陽光毛白楊帶芽莖段再生體系的構(gòu)建

石進朝 陳博 陳蘭芬 李彥俠

摘要：以陽光毛白楊帶芽莖段為材料，探討適宜的外植體、消毒方法及6-芐氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）和赤霉素（GA3）對增殖生長和吲哚乙酸（IBA）、NAA對生根的影響，并對適宜的瓶苗移栽生根長度、煉苗時期進行研究，構(gòu)建陽光毛白楊帶芽莖段再生體系。結(jié)果表明：（1）適宜的外植體為嫩枝帶芽莖段及半木質(zhì)化帶芽莖段，發(fā)芽率分別達(dá)86.7%、63.3%。（2）嫩枝帶芽莖段消毒方法是先用90%乙醇（C2H5OH）溶液消毒60 s，再用0.1%氯化汞（HgCl2）溶液消毒 4 min;半木質(zhì)化帶芽莖段消毒方法是先用90% C2H5OH溶液消毒60 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒5 min。（3）適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA3 0.5 mg/L，適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 0.5 mg/L。（4）煉苗移栽時，適宜的瓶苗根長為1.5～3.5 cm，適宜的煉苗時期為每年的3月，能夠獲得87.50%的成活率。本再生體系為快速繁育優(yōu)質(zhì)陽光毛白楊苗木奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：帶芽莖段;增殖;生根;成活率;陽光毛白楊

中圖分類號： S722.3+7 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）14-0050-05

毛白楊（Populus tomentosa）是楊柳科（Salicaceae）楊屬（Populus L.）白楊派落葉大喬木，是我國北方特有的造林綠化樹種。陽光毛白楊是筆者于2015年在北京地區(qū)1株雄性毛白楊上發(fā)現(xiàn)的芽變體，它的特點是雄性不飛絮，新生葉在整個生長季節(jié)為金黃色，老葉漸變綠，為毛白楊的一個彩色變異體。我國北方地區(qū)鄉(xiāng)土彩色大喬木樹種不多，陽光毛白楊的誕生，為我國北方地區(qū)城鄉(xiāng)綠化，特別是治理飛絮、增彩延綠等提供了新樹種。陽光毛白楊扦插成活率低，繁殖系數(shù)不高，影響了它的推廣與應(yīng)用。關(guān)于毛白楊組織培養(yǎng)快速繁殖，許多學(xué)者進行了相關(guān)研究，提高了毛白楊的繁殖系數(shù)[1-7]。如何在短期內(nèi)繁殖出優(yōu)質(zhì)陽光毛白楊苗木，把這一鄉(xiāng)土彩色樹種早日應(yīng)用到首都園林綠化中去，本研究于2019年2月至2020年8月對陽光毛白楊進行帶芽莖段再生體系構(gòu)建的研究，建立陽光毛白楊快繁體系，以期為規(guī)模化繁育優(yōu)質(zhì)陽光毛白楊苗木奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為一年生陽光毛白楊（Populus tomentosa Sunny）芽變枝條。試驗選取陽光毛白楊半木質(zhì)化帶芽莖段、嫩枝帶芽莖段作為外植體材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體采集與消毒

1.2.1.1 外植體的采集 嫩枝帶芽莖段的采集：參照花葉毛白楊外植體培養(yǎng)方法[8]。2019年2月18日從陽光毛白楊芽變枝條，采集芽體飽滿、未萌發(fā)，生長健壯的一年生枝條，剪成10～12 cm枝段，放入1 000 mL燒杯中水培，置于20～30 ℃有直射光的室內(nèi)，當(dāng)其芽萌發(fā)長度達(dá)到4～5 cm，長出4～6張葉片時，選取其嫩枝帶芽莖段作為外植體材料。

半木質(zhì)化帶芽莖段的采集：2019年5月16日在室外露地選取當(dāng)年生陽光毛白楊枝條上端半木質(zhì)化帶芽莖段作為外植體材料。

1.2.1.2 外植體的消毒 把采集到的陽光毛白楊外植體先用毛刷蘸取少許洗滌靈液，反復(fù)輕輕刷洗 5～6次，用蒸餾水充分沖洗干凈后，把半木質(zhì)化枝條及嫩枝剪切成長為1.0～1.2 cm的帶芽小段，再用蒸餾水沖洗30 min，在洗滌靈溶液中振蕩15 min。先用90%乙醇（C2H5OH）溶液消毒60 s，再用0.1%氯化汞（HgCl2）溶液分別消毒3、4、5、6、7 min，共計設(shè)置5個處理。每個處理30個樣品。清毒后蒸餾水沖洗6～8次，再用無菌濾紙吸干水分后備用。

