孫歡，譚曉璇，屠建波，闞文靜

(1.國家海洋局天津海洋環(huán)境監(jiān)測中心站 天津 300457；2.自然資源部海洋咨詢中心 北京 100161)

0 引言

分光光度法是最常用的定量分析方法之一，具有分析成本低、靈敏度高和操作快速便捷等特點，目前被廣泛應(yīng)用于水環(huán)境監(jiān)測實驗。常用的分光光度法主要包括紫外-可見光分光光度法、紅外分光光度法、熒光分光光度法和原子吸收分光光度法。分光光度法測定水樣中的物質(zhì)含量通常根據(jù)比色液的顏色選用合適光程長度的比色皿:當(dāng)比色液的顏色較淺時，應(yīng)選用光程長度較大的比色皿(如5 cm)；當(dāng)比色液的顏色較深時，應(yīng)選用光程長度較小的比色皿(如1 cm 或2 cm)[1]。一些環(huán)境監(jiān)測類的規(guī)范對分光光度法中比色皿的光程長度進行限定，如《海洋監(jiān)測規(guī)范》規(guī)定熒光分光光度法測定石油類須選用1 cm的比色皿，異煙酸-吡唑啉酮分光光度法測定氰化物須選用3 cm的比色皿，萘乙二胺分光光度法測定海水中亞硝酸鹽氮須選用5 cm的比色皿。

目前對分光光度法中比色皿的研究多集中于比色皿的選用對實驗造成的誤差以及誤差消除等方面[2-8]，也有研究驗證朗伯-比爾定律即探討分光光度法中比色皿的光程長度與吸光值的關(guān)系，但這些研究均未分析比色皿的光程長度與水樣中的物質(zhì)含量測定結(jié)果之間的關(guān)系。本研究以萘乙二胺分光光度法測定海水中亞硝酸鹽氮為例，探索選用不同光程長度的比色皿進行分光光度法實驗測得水樣中物質(zhì)含量的差異性，以期為實際工作和改進實驗方法提供參考。

1 實驗

1.1 基本原理

在酸性介質(zhì)中，亞硝酸鹽與磺胺發(fā)生重氮化反應(yīng)，其產(chǎn)物再與萘乙二胺偶合，顯色生成紅色染料；利用紫外分光光度計，于波長543 nm處測定比色液的吸光值，代入校準(zhǔn)曲線可得水樣中亞硝酸鹽氮的含量。

1.2 儀器設(shè)備和試劑

實驗采用T6新世紀(jì)紫外分光光度計和實驗所需玻璃器皿，配制10 g/L磺胺溶液和1 g/L鹽酸萘乙二胺溶液。選用2種亞硝酸鹽氮標(biāo)準(zhǔn)系列，分別為自然資源部第二海洋研究所的亞硝酸鹽氮標(biāo)準(zhǔn)系列(GBW 08640)和壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心的水中亞硝酸鹽氮標(biāo)準(zhǔn)溶液(BW 20002-1000-W-50)。

1.3 誤差消除

在人員誤差方面，實驗人員操作儀器設(shè)備的熟練程度、測定比色液吸光值的個人習(xí)慣以及樣品比色液與標(biāo)準(zhǔn)比色液處理流程的差異等原因都可能引起實驗的主觀誤差。本實驗的實驗人員具有多年海水營養(yǎng)鹽分析經(jīng)驗，同時嚴(yán)格按照《海洋監(jiān)測規(guī)范第4部分:海水分析》(GB 17378.4—2007)中亞硝酸鹽-萘乙二胺分光光度法的分析步驟進行實驗。

在系統(tǒng)誤差方面，同時選用1 cm、2 cm和5cm的3種光程長度的比色皿，為避免系統(tǒng)誤差，選用校正合格的同一廠家和同一批次的石英比色皿，在測定比色液的吸光值時，分光光度計的比色皿架卡槽寬度應(yīng)與比色皿的光程長度相適應(yīng)。

