楊 敏 李向嶺 韓金玲 楊 晴 王 健

(河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院/河北省作物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島 066004)

中國(guó)是世界第二大甜玉米(Zea maysL. seccharata Sturt)生產(chǎn)國(guó)，甜玉米市場(chǎng)具有良好的發(fā)展前景。為迎合市場(chǎng)需求，玉米的品種選育逐漸向籽粒高含糖量方向發(fā)展。Robinson 等[1]研究表明，甜玉米籽粒的高含糖量必將降低種子活力，較低的種子活力導(dǎo)致群體冠層生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，無(wú)法應(yīng)對(duì)田間日益激烈的雜草競(jìng)爭(zhēng)。因此，使用除草劑控制田間雜草是甜玉米生產(chǎn)的必然選擇。煙嘧磺隆(nicosulfuron)是一種磺酰脲類(lèi)內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，可通過(guò)植物的根、莖、葉吸收，并經(jīng)木質(zhì)部和韌皮部向上和向下傳導(dǎo)，其通過(guò)抑制敏感性雜草體內(nèi)乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)的活性，阻礙纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等支鏈氨基酸的合成，進(jìn)而抑制細(xì)胞分裂，使雜草紫化、黃化、退綠，最終死亡[2－3]。自1999年，美國(guó)一些地區(qū)批準(zhǔn)煙嘧磺隆作為甜玉米苗后除草劑使用以來(lái)，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了大量甜玉米自交系和雜交種對(duì)煙嘧磺隆安全性的評(píng)估工作[4－5]。研究表明，甜玉米對(duì)煙嘧磺隆表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性，敏感程度依次為普甜型玉米<加強(qiáng)甜型玉米<超甜型玉米[6－7]。甜玉米新品種對(duì)煙嘧磺隆耐藥性的鑒定工作仍在持續(xù)進(jìn)行中。

在自然和環(huán)境壓力條件下，光系統(tǒng)Ⅰ(photosystemⅠ，PSI)、光系統(tǒng)Ⅱ(photosystem Ⅱ，PSⅡ)和線(xiàn)粒體參與的電子傳遞過(guò)程是活性氧(reactive oxygen，ROS)產(chǎn)生的主要場(chǎng)所[8]。煙嘧磺隆可以通過(guò)相同的電子傳遞系統(tǒng)促進(jìn)ROS 的產(chǎn)生，從而加速植物體的生理生化損傷?？寡趸到y(tǒng)在清除植物體內(nèi)ROS 和防止除草劑脅迫引起的植物細(xì)胞損傷方面扮演著重要角色[9－10]。張定一等[11]研究表明，小麥葉片噴施除草劑后，葉片超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性上升，活性氧自由基維持在較低水平，隨生育進(jìn)程推進(jìn)，當(dāng)葉片合成的SOD 不足以將除草劑藥害產(chǎn)生的清除時(shí)，SOD 活性下降，過(guò)氧化物質(zhì)積累增加，細(xì)胞膜系統(tǒng)遭到破壞。同時(shí)，大量研究表明，植物細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS 可以調(diào)控抗氧化系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)[12－13]。Zhang 等[14]研究表明，Cu/Zn-SOD基因在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)煙草植株對(duì)干旱、低溫和氧化脅迫的耐受性。Sytykiewicz[15]研究表明，蚜蟲(chóng)侵染玉米葉片使GR1 和GR2 基因顯著上調(diào)。

在應(yīng)對(duì)各種環(huán)境壓力時(shí)，植株體內(nèi)ROS 的產(chǎn)生、抗氧化酶活性及關(guān)鍵酶基因的調(diào)控已被廣泛報(bào)道。但甜玉米體內(nèi)ROS 的積累、抗氧化系統(tǒng)及其基因家族對(duì)煙嘧磺隆脅迫的響應(yīng)機(jī)制尚鮮有報(bào)道。前期研究表明，在玉米四葉一心期噴施40 g·L－1煙嘧磺隆可分散油懸浮劑(有效成分為36 g·hm－2)時(shí)，導(dǎo)致植物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)失衡，使植物體內(nèi)的氧化壓力不斷加劇[14]。在此基礎(chǔ)上，本研究以對(duì)煙嘧磺隆表現(xiàn)不同耐藥性的一對(duì)甜玉米姊妹系為試材，探究煙嘧磺隆脅迫對(duì)甜玉米幼苗ROS 積累、抗氧化系統(tǒng)及關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響，旨在為增強(qiáng)甜玉米耐藥性，實(shí)現(xiàn)甜玉米高產(chǎn)栽培提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為一對(duì)甜玉米姊妹系HK301 和HK320，由河北科技師范學(xué)院選育，HK301 對(duì)煙嘧磺隆表現(xiàn)為耐藥，HK320 對(duì)煙嘧磺隆表現(xiàn)為敏感。

