含量較低。

上述這些結果可以作為實際研究中的理論參考，在篩選確定ACE抑制肽過程中明確研究方向，制定制備策略等方面具有良好的指導作用。

2.5 核桃ACE抑制肽的虛擬酶切產(chǎn)物及分析

核桃種子儲藏蛋白的分子量為58 144.5 Da，理論等電點為7.0[7-8]。平均親水性是根據(jù)多肽序列中所有氨基酸殘基以及它們所帶不同修飾基團的親/疏水值計算的。經(jīng)過分析，核桃種子儲藏蛋白分子的平均親水性值是0.3，親水氨基酸殘基在分子中所占的比例為49%。從這個蛋白質的平均親水性值，可以判斷其在水相體系中的溶解性比較好。

本研究根據(jù)核桃種子儲藏蛋白的氨基酸序列，采用 PeptideCutter數(shù)據(jù)庫工具（https：//web.expasy.org/peptide_cutter/）[7]，進行其虛擬酶切位點分析。雖然中性蛋白酶和堿性蛋白酶也屬于內(nèi)切酶，在目前食品工業(yè)中廣泛用于酶解蛋白質生產(chǎn)活性肽，但由于這兩種酶切位點幾乎沒有序列特異性，隨機性很強，很難控制切割的氨基酸殘基位置，產(chǎn)物難以預測，所以在選擇虛擬酶切的蛋白酶時不考慮這兩種酶。從PeptideCutter數(shù)據(jù)庫中，選取Arg-C蛋白酶[10]、Asp-N端肽酶[11]、Asp-N端肽酶+N端Glu[12]、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶[13]、高專一性胰凝乳蛋白酶[14]、低專一性胰凝乳蛋白酶[15]、谷氨酰內(nèi)肽酶[16]、胃蛋白酶（pH1.3）[17]、胃蛋白酶（pH>2）[18]、脯氨酸肽鏈內(nèi)切酶[19]、蛋白酶 K[20]、葡萄球菌肽酶I[21]、嗜熱菌蛋白酶[22]、胰蛋白酶[23]這14種較為常見的蛋白酶進行虛擬酶切分析。

研究表明，組織蛋白酶C是一種巰基蛋白酶，可以水解氨基端雙肽，可通過K、R或P氨基端作為第二或第三個氨基酸進行封閉；胰凝乳蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，特異性水解位點是在F-Phe、T-Thr或Y-Tyr之后；內(nèi)肽酶Arg-C是一種絲氨酸蛋白酶，特異性水解位點是在R-Arg之后[10]；內(nèi)肽酶Asp-N是一種金屬蛋白酶，特異性水解位點是在D-Asp和C-Cys半胱氨酸之前[11]；內(nèi)肽酶Glu-C是一種絲氨酸蛋白酶，特異性水解位點是在E-Glu/Gln或D-Asp之后；內(nèi)肽酶Lys-C是一種絲氨酸蛋白酶，特異性水解位點是在K-Lys之后；蛋白酶K是一種絲氨酸蛋白酶，特異性水解位點具有廣泛特異性[20]；枯草桿菌蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，水解位點無特異性；胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，特異性水解位點是在K-Lys或R-Arg之后[23]。胃蛋白酶對蛋白質的酶切位點具有一定的氨基酸序列特異性，優(yōu)先水解N-末端或C-末端為芳香族氨基酸（Phe、Trp和Tyr）或Leu的肽鍵。關于不同蛋白酶的酶切位點與核桃種子儲藏蛋白氨基酸序列之間的對應關系如表1和圖5所示。

表1 核桃種子儲藏蛋白的理論酶切位點（100%可能性）Table 1 Theoretical enzyme cutting site of walnut seed storage protein（100% possibility）

圖5 核桃種子儲藏蛋白的虛擬酶切位點分析Fig.5 Analysis of the virtual enzyme cutting site of walnut seed storage protein

3 結論

本研究建立了ACE抑制肽分子結構信息與ACE抑制活性之間的內(nèi)在規(guī)律性聯(lián)系。其中，分子量小于1 000 Da尤其是500 Da以下的ACE抑制肽占據(jù)優(yōu)勢地位，并且 Pro、Tyr、Leu、Phe和 Ala這幾種氨基酸在ACE抑制肽分子末端出現(xiàn)的頻率較高；這些肽分子的理論等電點在pH 5～7區(qū)間分布較多，而且這些肽中親水性氨基酸含量通常較低。另外，核桃儲藏蛋白的虛擬酶切分析表明，組織蛋白酶K的酶切位點最多，約占總肽鍵數(shù)量的50%以上；人體消化道中常見的胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶，在酶解制備核桃蛋白多肽中也表現(xiàn)出良好的應用前景。該研究為以核桃蛋白為原料的ACE抑制肽的制備提供了一定的理論參考。