1.2.2 初代培養(yǎng) 把經(jīng)過消毒的陽光毛白楊外植體接種在MS培養(yǎng)基上進行初代培養(yǎng)（圖1-a、圖1-b），培養(yǎng)室溫度為（25±1） ℃，光照度為 2 000～3 000 lx，光照時間為12 h/d。在超凈工作臺上將無菌外植體接種于100 mL廣口瓶中，用封口膜封口。

1.2.3 增殖生長中6-芐氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）及赤霉素（GA3）適宜添加濃度的確定 當(dāng)初代苗高度達(dá)到6～8 cm，接近瓶蓋時，以MS為繼代增殖基本培養(yǎng)基，在其中加入不同濃度的6-BA（A）、NAA（B）和GA3（C），設(shè)置為3個因素，每個因素3個水平，不考慮交互作用，采用L9（34）均勻水平正交試驗，共計9個處理，方案設(shè)計見表1。

將初代苗切成長為2 cm的帶芽小段進行增殖培養(yǎng)，每個處理樣品30個，繼代25 d后，統(tǒng)計增殖倍數(shù)、高度（H）為2.5 cm及以上的增殖苗占比等數(shù)據(jù)，記錄生長勢。確定適宜的6-BA、NAA及GA3添加濃度。

1.2.4 生根培養(yǎng)基中，吲哚乙酸（IBA）及NAA適宜的添加濃度的確定 參照變?nèi)~金銀木的方法[9]。當(dāng)繼代苗生長到高5～6 cm時，以1/2 MS為生根基本培養(yǎng)基，在其中加入不同濃度的IBA及NAA，每個處理30個樣品，切取繼代苗帶芽莖段進行生根培養(yǎng)，25 d 后調(diào)查各處理瓶苗的生根數(shù)量、根長、根生長勢，依此確定添加IBA及NAA的適宜濃度。

1.3 瓶苗生根長度與移栽時期試驗

在生根培養(yǎng)25 d后，當(dāng)陽光毛白楊瓶苗生長高度達(dá)5～6 cm，有4～6張正常葉片時，將生長健壯的瓶苗打開瓶口3 d，進行不同生根長度（≤1.5 cm、1.5～3.5 cm、≥3.5 cm）及一年中不同時期（3月12日、7月21日、9月15日及次年的1月20日）的移栽試驗。依據(jù)移植成活率，確定適宜的移植瓶苗生根長度及一年中適宜的移植時期。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件，對本試驗中的數(shù)據(jù)進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對外植體發(fā)芽率的影響

2種陽光毛白楊的外植體先用90% C2H5OH溶液消毒60 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒處理不同時間。由表2可知，2種陽光毛白楊外植體經(jīng)不同時間0.1% HgCl2溶液消毒處理后，發(fā)芽率差異明顯。半木質(zhì)化帶芽莖段的發(fā)芽率最高（63.3%）時的消毒時間為 5 min，用0.1% HgCl2溶液消毒7 min時，發(fā)芽率為0?？梢?，半木質(zhì)化帶芽莖段適宜的消毒方法為先用90% C2H5OH溶液處理60 s，再用0.1% HgCl2溶液處理5 min。

嫩枝帶芽莖段作為外植體材料經(jīng)過3～7 min 0.1% HgCl2溶液消毒處理后，最大發(fā)芽率為86.7%，其對應(yīng)的0.1% HgCl2溶液消毒時間為 4 min;隨著消毒時間的增加，發(fā)芽率明顯下降，消毒6～7 min，發(fā)芽率降低為0?？梢姡壑а壳o段為外植體時，適宜的消毒方法為先用90% C2H5OH溶液處理60 s，再用0.1% HgCl2溶液處理4 min。

2.2 不同濃度的6-BA、NAA及GA3對陽光毛白楊瓶苗增殖生長的影響

在MS基本培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的6-BA、NAA和GA3，設(shè)置為3個因素，每個因素3個水平，采用L9（34）的均勻水平正交試驗，共計9個處理。選擇生長健壯，高度≥2.5 cm的初代苗，將其剪切成1.0 cm的帶芽莖段，進行接種，25 d后平均增殖倍數(shù)、增殖苗高度（H）≥2.5 cm百分比及生長勢見表3，方差分析結(jié)果見表4、表5。

