二補助育湯對著床障礙小鼠子宮環(huán)氧化酶-2、過氧化物酶體增殖物激活受體δ的影響

申萌萌 劉雁峰 周雨玫 史亞婷 朱慶文

摘要 目的：探討二補助育湯對著床障礙小鼠內(nèi)膜中環(huán)氧化酶-2（COX-2）、過氧化物酶體增殖物激活受體δ（PPARδ）表達(dá)的影響。方法：將C57妊娠小鼠隨機分為空白、模型、阿司匹林、戊酸雌二醇片、二補助育湯高、中、低劑量組，每組8只，吲哚美辛油制備胚胎著床障礙小鼠模型，各組給予相應(yīng)藥物灌胃。妊娠第5天取小鼠子宮，觀察外觀形態(tài)、COX-2、PPARδ基因和蛋白表達(dá)。結(jié)果：模型組小鼠子宮蒼白細(xì)長，串珠樣改變少，且分布稀疏不均。各觀察組小鼠子宮較模型組紅潤，有串珠狀改變，串珠分布增多且不均。模型組COX-2和PPARδ蛋白表達(dá)低于空白組（P<0.05）;各觀察組COX-2蛋白表達(dá)均高于模型組（均P<0.05）。二補助育湯低、高劑量組PPARδ mRNA表達(dá)較模型組、戊酸雌二醇片組明顯增加（P<0.05），阿司匹林組PPARδ mRNA表達(dá)高于二補助育湯中劑量組（P<0.05）;二補助育湯各劑量組PPARδ蛋白表達(dá)高于模型組（P<0.01），其中中劑量組高于戊酸雌二醇片組和阿司匹林組（P<0.05）。結(jié)論：二補助育湯能夠調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜COX-2和PPARδ表達(dá)，提高子宮內(nèi)膜容受性，有利于胚胎著床。

關(guān)鍵詞 二補助育湯;著床障礙;吲哚美辛;小鼠;子宮形態(tài);環(huán)氧化酶-2;過氧化物酶體增殖物激活受體δ;子宮內(nèi)膜容受性

Abstract Objective：To explore the effects of Erbu Zhuyu Decoction on cyclooxygenase-2 （COX-2） and peroxisome proliferators-activated receptors δ （PPARδ） expression in mouse model of embryo implantation dysfunction.Methods：A C57 pregnant mice were randomly divided into a blank group，a model group，an aspirin group，a progynova group，a high-dose，a middle-dose and a low-dose groups，with 8 cases in each group.Embryo implantation dysfunction model was built with indomethacin.Mice in each group were administrated with corresponding medicine.The uteri were excised on 5th day of pregnancy to determine the expression of COX-2 and PPARδ.Results：The uteri in model group showed pale and slender.Beads changed little，and the distribution was sparse and uneven.Compared with the model group，the uterus of mice in each treatment group was rosier，with bead-like changes，and the distribution of beads was increased and uneven.The expression of COX-2 and PPARδ protein in the model group was lower than that in the blank group （P<0.05）; the expression of COX-2 protein in each treatment group was higher than that in the model group （all P<0.05）.The expression of PPARδ mRNA in the low-dose and high-dose groups of Erbu Zhuyu Decoction was significantly higher than that of the model group and estradiol valerate tablets group （P<0.05），and the expression of PPARδ mRNA in the aspirin group was higher than that of the middle-dose Erbu Zhuyu group （P<0.05）.The expression of PPARδ protein in each dose group of Erbu Zhuyu was higher than that of the model group （P<0.01），and the middle dose group was higher than that of estradiol valerate tablets group and aspirin group （P<0.05）.Conclusion：Erbu Zhuyu Decoction could improve endometrial receptivity by regulating COX-2 and PPARδ expression，improve the receptivity of the endometrium and be conducive to embryo implantation.

Keywords Erbu Zhuyu Decoction; Model of embryo implantation dysfunction; Indomethacin; Mouse; Uterus histomorphology; COX-2; PPARδ; Endometrial receptivity

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.009

子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜在特定時期內(nèi)允許胚胎定位、黏附、侵入的復(fù)雜生理過程，是影響輔助生殖技術(shù)成功的重要因素[1-2]。因此，提高子宮內(nèi)膜容受性對增加輔助生殖技術(shù)成功率具有重要意義。二補助育湯是名中醫(yī)肖承悰教授治療子宮內(nèi)膜容受性低經(jīng)驗方[3]，臨床研究示該方藥能增加患者子宮內(nèi)膜血供、糾正血栓前狀態(tài)，提高再次體外受精-胚胎移植的成功率[4-6];實驗研究表明該方通過同源框基因、內(nèi)膜形態(tài)等靶點改善子宮內(nèi)膜容受性[7-8]。