試驗(yàn)藥劑為40 g·L－1煙嘧磺隆可分散油懸浮劑，日本石原產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2018―2019年，于河北科技師范學(xué)院昌黎縣試驗(yàn)站對(duì)HK301 和HK320 進(jìn)行了2年的田間噴施煙嘧磺隆濃度篩選試驗(yàn)。在玉米四葉一心期，采用背負(fù)式電動(dòng)噴霧器噴施煙嘧磺隆，噴施濃度為0、9、18、36、54、72、90、108、126 和144 g·hm－2。當(dāng)噴施濃度為生產(chǎn)中使用濃度36 g·hm－2時(shí)，耐藥性自交系HK301 幼苗可以正常生長(zhǎng)，敏感自交系HK320 幼苗全部死亡[16]，后續(xù)試驗(yàn)選擇36 g·hm－2為田間噴施煙嘧磺隆濃度。

2019―2020年，于河北科技師范學(xué)院昌黎縣試驗(yàn)站進(jìn)行大田試驗(yàn)和溫室盆栽試驗(yàn)。大田試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3 次重復(fù)，小區(qū)面積36 m2。設(shè)置藥劑噴施濃度定為36 g·hm－2，并以噴施清水為對(duì)照。在玉米四葉一心期時(shí)噴藥，分別在噴藥后0、1、3、5、7 d 采集不同處理的葉片樣品置于液氮中，保存于－80℃冰箱，用于ROS 含量、抗氧化酶活性和非酶類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定。溫室盆栽試驗(yàn)處理設(shè)置與大田試驗(yàn)相同，每個(gè)處理10盆。Liu 等[17]研究表明，噴藥后24 h 是玉米對(duì)除草劑響應(yīng)的最佳時(shí)間，因此，在噴藥24 h 后取樣，用液氮速凍，將樣品保存于－80℃冰箱，用于基因表達(dá)量的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 過(guò)氧化氫含量、超氧陰離子產(chǎn)生速率和丙二醛含量測(cè)定 根據(jù)Jena 等[18]的方法測(cè)定過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)含量；根據(jù)Jiang 等[19]的方法測(cè)定超氧陰離子自由基(superoxide anion，產(chǎn)生速率； 利用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.3.2 抗氧化酶活性測(cè)定 根據(jù)Yu 等[20]的方法測(cè)定SOD 活性；根據(jù)Vaculíkova 等[21]的方法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性；根據(jù)Boominathan 等[22]的方法測(cè)定單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase，MDHAR)活性；根據(jù)Yu 等[23]的方法測(cè)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)和脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase，DHAR)活性；根據(jù)Bian 等[24]的方法測(cè)定谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)活性。

1.3.3 非酶物質(zhì)含量測(cè)定 根據(jù)Queval 等[25]的方法測(cè)定還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)和氧化型谷胱甘肽(glutathione disulfide，GSSG)含量；根據(jù)Gossett等[26]的方法測(cè)定抗壞血酸(ascorbate，ASA)和脫氫抗壞血酸(dehydroascorbate，DHA)含量。

1.3.4 基因表達(dá)量測(cè)定 SOD、 CAT、 APX、MDHAR、DHAR 和GR 酶基因序列通過(guò)www.maizegdb.org 和www.ncbi.nlm.nih.gov/獲得。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列利用Primer Premier 5 設(shè)計(jì)基因引物，在NCBI 上進(jìn)行引物序列比對(duì)，保證其專(zhuān)一性，內(nèi)參基因?yàn)镚ADPH(詳見(jiàn)表1)。采用TaqSYBR? Green qPCR測(cè)試盒(TaKaRa，日本) 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)。采用2－ΔΔCT法計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用 Microsoft Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS 12.0 軟件進(jìn)行方差分析，SigmaPlot 12.5 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性氧積累及脂質(zhì)過(guò)氧化