1.4 實驗方法

1.4.1 差異性驗證實驗

為驗證選用不同光程長度的比色皿進行分光光度法實驗所得水樣中物質(zhì)含量的差異性，采用萘乙二胺分光光度法，分別于8月4日和11月12日進行2個批次的獨立實驗，測定天津近岸海域海水樣品中亞硝酸鹽氮的含量，樣品數(shù)量分別為20個和12個。采用亞硝酸鹽氮標(biāo)準(zhǔn)系列(GBW 08640)作為實驗校準(zhǔn)曲線，曲線各點的含量分別為0 μg/L、7 μg/L、14 μg/L、28 μg/L和56 μg/L。待校準(zhǔn)曲線與水樣顯色穩(wěn)定后，分別選用1 cm、2 cm和5 cm光程長度的比色皿，依次測定校準(zhǔn)曲線各點和水樣的吸光值，計算得到水樣中亞硝酸鹽氮的含量，計算公式為:

隧道下穿處位于黃河沖洪積平原二級階地，地下水位于地面以下16 m～17 m，為孔隙潛水，交叉處地層依次為粉土、粉砂、粉質(zhì)黏土層。場地土層為不液化或可不考慮液化影響。計算分析按現(xiàn)地勘土體參數(shù)及水位。

p=(A-A′-a)/b×14

(1)

式中:p為水樣中亞硝酸鹽氮的含量；A為水樣的吸光值；A′為分析空白的吸光值；a為校準(zhǔn)曲線的截距；b為校準(zhǔn)曲線的斜率。

計算結(jié)果如表1和表2所示。

表1 第一批水樣中亞硝酸鹽氮的含量 μg/L

表2 第二批水樣中亞硝酸鹽氮的含量 μg/L

1.4.2 準(zhǔn)確度對比實驗

以相對誤差作為判定實驗準(zhǔn)確度的依據(jù)。實驗步驟為:①用1 000 mg/L的亞硝酸鹽氮標(biāo)準(zhǔn)溶液(BW 20002-1000-W-50)配制標(biāo)準(zhǔn)系列，其含量分別為0 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、60 μg/L、80 μg/L、100 μg/L、120 μg/L、140 μg/L、160 μg/L和180 μg/L，按照萘乙二胺分光光度法實驗步驟顯色，分別選用1 cm、2 cm和5cm光程長度的比色皿依次測定標(biāo)準(zhǔn)系列各點的吸光值，每個點測量3次，得到亞硝酸鹽氮標(biāo)準(zhǔn)系列的實測吸光值(表3)，并繪制各光程長度比色皿對應(yīng)的校準(zhǔn)曲線；②以已知亞硝酸鹽氮含量為60 μg/L、80 μg/L、100 μg/L、120 μg/L和140 μg/L的水樣作為內(nèi)控樣，經(jīng)上述實驗步驟測定吸光值后，代入相應(yīng)校準(zhǔn)曲線，得到內(nèi)控樣在不同光程長度比色皿測定下的含量實測值；③計算內(nèi)控樣實測值與真值的相對誤差。

表3 亞硝酸鹽氮標(biāo)準(zhǔn)系列的實測吸光值

1.4.3 校準(zhǔn)曲線的不確定度分析實驗

由式(1)可知，對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響的因子即不確定度來源于溫度、水樣和分析空白的吸光值以及校準(zhǔn)曲線的擬合情況。由于實驗已進行過誤差消除，保證相同批次水樣由相同實驗人員在相同實驗條件下測定，水樣和分析空白吸光值的不確定度對于實驗結(jié)果的影響可忽略不計，實驗設(shè)計僅考慮對校準(zhǔn)曲線的影響。實驗步驟同準(zhǔn)確度對比實驗。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 實驗結(jié)果的差異性

由表1和表2可以看出，不同光程長度的比色皿測得的水樣中亞硝酸鹽氮的含量不同，含量由高到低所對應(yīng)的比色皿光程長度依次為1 cm、2 cm和5 cm。為進一步分析不同光程長度的比色皿測得亞硝酸鹽氮含量的差異性，采用Z-score對實驗結(jié)果進行標(biāo)準(zhǔn)化。Z-score是以標(biāo)準(zhǔn)差為尺度，可改變原始指標(biāo)離散程度的信息(圖1和圖2)。