環(huán)氧化酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）是評估子宮內(nèi)膜容受性的重要指標(biāo)，在子宮內(nèi)膜種植窗期呈高表達(dá)[9]，其缺失導(dǎo)致小鼠胚胎植入失敗[10]。過氧化物酶體增殖物激活受體δ（Peroxisome Proliferators-activated Receptors δ，PPARδ）能與COX-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的前列腺素結(jié)合，在胚胎種植過程中發(fā)揮重要作用[11]。因此，本實驗以胚胎著床障礙小鼠為研究對象，研究二補助育湯對COX-2、PPARδ的影響，進(jìn)而探討該方藥改善子宮內(nèi)膜容受性的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取56只SPF級未曾交配、6～8周齡、C57雌性小鼠。20只同周齡雄性小鼠，有生育能力，雌雄小鼠體質(zhì)量分別為（20±2）g、（25±2）g。小鼠由北京維通利華實驗技術(shù)有限公司提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001]。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境，濕度為5%～10%，溫度（22±2）℃，12 h/12 h光照/暗循環(huán)，可以自由獲取食物和飲水。經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批（倫理審批號：16-09）。

1.1.2 藥物 阿司匹林腸溶片（Bayer S.p.A.，意大利，生產(chǎn)批號：H20090078）;戊酸雌二醇片（DELPHARM Lille S.A.S.，法國，生產(chǎn)批號：H20080108）;吲哚美辛油栓（北京雙吉制藥有限公司，生產(chǎn)批號：150407）;補助育湯顆粒劑（由補骨脂、骨碎補、川牛膝等藥物組成），均購置于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院。

1.1.3 試劑與儀器 Anti-COX2/Cyclooxygenase 2（Abcam公司，英國，批號：ab15191）;Anti-PPAR delta（Abcam公司，英國，批號：ab23673）;兔超敏即用型二步法<非生物素>檢測試劑盒[北京中杉金橋公司，貨號：PV-9001（GBI）];SsoAdvancedTM SYBR Green Supermix熒光定量PCR（Bio-Rad公司，美國，貨號：Cat#A5000）。熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國，型號：CFX96）;光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS公司，日本，型號：Olympus BX60）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 雌雄小鼠按2∶1比例于每天16：00進(jìn)行合籠，次日清晨見陰栓者記為妊娠第1天（pd1）。按隨機數(shù)字表法將56只妊娠小鼠，分為空白組、模型組、阿司匹林組、戊酸雌二醇片組、二補助育湯高、中、低劑量組，每組8只。空白組分別于pd3、pd4的9：00、16：00皮下注射0.13 mL麻油，余各組予以吲哚美辛麻油溶劑，制成胚胎著床障礙模型[12-13]。

1.2.2 給藥方法 空白組和模型組每天給予0.5%羧甲基纖維素鈉0.2 mL灌胃，戊酸雌二醇片組按每天0.006 mg/20 g體質(zhì)量灌服，阿司匹林組按每天0.225 mg/20 g體質(zhì)量灌服，二補助育湯低、中、高劑量組分別按0.213 g/20 g體質(zhì)量、0.427 g/20 g體質(zhì)量、0.853 g/20 g體質(zhì)量的濃度灌服，pd1起連續(xù)5 d。pd5下午脫頸處死各組小鼠，裸眼觀察子宮外觀;每組5只小鼠，將子宮縱向剖開，投入10%中性甲醛備免疫組織化學(xué)檢測。各組剩余3只小鼠，無菌條件下取全子宮，-80 ℃凍存，備實時定量PCR檢測。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 子宮外觀形態(tài) 觀察子宮顏色、形態(tài)、胚胎著床情況等。

1.2.3.2 實時定量PCR技術(shù)檢測子宮內(nèi)膜COX-2、PPARδ mRNA表達(dá) 1）提取樣本中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cRNA。2）實時定量PCR檢測COX-2、PPARδ mRNA的表達(dá)。COX-2上游引物：ATCAGACCTTCCTTGTAT。COX-2下游引物：CACACTCATAGTTAAGACA。PPARδ上游引物：GGGTCTGAAGTCTCCAAA。PPARδ下游引物：AAGTTCCGTCAGTCTGTATA。GAPDH上游引物：TCAACGGCACAGTCAAGG。GAPDH下游引物：ACTCCACGACATACTCAGC。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，57 ℃ 20 s。采用2-△△Ct進(jìn)行相對定量分析。