2.1.2 H2O2含量 由圖1-C 和1-D 可知，HK301 幼苗中的H2O2含量在煙嘧磺隆脅迫1 d 時(shí)與對(duì)照相比無(wú)顯著差異；煙嘧磺隆脅迫3 d 時(shí)，較對(duì)照提高31.51%，差異達(dá)到顯著水平，隨后呈下降趨勢(shì)，并在煙嘧磺隆脅迫5 d 時(shí)分別較對(duì)照顯著降低15.86%和17.24%。HK320 的H2O2含量隨煙嘧磺隆脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈明顯上升的趨勢(shì)；煙嘧磺隆脅迫7 d 時(shí)，HK320 的 H2O2含量達(dá)到最大值，較對(duì)照提高175.09%，差異達(dá)到顯著水平。

2.1.3 MDA 含量 由圖1-E 和1-F 可知，煙嘧磺隆脅迫后，HK301 和HK320 的MDA 含量均較對(duì)照有所增加。但隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，HK320 的MDA 含量持續(xù)增加，而HK301 的MDA 含量則呈下降趨勢(shì)。煙嘧磺隆脅迫1、3 和5 d 時(shí)，HK301 的MDA 含量分別較對(duì)照增加了16.59%、28.47%和42.59%，差異達(dá)到顯著水平。煙嘧磺隆脅迫1、3、5 和7 d 時(shí)，HK320 的MDA含量分別較對(duì)照增加了45.20%、206.54%、181.67%和250.38%，差異達(dá)到顯著水平。

2.2 抗氧化酶活性

2.2.1 SOD、CAT 和APX 活性的變化 由圖2-A 可知，煙嘧磺隆脅迫顯著提高了HK301 的SOD 活性。煙嘧磺隆脅迫1、3 和5 d 時(shí)，HK301 的SOD 活性分別較對(duì)照顯著提高了124.75%、155.16%和60.67%；至煙嘧磺隆脅迫7 d 時(shí)，HK301 的SOD 活性恢復(fù)至對(duì)照水平。由圖2－B 可知，煙嘧磺隆脅迫1 d 時(shí)，HK320 的SOD 活性與對(duì)照無(wú)顯著差異，隨著煙嘧磺隆脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，HK320 的SOD 活性較對(duì)照顯著下降；在煙嘧磺隆脅迫3、5 和7 d 時(shí)，分別較對(duì)照降低47.89%、48.79%和56.15%。

由圖2-C 和2-D 可知，煙嘧磺隆脅迫下，HK301 和HK320 的CAT 活性均在脅迫1 d 時(shí)達(dá)到最大值，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，HK301 的CAT 活性有所下降但仍顯著高于對(duì)照；HK320 的CAT 活性呈持續(xù)下降的趨勢(shì)。在煙嘧磺隆脅迫1、3、5 和7 d 時(shí)，HK301 的CAT 活性分別較對(duì)照顯著提高268.75%、152.47%、173.92%和105.71%。在煙嘧磺隆脅迫1 和3 d 時(shí)，HK320 的CAT 活性分別較對(duì)照顯著提高162.02%和72.33%，煙嘧磺隆脅迫5 d 時(shí)恢復(fù)至對(duì)照水平，脅迫7 d 時(shí)顯著低于對(duì)照。

由圖2-E 和2-F 可知，煙嘧磺隆脅迫3 d 時(shí)，HK301 的APX 活性達(dá)到最大值，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，APX 活性有所下降但始終顯著高于對(duì)照。相比之下，煙嘧磺隆脅迫1 d 時(shí)，HK320 的APX 活性達(dá)到最大值，且顯著高于對(duì)照，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，呈下降趨勢(shì)，至脅迫3 d 時(shí)，HK320 的APX 活性與對(duì)照無(wú)顯著差異，隨后顯著低于對(duì)照，至脅迫5 和7 d 時(shí)，分別較對(duì)照降低37.81%和45.76%。

