劉 莉,張 軍，李曉波

漢中市三二〇一醫(yī)院：1.檢驗科；2.微免科，陜西漢中 723000

肺炎是一種常見的感染性疾病，在兒童中的發(fā)病率和病死率較高。2015年，全世界大約有70萬名5歲以下兒童死于肺炎[1]。微小RNA(miRNA)作為一種小型非編碼RNA，通過結(jié)合3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)調(diào)控其下游靶基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、遷移、凋亡以及固有免疫、炎癥和感染等過程[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，大量miRNA在兒童肺炎的炎性損傷中發(fā)揮重要作用[4-6]。肺部感染后，大量促炎性因子的產(chǎn)生可加重肺組織損傷[7]。有研究表明，miR-361-3p在克羅恩病中發(fā)揮重要作用[8]，但其在肺炎中的研究未見報道。本研究通過檢測肺炎患兒血清中miR-361-3p表達(dá)，同時利用脂多糖(LPS)刺激人胚肺成纖維細(xì)胞WI-38構(gòu)建肺炎損傷細(xì)胞模型，采用“敲減-回復(fù)”的研究策略探討miR-361-3p對肺炎中促炎性細(xì)胞因子水平的影響，旨在為臨床肺炎的治療提供新的方向。

1 資料和方法

1.1一般資料 將20例3～5歲的肺炎患兒(女性10例，男性10例)納入研究，患兒均根據(jù)臨床表現(xiàn)、呼吸道癥狀、細(xì)菌感染及胸部影像學(xué)檢查確診為肺炎，來自本院急診科，在采血前未接受任何治療。另外，選取同期在本院進(jìn)行體檢的性別、年齡匹配與納入研究肺炎患兒相匹配的健康兒童作為對照。所有參與研究兒童的合法監(jiān)護人均對本研究知情同意，并簽署知情同意書；研究通過本院倫理委員會審查批準(zhǔn)。

1.2實驗材料 人胚肺成纖維細(xì)胞WI-38購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國武漢)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；LPS、MyD88抗體和GAPDH抗體購自Abcam公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR(qPCR)檢測試劑盒購自Bimake公司；白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Lipofectamine 3000試劑購自Invitrogen公司；一抗稀釋液、SDS試劑盒、PBS購自碧云天公司。miR-361-3p模擬物、抑制物，pcDNA3.1-MyD88質(zhì)粒(oe-MyD88)及各自的陰性對照(NC)由上海Gene Pharma公司合成。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 WI-38細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的DMEM培基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用轉(zhuǎn)染miR-361-3p模擬物或抑制物提高或敲減WI-38細(xì)胞中miR-361-3p的表達(dá)，采用轉(zhuǎn)染oe-MyD88在WI-38細(xì)胞中過表達(dá)MyD88。具體方法如下：將對數(shù)期的2×105個WI-38細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),24 h后換新鮮培基,將50 nmol/L miR-361-3p模擬物、100 nmol/L miR-361-3p抑制物或2～4 μg oe-MyD88質(zhì)粒加入6孔板內(nèi)，同時加入Lipofectamine 3000試劑4.5 μL，培養(yǎng)48 h。細(xì)胞采用5 μg/mL LPS處理72 h，構(gòu)建體外肺炎細(xì)胞模型。miR-361-3p模擬物序列為5′-TTA TCA GAA TCT CCA GGG GTA C-3′,miR-361-3p抑制物序列為5′-AAT GTC TTA GAG GAC CCC ATG-3′。

1.3.2qPCR檢測 收集細(xì)胞，采用Trizol法提取總mRNA，按Bimake逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，獲取cDNA。qPCR反應(yīng)體系的配制：SYBR Premix Ex Taq 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA 2 μL、ddH2O 3.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 20 s預(yù)變性；95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s，共擴增45個循環(huán)。采用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.3ELISA檢測 采集肺炎組和對照組每位兒童的外周靜脈血2 mL，離心取血清作為檢測標(biāo)本；收集經(jīng)LPS處理和未經(jīng)LPS處理(作為對照)的WI-38細(xì)胞上清液作為檢測標(biāo)本。用相應(yīng)的ELISA試劑盒檢測標(biāo)本中的IL-6、TNF-α和IL-1β水平，均按試劑盒操作說明進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品得到線性校準(zhǔn)曲線，進(jìn)行均一化水平計算。

1.3.4Western blot檢測 收集待測細(xì)胞，用PBS洗兩遍，加細(xì)胞裂解液80 μL置冰上裂解30 min，吸取液體，離心收集蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測。取蛋白30 μg上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶3 ℃封閉1 h。MyD88抗體作為一抗按1∶1 000進(jìn)行稀釋，4 ℃孵育過夜。加HRP標(biāo)記的二抗37 ℃避光孵育2 h，PBS-T反復(fù)洗滌，加ECL試劑，采用化學(xué)發(fā)光儀檢測目的蛋白。