由表3可知，在MS基本培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的6-BA、NAA、GA3，培養(yǎng)25 d后均能誘導(dǎo)出繼代增殖苗，增殖倍數(shù)為2.39～4.62，增殖苗高度（H）≥2.5 cm的百分比為11.3%～86.3%。結(jié)合表4、表5中方差分析結(jié)果可以看出，6-BA濃度對陽光毛白楊瓶苗增殖倍數(shù)和瓶苗高度均有極顯著影響，而NAA和GA3的濃度變化對其影響不顯著。較高濃度（0.3 mg/L）的6-BA對陽光毛白楊瓶苗的增殖生長有明顯的促進作用，表現(xiàn)為增殖倍數(shù)高，苗木生長健壯（圖2）;隨著6-BA濃度的增加，叢生芽顏色有發(fā)黃跡象，玻璃化明顯增多，長勢變?nèi)?。依?jù)增殖培養(yǎng)25 d后的平均增殖倍數(shù)、增殖苗高度（H）≥2.5 cm的百分比及增殖苗生長勢3項指標(biāo)綜合來看，陽光毛白楊瓶苗增殖生長時，適宜的6-BA、NAA及GA3濃度分別為0.3、0.05、0.5 mg/L。即陽光毛白楊瓶苗增殖生長適宜的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA3 0.5 mg/L。

2.3 不同濃度IBA及NAA對瓶苗生根的影響

以1/2 MS為陽光毛白楊瓶苗生根基本培養(yǎng)基，在其中添加不同濃度的IBA（0.3、0.5、0.8、1.0 mg/L）及NAA（0.5、0.8、1.0、1.5 mg/L）。當(dāng)繼代苗生長高度為5～6 cm，接近瓶蓋時，將其剪切成1.0 cm的帶芽莖段接種，進行生根培養(yǎng)，25 d后調(diào)查瓶苗單株平均生根數(shù)量、生根長度、根生長勢，結(jié)果見表6。由表6可知，不同濃度IBA對陽光毛白楊繼代苗生根長度影響差異顯著，在IBA濃度為 0.3～1.0 mg/L范圍內(nèi)，單株平均生根數(shù)量呈正態(tài)分布，在0.5 mg/L時達(dá)最大值，為8條;平均生根長度與IBA濃度無明顯相關(guān)性。根生長勢表現(xiàn)為在IBA濃度為1.0 mg/L時，基部有愈傷組織形成，根少而短;IBA濃度為 0.8 mg/L 時，瓶苗生根少，單株平均3條，根細(xì)長，長勢弱;在IBA濃度為0.5 mg/L時，第20天開始生根，生根快，數(shù)量多，達(dá)8條，根生長勢健壯。IBA濃度為0.3 mg/L時，生根慢，數(shù)量少，為2條，根細(xì)長。

當(dāng)NAA濃度為1.0、1.5 mg/L時，陽光毛白楊繼代苗有少量生根，單株平均生根數(shù)量分別為2、3條，平均生根長度小，根少而細(xì)長。顯示出IBA比NAA更有利于陽光毛白楊瓶苗生根，有促進瓶苗生根的作用。

從瓶苗的平均生根數(shù)、根長、根生長勢3項指標(biāo)綜合來看，陽光毛白楊瓶苗生根時，適宜的IBA添加濃度為0.5 mg/L，即適宜的生根培養(yǎng)基為 1/2 MS+IBA 0.5 mg/L。

2.4 影響陽光毛白楊瓶苗移栽成活率的因素

植物瓶生根苗煉苗移栽成活率受多種因素影響，如開瓶煉苗時間、生根苗地徑[8-9]、栽培基質(zhì)及光照、溫濕度等環(huán)境控制因子直接決定著煉苗成活率。

2.4.1 不同瓶苗生根長度對生根瓶苗移栽成活率的影響 瓶苗的生根長度及根的健壯程度與移栽成活率密切相關(guān)。把經(jīng)過開口3 d的陽光毛白楊生根瓶苗，選擇基徑≥0.8 mm的苗，洗去培養(yǎng)基，按不同生根長度（≤1.5 cm、1.5～3.5 cm、≥3.5 cm），在智能溫室內(nèi)移栽到穴盤中，以蛭石與珍珠巖混合物（體積比為3 ∶ 1）作基質(zhì)。環(huán)境控制為初期保持70%～80%的相對空氣濕度，溫度控制在20～30 ℃，適當(dāng)遮陰，每隔10 d噴1次80%多菌靈800倍液，連噴3次，30 d后調(diào)查成活株樹、苗木生長勢，統(tǒng)計成活率，結(jié)果見表7。

苗木根系過長，如根長≥3.5 cm時進行移栽，須要對苗木進行修根處理，會造成傷根現(xiàn)象;苗木根系過短，如根長≤1.5 cm時進行移栽，由于苗木根系幼嫩，移栽時也會成傷根，苗木根系過長或過短，都會影響移栽成活率。由表7可知，不同生根長度的陽光毛白楊生根瓶苗移栽到穴盤中的成活率呈現(xiàn)正態(tài)分布，根長為1.5～3.5 cm時成活率最高，為87.50%，根長≥3.5 cm的成活率次之（62.22%），根長≤1.5 cm時，成活率最低（45.83%）?？梢姡谶M行陽光毛白楊生根瓶苗移栽時，適宜的瓶苗根長為1.5～3.5 cm。