2.2.2 MDHAR、DHAR 和GR 活性的變化 由圖3-A和3-B 可知，煙嘧磺隆脅迫顯著提高了HK301 的MDHAR 活性。煙嘧磺隆脅迫1、3、5 和7 d 時(shí)，HK301的MDHAR 活性與對(duì)照顯著提高57.63%、91.12%、63.72%、33.24%。而煙嘧磺隆脅迫1 和3 d 時(shí)，HK320 的MDHAR 活性較對(duì)照無(wú)顯著差異；煙嘧磺隆脅迫5 和7 d 時(shí)，HK320 的MDHAR 活性呈下降趨勢(shì)，分別較對(duì)照顯著降低48.80%和50.29%。

由圖3-C 和3-D 可知，煙嘧磺隆脅迫3 d 時(shí)，HK301 的DHAR 活性達(dá)到最大值，隨后呈下降趨勢(shì)，但仍顯著高于對(duì)照。煙嘧磺隆脅迫1 d 時(shí)，HK320 的DHAR 活性達(dá)到最大值，且顯著高于對(duì)照，隨后呈持續(xù)下降趨勢(shì)；煙嘧磺隆脅迫5 和7 d 時(shí)，HK320 的DHAR活分別較對(duì)照顯著降低28.84%和37.69%。

由圖3-E 和3-F 可知，煙嘧磺隆脅迫顯著增加了HK301 的GR 活性。煙嘧磺隆脅迫1、3、5 和7 d 時(shí)，HK301 的GR 活性分別較對(duì)照顯著提高96.34%、277.52%、193.63%和233.02%。HK320 的GR 活性在煙嘧磺隆脅迫1 d 后達(dá)到最大值，之后隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，呈持續(xù)下降的趨勢(shì)。煙嘧磺隆脅迫1 d 時(shí)，HK320 的GR 活性較對(duì)照顯著提高61.23%；脅迫3 和5 d 時(shí)，HK320 的GR 活性與對(duì)照無(wú)顯著差異；脅迫7 d時(shí)，HK320 的GR 活性較對(duì)照顯著降低54.00%。

2.3 抗氧化系統(tǒng)非酶類(lèi)物質(zhì)含量

2.3.1 AsA、DHA 含量及AsA/DHA 比值的變化 由圖4-A 和4-B 可知，煙嘧磺隆脅迫下，HK301 和HK320的AsA 含量均在脅迫1 d 時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。煙嘧磺隆脅迫3 和5 d時(shí)，HK301 的AsA 含量較對(duì)照顯著提高66.61%和44.21%；脅迫7 d 時(shí)，HK301 的AsA 含量與對(duì)照無(wú)顯著差異。煙嘧磺隆脅迫1 d 時(shí)，HK320 的AsA 含量顯著高于對(duì)照；至脅迫5～7 d 時(shí)，HK320 的AsA 含量顯著低于對(duì)照。

由圖4-C 和4-D 可知，煙嘧磺隆脅迫1 和3 d 時(shí)，HK301 的DHA 含量分別較對(duì)照顯著提高96.33%和54.52%，至脅迫5～7 d 時(shí)，下降至對(duì)照水平。隨煙嘧磺隆脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，HK320 的DHA 含量迅速升高，脅迫5 d 時(shí)達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)；其中脅迫1、3、5 和7 d 時(shí)，HK320 的 DHA 含量較對(duì)照分別提高51.02%、96.33%、120.20%和112.85，差異達(dá)到顯著水平。

由圖4-E 和4-F 可知，除煙嘧磺隆脅迫1 d 時(shí)，HK301 的AsA/DHA 比值顯著高于對(duì)照，在其他時(shí)間點(diǎn)，HK301 的AsA/DHA 比值較對(duì)照未發(fā)生明顯改變。HK320 的AsA/DHA 比值隨著煙嘧磺隆脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。煙嘧磺隆脅迫1 d 時(shí)，HK320 的AsA/DHA 比值較對(duì)照未發(fā)生顯著變化；煙嘧磺隆脅迫3～7 d 時(shí)，HK320 的AsA/DHA 比值顯著低于對(duì)照。