1.2.3.3 免疫組織化學(xué)檢測COX-2、PPARδ蛋白表達(dá) 1）包埋;2）切片、貼片;3）脫蠟，封閉;4）一抗COX-2、PPARδ濃度分別為1∶800、1∶200，4 ℃過夜;5）PBS清洗;6）二抗：PV-9001（GBI），37 ℃，15 min;7）DAB顯色，3～5 min;8）復(fù)染;9）脫水、封片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間比較用方差分析，兩兩比較采用LSD法。COX-2 mRNA采用Kruskal-Wallis H檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮形態(tài)觀察 空白組小鼠宮體紅潤，胚胎著床處宮體局部膨大，串珠狀、充血明顯。模型組小鼠宮體蒼白、細(xì)長，串珠樣改變少、分布稀疏不均。與模型組比較，各觀察組小鼠子宮顏色紅潤，有串珠狀改變，串珠分布增多，且不均勻。見圖1。

2.2 各組小鼠子宮COX-2表達(dá) 模型組小鼠子宮COX-2 mRNA表達(dá)低于空白組，各觀察組表達(dá)均高于模型組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。模型組COX-2蛋白表達(dá)較空白組明顯降低（P<0.05），各觀察組較模型組明顯增加（均P<0.05），各觀察組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖2～4。

2.3 各組小鼠子宮PPARδ表達(dá) 模型組小鼠子宮PPARδ mRNA表達(dá)低于空白組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。二補助育湯低、高劑量組和阿司匹林組PPARδ mRNA表達(dá)明顯高于模型組（P<0.05）;與二補助育湯低劑量組比較，阿司匹林組明顯增高（P<0.05）。與空白組比較，模型組PPARδ蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05），各觀察組較模型組均增加，其中二補助育湯各劑量組與模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。觀察組間，二補助育湯中劑量組PPARδ表達(dá)明顯高于戊酸雌二醇片組和阿司匹林組（P>0.05）。見圖5～7。

3 討論

子宮內(nèi)膜容受性低是臨床疑難雜癥，肖老以經(jīng)驗方二補助育湯治之收效頗佳。肖老認(rèn)為該病的病機主要是腎氣虧虛、心氣不足、胞脈不暢，因此用二補助育湯以“補腎氣、通胞脈”[3]。全方由補骨脂、骨碎補、川牛膝、桑寄生、巴戟天、川續(xù)斷等組成，方中補骨脂、骨碎補并稱“二補”。補骨脂可溫補脾腎、固精縮尿，骨碎補可補腎強骨、活血通絡(luò)，兩藥合用有“補腎、活絡(luò)”并用的寓意，具有補腎助孕、活血通脈的功效。川續(xù)斷、桑寄生為肖老臨床常用藥對，川續(xù)斷有補肝腎、強筋骨功效，桑寄生可補肝腎、通經(jīng)絡(luò)、安胎益血;二藥合用既可補肝腎又可通經(jīng)絡(luò)，使補而不滯，還可固胞安胎。巴戟天溫腎壯陽，可鼓動腎陽、促腎氣化生。川牛膝補腎通絡(luò)活血，并引諸藥下入胞宮。全方整體上調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢-子宮生殖軸，局部上促進(jìn)胞宮胞脈與其他臟經(jīng)間聯(lián)系，改善內(nèi)膜微環(huán)境，利于胚胎著床和發(fā)育。

有研究表明，COX-2和PPARδ在妊娠第4天子宮內(nèi)膜基質(zhì)中的表達(dá)一致，二者協(xié)同表達(dá)提示子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可能存在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，且該信號級聯(lián)參與調(diào)節(jié)著床過程[14]。COX-2是前列腺素生物合成中的限速酶，能夠誘導(dǎo)花生四烯酸向前列腺素轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生前列腺素I2（Prostaglandins I2，PGI2）和E2（Prostaglandins E2，PGE2），PGs能夠調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)[15-16]，促進(jìn)血管生成，在胚胎著床、蛻膜化過程中發(fā)揮作用[17-18]。PPARδ是PGI2細(xì)胞核內(nèi)受體，通過COX-2基因敲除小鼠的體內(nèi)實驗表明，COX-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的PGI2通過PPARδ促進(jìn)胚胎植入[19-20]。可見，三者間形成的信號級聯(lián)對于胚胎植入和早期妊娠維持至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，吲哚美辛制成的胚胎著床障礙小鼠子宮蒼白、細(xì)長，孕體數(shù)目減少且分布稀疏，COX-2和PPARδ表達(dá)均降低。經(jīng)二補助育湯、戊酸雌二醇片、阿司匹林治療后，子宮顏色紅潤、孕體數(shù)目增多，COX-2和PPARδ表達(dá)均增高，尤以二補助育湯組明顯，提示二補助育湯能通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜COX-2和PPARδ表達(dá)，改善子宮內(nèi)膜容受性。