圖1 第一批水樣中亞硝酸鹽氮含量的Z-score

圖2 第二批水樣中亞硝酸鹽氮含量的Z-score

經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化可以看出，不同光程長度比色皿的測定結(jié)果之間存在一定程度的離散，即測定結(jié)果存在差異。其中，1 cm與2 cm比色皿測定結(jié)果的差異性大于5 cm與2 cm比色皿測定結(jié)果的差異性。

(2)

計算結(jié)果如表4所示。

表4 實驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

由表4可以看出，各組數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不小于1%?？梢姰?dāng)實驗選用的比色皿光程長度不同時，測得水樣中的物質(zhì)含量也存在明顯差異。

2.2 實驗結(jié)果的準(zhǔn)確度

經(jīng)不同光程長度的比色皿測定，并將吸光值代入相應(yīng)的校準(zhǔn)曲線得到內(nèi)控樣的實測值，計算內(nèi)控樣實測值與真值的相對誤差:

(3)

式中:δ為相對誤差；Δ為實測值與真值之差；L為真值。

計算結(jié)果如圖3所示。

圖3 相對誤差的實驗結(jié)果

由圖3可以看出，較小光程長度的比色皿測得結(jié)果的相對誤差較小，即實驗的準(zhǔn)確度更高。

2.3 校準(zhǔn)曲線的不確定度

以1 cm比色皿測定的亞硝酸鹽氮標(biāo)準(zhǔn)系列吸光值為例，以各點吸光值的平均值與空白吸光值的差值為縱坐標(biāo)、以亞硝酸鹽氮含量為橫坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線:

y=0.003 2x+0.005 1，R=0.999 7

由此得到校準(zhǔn)曲線的殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差:

式中:S為殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差；yi為xi點的實測吸光值；B為曲線斜率；A為曲線截距；n為測量校準(zhǔn)系列的總次數(shù)，n=30。

同理，2 cm比色皿測定得到的校準(zhǔn)曲線及其殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差為:

y=0.006 4x+0.009 2，R=0.999 5

S2 cm=0.011 64

5 cm比色皿測定得到的校準(zhǔn)曲線及其殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差為:

y=0.015 0x+0.055 9，R=0.999 2

S5 cm=0.036 34

因此，在相同實驗條件下，選用光程長度更小的比色皿測定比色液的吸光值，可使校準(zhǔn)曲線的線性更好。

在校準(zhǔn)曲線擬合的影響下，某水樣經(jīng)實驗所得結(jié)果的不確定度為:

假設(shè)某水樣經(jīng)實驗測定2次吸光值(P=2)，得到其亞硝酸鹽氮的含量為70 μg/L。①若選用1 cm光程長度的比色皿測定，其不確定度為1.44 μg/L；②若選用2 cm光程長度的比色皿測定，其不確定度為1.33 μg/L；③若選用5 cm光程長度的比色皿測定，其不確定度為1.78 μg/L。

3 結(jié)語

本研究采用分光光度法，選用3種光程長度的比色皿測定同一比色液中的物質(zhì)含量。①實驗結(jié)果存在差異，即比色皿的光程長度越小，測得的物質(zhì)含量越高，且1 cm與2 cm比色皿測定結(jié)果之間的差異性大于5 cm與2 cm比色皿測定結(jié)果之間的差異性；②由較小光程長度的比色皿測得結(jié)果的相對誤差較小，實驗的準(zhǔn)確度更高；③在相同實驗條件下測定校準(zhǔn)曲線的吸光值，選用光程長度更小的比色皿的曲線線性更好；④以某水樣中亞硝酸鹽氮的含量為70.0 μg/L為例，若由光程長度分別為1 cm、2 cm和5 cm的比色皿測定，其不確定度分別為1.44 μg/L、1.33 μg/L和1.78 μg/L。

與此同時，本實驗仍存在局限性，如實驗次數(shù)和數(shù)據(jù)量較少、水樣中物質(zhì)含量的區(qū)間較小以及計算校準(zhǔn)曲線的殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差時吸光值的測量次數(shù)較少，應(yīng)在今后的研究中改進。