2.3.2 GSH、GSSG 含量及GSH/GSSG 比值的變化由圖5-A 和5-B 可知，HK301 的GSH 含量在煙嘧磺隆脅迫3 d 時(shí)達(dá)到最大值，隨后呈下降趨勢(shì)，但仍顯著高于對(duì)照；其中脅迫1、3、5 和7 d 時(shí)，HK301 的GSH 含量分別較對(duì)照顯著提高35.61%、164.95%、113.55%和69.81%。HK320 的GSH 含量在煙嘧磺隆脅迫1 d時(shí)達(dá)到最大值，隨后呈下降趨勢(shì)，且顯著低于對(duì)照；煙嘧磺隆脅迫3、5 和7 d 時(shí)，HK320 的GSH 含量分別較對(duì)照顯著降低18.24%、52.95%和58.66%。

由圖5-C 和5-D 可知，隨著煙嘧磺隆脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，HK301 的GSSG 含量呈持續(xù)上升的趨勢(shì)，在脅迫7 d 時(shí)達(dá)到最大值，且在脅迫1 ～ 7 d 時(shí)，HK301 的GSSG 含量均顯著高于對(duì)照。除脅迫1 d外，HK320 的GSSG 含量在其他時(shí)間點(diǎn)較對(duì)照均未有明顯的改變。

由圖5-E 和5-F 可知，煙嘧磺隆脅迫1 d 時(shí)，HK301 的GSH/GSSG 比值較對(duì)照顯著降低；脅迫3 d 時(shí)，HK301 的GSH/GSSG 比值較對(duì)照顯著提高42. 21%；隨后呈下降趨勢(shì)，且在脅迫的5～7 d 時(shí)顯著低于對(duì)照。HK320 的GSH/GSSG 比值僅在脅迫1 d 時(shí)顯著高于對(duì)照，在脅迫3～7 d 時(shí)均顯著低于對(duì)照。

2.4 抗氧化酶關(guān)鍵基因表達(dá)量

2.4.1 SOD 和CAT 家族基因表達(dá)量的變化 由表2可知，煙嘧磺隆脅迫24 h 時(shí)，相較于各自對(duì)照，HK301的SOD1、SOD3.4 和SOD9 基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，SOD2 基因相對(duì)表達(dá)量輕微下調(diào)，CAT1 和CAT2 基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)；HK320 的SOD1、SOD2 和SOD9基因相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，SOD3.4 基因相對(duì)表達(dá)量輕微上調(diào)，CAT2 基因表達(dá)量顯著下調(diào)。

表2 煙嘧磺隆處理對(duì)甜玉米苗期葉片SOD 和CAT 家族基因表達(dá)量的影響Table 3 Effects of nicosulfuron on the expression level of antioxidant enzymes related genes in the leaves of maize seedling

2.4.2 AsA-GSH 途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的變化 由表3 可知，煙嘧磺隆處理顯著影響AsA-GSH 途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平。煙嘧磺隆脅迫24 h 時(shí)，與各自對(duì)照相比，HK301 的APX1、APX2 和APX4 基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)；而HK320 的APX2、APX3 和APX4 基因相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)。煙嘧磺隆處理顯著提升了HK301 的MDHAR1 和MDHAR2 基因的相對(duì)表達(dá)水平。相比于HK320-CK，HK320 的MDHARs 基因未發(fā)生顯著變化。煙嘧磺隆處理顯著提升了HK320 的DHAR1和DHAR2 基因的相對(duì)表達(dá)水平。相比于各自對(duì)照，HK301 的DHAR1 和DHAR2 基因的表達(dá)水平分別上調(diào)了2.72 和2.63 倍；HK320 的DHAR1 基因相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，DHAR2 基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著變化。兩自交系的GRs 基因也對(duì)煙嘧磺隆處理表現(xiàn)出了強(qiáng)烈響應(yīng)。煙嘧磺隆脅迫后，相比于各自對(duì)照，HK301 的GR1 和GR2 基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)；HK320 的GR1基因顯著上調(diào)，GR2 基因顯著下調(diào)。