2.4.2 不同移栽煉苗時期對生根瓶苗移栽成活率的影響 分別在一年中的3月12日、7月21日、9月15日及次年的1月20日，把已打開瓶口3 d，選用基徑≥0.8 mm、根長1.5～3.5 cm的陽光毛白楊生根瓶苗，移栽到裝有蛭石的穴盤中，環(huán)境控制同“2.4.1”節(jié)，成活率見表8。

一年中不同煉苗時期對苗木成活率的影響，實質(zhì)上是溫度、濕度等環(huán)境條件對苗木成活率的影響。由表8可知，在7月21日移栽煉苗時，成活率較低（48.61%），這時候氣溫高，濕度大，苗木容易染病，成活率低;在1月20日移栽煉苗時，這時候是一年中最冷的時期，成活率最低（38.89%）;在3月12日、9月15日，這時候室外溫濕度適宜，移栽成活率較高（圖3），分別為87.50%、81.94%。在進行陽光毛白楊生根瓶苗移栽時，一年中適宜的煉苗時間為3月和9月。3月煉苗時，培養(yǎng)30 d后，生根苗高度為15～20 cm（圖4），即可移栽到大田繼續(xù)培養(yǎng)成大苗，不需要在溫室中越冬;9月煉苗時，需要在溫室中越冬不能露地栽培，從節(jié)約成本方面考慮，陽光毛白楊適宜的煉苗移栽時期為3月。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

3.1.1 提高陽光毛白楊外植體誘導(dǎo)率的途徑 陽光毛白楊腋芽密被白色絨毛，消毒不易，易出現(xiàn)消毒過度或消毒不徹底等現(xiàn)象，尤其是從室外采集的半木質(zhì)化帶芽莖段，消毒滅菌困難，要么全部殺死，要么污染嚴(yán)重。本試驗選擇室內(nèi)水培陽光毛白楊萌枝上嫩枝帶芽莖段作為外植體，與變?nèi)~金銀木組織培養(yǎng)外植體選擇一樣[9]，獲得了較高的誘導(dǎo)成活率，探索出了陽光毛白楊嫩枝帶芽莖段及半木質(zhì)化帶芽莖段適宜的消毒滅菌方法，為規(guī)?；焖俜庇齼?yōu)質(zhì)陽光毛白楊苗木奠定了基礎(chǔ)。

3.1.2 激素對陽光毛白楊組培體系構(gòu)建的影響 生長調(diào)節(jié)劑是組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)植物形態(tài)建成的主要因素[10-11]，細(xì)胞分裂素在植物增殖中起著重要的作用，6-BA常與其他調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生和促進植物增殖[12]。本試驗結(jié)果顯示，增殖率在一定的 6-BA濃度范圍內(nèi)呈上升趨勢，較低濃度的 6-BA 促進莖段不定芽的增殖，而達(dá)到最佳的濃度后，再增加 6-BA 的濃度則表現(xiàn)為抑制不定芽的誘導(dǎo)，同時外植體玻璃化的趨勢加重。所以在實際操作中6-BA濃度不宜過高，否則會抑制外植體的整體生長。IBA及NAA在生根誘導(dǎo)中使用廣泛，通常較低濃度的生長素有利于外植體生根，濃度過高會產(chǎn)生抑制效果，本研究得出了相似的結(jié)果。NAA除了促進生根外還能促進發(fā)芽，而IBA誘導(dǎo)生根的作用較強且發(fā)根數(shù)量較大，根系較粗壯。

3.2 結(jié)論

嫩枝帶芽莖段是陽光毛白楊再生體系適宜的外植體材料，發(fā)芽率達(dá)86.7%。半木質(zhì)化帶芽莖段也可作為陽光毛白楊外植體材料，誘導(dǎo)出腋芽的發(fā)生，發(fā)芽率為63.3%。嫩枝帶芽莖段適宜的消毒方法為先用90% C2H5OH溶液消毒60 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒 4 min;半木質(zhì)化帶芽莖段適宜的消毒方法為先用90%C2H5OH溶液消毒60 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒5 min。陽光毛白楊再生體系適宜的增殖生長培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA3 0.5 mg/L，適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.5 mg/L。生根苗移栽煉苗時，適宜的生根瓶苗的根長為1.5～3.5 cm，適宜的煉苗時期為每年的3月，能夠獲得87.50%的成活率。

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