綜上所述，二補助育湯能提高胚胎種植窗期子宮內(nèi)膜COX-2和PPARδ的表達(dá)，從而改善內(nèi)膜容受性，有利于胚胎植入。更深入的機制，有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Karizbodagh MP，Rashidi B，Sahebkar A，et al.Implantation Window and Angiogenesis[J].J Cell Biochem，2017，118（12）：4141-4151.

[2]張新宇，王麗娜，李蓉，等.反復(fù)胚胎種植失敗母體因素分析及治療[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2019，28（9）：1098-1102.

[3]肖承悰，劉雁峰，江媚.“補腎氣，通胞脈”改善子宮內(nèi)膜容受性[J].生殖與避孕，2014，34（7）：595-598.

[4]劉雁峰，江媚，孫天琳，等.二補助育湯對子宮內(nèi)膜容受性影響的臨床研究[J].世界中醫(yī)藥，2012，7（3）：195-197.

[5]申萌萌，劉雁峰，梁嘉玲，等.二補助育湯對反復(fù)體外受精-胚胎移植失敗患者子宮內(nèi)膜超聲學(xué)指標(biāo)的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2019，42（2）：167-170.

[6]申萌萌，劉雁峰，石玥，等.二補助育湯對反復(fù)IVF-ET失敗患者血栓前狀態(tài)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2020，35（9）：4743-4746.

[7]江媚，劉雁峰，王鐵楓，等.二補助育湯對胚泡著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響[J].世界中醫(yī)藥，2016，11（11）：2367-2369.2374.

[8]申萌萌，劉雁峰，孫麗艷，等.二補助育湯對胚胎著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜的形態(tài)學(xué)影響[J].中華生殖與避孕雜志，2017，37（10）：808-814.

[9]Marions L，Danielsson KG.Expression of cyclo-oxygenase in human endometrium during the implantation period[J].Mol Hum Reprod，1999，5（10）：961-965.

[10]Lim H，Paria BC，Das SK，et al.Multiple female reproductive failures in cyclooxygenase 2-deficient mice[J].Cell，1997，91（2）：197-208.

[11]Xu M，Tian YZ，Zhu XJ，et al.Effect of Xianziyizhen Recipe Capsule on PGI2-PPARδ Signaling Pathway in Embryo Implantation Dysfunction Mice[J].Am J Reprod Immunol，2015，73（6）：545-556.

[12]吳云霞，黃光英，龔萍，等.吲哚美辛致小鼠胚泡著床障礙模型的建立[J].中國藥理學(xué)通報，2005，21（3）：373-375.

[13]吳云霞，黃光英.胚泡著床不全的實驗動物模型[J].中國藥理學(xué)通報，2003，19（4）：470-472.

[14]Scherle PA，Ma W，Lim H，et al.Regulation of cyclooxygenase-2 induction in the mouse uterus during decidualization.An event of early pregnancy[J].J Biol Chem，2000，275（47）：37086-37092.

[15]Kaczynski P，Kowalewski MP，Waclawik A.Prostaglandin F2α promotes angiogenesis and embryo-maternal interactions during implantation[J].Reproduction，2016，151（5）：539-552.

[16]Matsumoto H，Ma WG，Daikoku T，et al.Cyclooxygenase-2 differentially directs uterine angiogenesis during implantation in mice[J].J Biol Chem，2002，277（32）：29260-29267.

[17]鄧文波，楊增明.前列腺素在胚胎著床和蛻膜化中的作用[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2008，30（3）：342-346.

[18]Pavlov OV，Niauri DA，Selutin AV，et al.Coordinated expression of TNFα-and VEGF-mediated signaling components by placental macrophages in early and late pregnancy[J].Placenta，2016，42：28-36.

[19]Lim H，Dey SK.PPAR delta functions as a prostacyclin receptor in blastocyst implantation[J].Trends Endocrinol Metab，2000，11（4）：137-142.

[20]Lim H，Gupta RA，Ma WG，et al.Cyclo-oxygenase-2-derived prostacyclin mediates embryo implantation in the mouse via PPARdelta[J].Genes Dev，1999，13（12）：1561-1574.

（2020-06-19收稿 責(zé)任編輯：王明）