表3 煙嘧磺隆處理對(duì)甜玉米苗期葉片AsA-GSH 途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響Table 3 Effects of nicosulfuron on the expression level of antioxidant enzymes related genes in the leaves of maize

3 討論

本研究前期結(jié)果表明，煙嘧磺隆脅迫下敏感性自交系葉片電子傳遞速率降低，PSI 和PSⅡ系統(tǒng)遭到破壞，導(dǎo)致電子傳遞載體過(guò)度還原，使得電子向O2不斷傳遞形成[16]，而可通過(guò)SOD 歧化作用轉(zhuǎn)化為H2O2[27]。本研究結(jié)果表明，煙嘧磺隆脅迫下，相較于耐藥型甜玉米自交系HK301，敏感型甜玉米自交系HK320 的產(chǎn)生速率隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)增加。另外，由于HK320 葉片低水平的SOD 和CAT 活性導(dǎo)致不能被及時(shí)清除，最終轉(zhuǎn)化為大量的H2O2。本研究與Alla等[28]的研究結(jié)果相一致。過(guò)量的H2O2將導(dǎo)致植物體內(nèi)膜脂過(guò)氧化，脂質(zhì)過(guò)氧化誘導(dǎo)植物體內(nèi)MDA 的積累[29－30]。本研究表明，相較于HK301，HK320 葉片中的MDA 含量增加明顯，可見(jiàn)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，HK320內(nèi)體的氧化壓力不斷加劇。

在植物的葉綠體和其他細(xì)胞器中，H2O2能被快速分解轉(zhuǎn)化[31]。在AsA-GSH 代謝途徑中，H2O2經(jīng)APX的催化作用最終轉(zhuǎn)化為H2O[27]。本研究結(jié)果表明，煙嘧磺隆脅迫下，HK320 的APX 活性顯著低于HK301(P<0.05)。Miyaka 等[32]研究表明，植物體內(nèi)的AsA含量缺失或處于較低水平是導(dǎo)致APX 活性不穩(wěn)定的重要因素。煙嘧磺隆脅迫5～7 d 時(shí)，HK320 的AsA 含量顯著低于對(duì)照。推測(cè)HK320 中，低水平的APX 活性可能是由于低水平的AsA 含量造成的。此外，在MDHAR 的催化下，AsA 通過(guò)氧化反應(yīng)形成MDHA，MDHA 通過(guò)歧化作用生成DHA，在DHAR 的催化下，DHA 被還原為AsA[33]。本研究結(jié)果表明，HK320 在煙嘧磺隆脅迫5～7 d 時(shí)DHAR 活性較對(duì)照顯著降低，可能會(huì)導(dǎo)致AsA 穩(wěn)態(tài)改變，最終使AsA/DHA 比值降低。Bartoli 等[34]研究表明，AsA 的再生需要NADPH作為MDHAR 的電子供體，并且AsA 和光合電子傳遞鏈之間存在直接作用，因此，煙嘧磺隆對(duì)光電子傳輸鏈的破壞作用可能是AsA 含量降低的另一重要原因。

谷胱甘肽(GSH)作為一種重要的低分子量抗氧化劑在清除H2O2過(guò)程中具有重要的作用[35]。本研究表明，煙嘧磺隆脅迫下，HK301 的GSH 含量顯著高于對(duì)照，相比之下，HK320 在脅迫3～7 d 時(shí)GSH 含量顯著低于對(duì)照。同時(shí)，HK301 的GR 活性顯著高于HK320，并能維持較高的GSH/GSSG 比值(P< 0.05)?？赡苁怯捎贖K301 中GR 活性的提高加速了GSH 的轉(zhuǎn)化，從而有利于植物體內(nèi)H2O2的清除。

SOD 與超氧化物淬滅為H2O2密切相關(guān)，目前已發(fā)現(xiàn)植物體中存在3 種類(lèi)型的SOD(Cu/Zn、Fe 和Mn SOD)[36]。同時(shí)，研究表明，在干旱、重金屬和高溫等環(huán)境脅迫下會(huì)導(dǎo)致SOD 活性發(fā)生顯著變化[37－39]。本研究中，煙嘧磺隆脅迫下，盡管HK301 的SOD 活性顯著升高，但其3 種亞型的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)煙嘧磺隆脅迫表現(xiàn)出不同的響應(yīng)。煙嘧磺隆脅迫24 h 后，相較于對(duì)照，HK301 的Cu/Zn SOD1、Mn SOD3.4 和Cu/Zn SOD9 基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，F(xiàn)e SOD2 基因相對(duì)表達(dá)量輕微下調(diào)。相比之下，HK320 的Cu/Zn SOD1、Fe SOD2 和Cu/Zn SOD9 基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照顯著下調(diào)，Mn SOD3.4 基因相對(duì)表達(dá)量輕微上調(diào)。大量研究表明，Cu/Zn SOD比Fe SOD和Mn SOD對(duì)植物體內(nèi)氧化應(yīng)激響應(yīng)更為敏感[40]。本研究證明，相較于Fe SOD和Mn SOD，Cu/Zn SOD對(duì)煙磺隆誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)更強(qiáng)。

AsA-GSH 途徑在非生物脅迫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中扮演著重要的角色[41－42]。本研究表明，不同類(lèi)型玉米品種的APXs 基因?qū)熰谆锹√幚泶嬖陧憫?yīng)差異。煙嘧磺隆脅迫24 h，相比各自對(duì)照，HK301 的APX1、APX2 和APX4 基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)；而HK320的APX2、APX3 和APX4 基因相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)。說(shuō)明單獨(dú)的基因在特定的環(huán)境條件下存在響應(yīng)差異。MDHAR 是AsA-GSH 途徑中的第2 種酶，在一系列非生物脅迫中其活性均顯著上調(diào)，在防止植物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)失衡過(guò)程中起到重要作用[43]。本研究表明，與各自對(duì)照相比煙嘧磺隆處理顯著增加了HK301 的MDHAR1 和MDHAR2 基因相對(duì)表達(dá)水平，而HK320 的MDHARs基因相對(duì)表達(dá)水平未發(fā)生顯著變化。說(shuō)明耐藥性自交系HK301 更積極地調(diào)動(dòng)了體內(nèi)的MDHARs基因來(lái)抵抗除草劑誘導(dǎo)的氧化壓力。DHAR過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)植物對(duì)多種氧化壓力的抵抗作用[44]。本研究表明，相比于各自對(duì)照，HK301 的DHAR1 和DHAR2 基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，HK320 的DHAR1 基因顯著下調(diào)，DHAR2 基因未發(fā)生顯著變化，說(shuō)明相較于DHAR2基因，DHAR1 基因在煙嘧磺隆誘導(dǎo)氧化壓力解毒過(guò)程中起到更積極的作用。GR 在調(diào)節(jié)多種非生物脅迫中起重要作用，GR基因的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了植物對(duì)重金屬、鹽和干旱脅迫的耐受性[45－47]。本研究表明，煙嘧磺隆脅迫下，相比于各自對(duì)照，HK301 的GR1 和GR2 基因相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)；HK320 的GR1 基因顯著上調(diào)，GR2 基因顯著下調(diào)?？梢?jiàn)GRs在抵抗煙嘧磺隆脅迫中具有重要作用。

4 結(jié)論

煙嘧磺隆脅迫下，相較于耐藥性品種HK301，敏感性品種HK320 不能將植株體內(nèi)的煙嘧磺隆快速降解，使其誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致HK320體內(nèi)的ROS(和H2O2)積累量顯著增加，引起脂質(zhì)過(guò)氧化；且由于HK320 抗氧化系統(tǒng)的防御能力降低，在抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵酶基因家族的調(diào)控下，HK320 的酶類(lèi)物質(zhì)(SOD、CAT、APX、MDHAR、DHAR 和GR)活性總體顯著下降，非酶類(lèi)物質(zhì)(AsA、DHA、GSH 和GSSG)含量總體顯著降低。本研究結(jié)果證明在不同耐藥性甜玉米品種中，抗氧化酶系統(tǒng)和關(guān)鍵酶基因的表達(dá)對(duì)響應(yīng)除草劑脅迫、清除植株體內(nèi)的ROS 起著重要作用。