1.3.5熒光素酶報告基因試驗 從美國國家生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中下載人MyD88-3′UTR基因序列,采用Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計。將含有miR-361-3p結(jié)合位點的MyD88、3′UTR野生型(WT)或突變型(MuT)片段插入psiCHECK-2載體中。取2×104個WI-38細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染前更換新鮮培基，將脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000與質(zhì)粒及miR-361-3p模擬物溶液混合,共轉(zhuǎn)染至WI-38細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后，用熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1血清miR-361-3p和MyD88在肺炎患兒和健康兒童中的相對表達(dá)水平比較 與健康兒童比較，肺炎兒童血清miR-361-3p相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖1A；與健康兒童比較，肺炎兒童血清MyD88相對表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖1B；與健康兒童相比，肺炎兒童促炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的水平均顯著升高(P<0.05)，見圖1C。

2.2miR-361-3p減輕肺炎炎性損傷的體外模型研究 建立了LPS誘導(dǎo)的體外肺炎模型。在LPS損傷的WI-38細(xì)胞中，miR-361-3p表達(dá)水平比對照細(xì)胞顯著降低(P<0.05)，見圖2A。隨后，采用miR-361-3p模擬物和miR-361-3p抑制物轉(zhuǎn)染W(wǎng)I-38細(xì)胞，用LPS處理后檢測miR-361-3p的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-361-3p模擬物能顯著提高miR-361-3p表達(dá)，miR-361-3p抑制物顯著降低了miR-361-3p的表達(dá)(P<0.05)，見圖2B。ELISA結(jié)果顯示，miR-361-3p模擬物降低了LPS損傷的WI-38細(xì)胞炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的水平(P<0.05)，見圖2C～2E。miR-361-3p抑制物提高了LPS損傷的WI-38細(xì)胞炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的水平(P<0.05)。

2.3miR-361-3p下調(diào)MyD88的表達(dá) 為了探究miR-361-3p調(diào)控兒童肺炎炎性損傷的分子機制，本課題組采用TargetScan Human預(yù)測到MyD88為miR-361-3p的下游靶基因。MyD88基因的3′UTR與miR-361-3p序列互補(圖3A)。采用熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M(jìn)一步確認(rèn)MyD88是否為miR-361-3p的直接靶基因。結(jié)果顯示，在psiCHECK-2-MyD88-野生型中，miR-361-3p模擬物顯著降低了熒光素酶的相對活性，而在psiCHECK-2-MyD88-突變型無明顯變化(圖3B)，表明MyD88是miR-361-3p的直接靶基因。此外，本課題組檢測了經(jīng)LPS處理的WI-38細(xì)胞中miR-361-3p和MyD88表達(dá)的關(guān)系。qPCR和Western Blot結(jié)果顯示，miR-361-3p上調(diào)抑制MyD88 mRNA和蛋白的表達(dá)(圖3C～3E)。

2.4MyD88在體外逆轉(zhuǎn)miR-361-3p在肺炎炎性損傷中的保護作用 為了研究MyD88在miR-361-3p調(diào)控的兒童肺炎炎性損傷中的作用，本課題組檢測了MyD88在經(jīng)LPS處理的WI-38細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示相較于未經(jīng)處理的對照組細(xì)胞，LPS損傷的WI-38細(xì)胞中MyD88表達(dá)水平更高(P<0.05，圖4A)。在WI-38細(xì)胞中過表達(dá)MyD88，MyD88的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05，圖4B)。在過表達(dá)miR-361-3p的WI-38細(xì)胞中增加MyD88的表達(dá)，促炎性因子表達(dá)明顯升高(P<0.05，圖4C～4E)。表明MyD88能在體外逆轉(zhuǎn)miR-361-3p在肺炎炎性損傷中的保護作用。

注：A為qPCR檢測肺炎兒童和健康兒童血清miR-361-3p的相對表達(dá)水平；B為qPCR檢測肺炎兒童和健康兒童血清MyD88的相對表達(dá)水平；C為ELISA檢測肺炎兒童和健康兒童血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的水平；與健康兒童比較，**P<0.01,***P<0.001。

注：A表示LPS誘導(dǎo)的體外肺炎模型中miR-361-3p表達(dá)水平的變化；B表示轉(zhuǎn)染miR-361-3p模擬物或抑制物對WI-38細(xì)胞miR-361-3p表達(dá)水平的影響；C～E分別表示轉(zhuǎn)染miR-361-3p模擬物或抑制物對LPS誘導(dǎo)的體外肺炎模型細(xì)胞IL-6、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平的影響；*表示P<0.05,**表示P<0 .01,***表示P<0.001。

注：A表示miR-361-3p與MyD88的預(yù)測結(jié)合位點；B表示psiCHECK-2載體處理后，轉(zhuǎn)染野生型或突變型miR-361-3p模擬物WI-38細(xì)胞的相對熒光素酶活性檢測；C、D分別表示轉(zhuǎn)染miR-361-3p模擬物或抑制物對LPS誘導(dǎo)的體外肺炎模型細(xì)胞MyD88的mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響；E為肺炎患兒血清中miR-361-3p與MyD88表達(dá)的相關(guān)性(n=20)；**表示P<0.01,***表示P<0.001。

注：A表示LPS誘導(dǎo)的體外肺炎模型中MyD88相對表達(dá)水平的變化；B為WI-38細(xì)胞轉(zhuǎn)染oe-MyD88后對MyD88相對表達(dá)水平的影響；C～E分別為miR-361-3p模擬物轉(zhuǎn)染或聯(lián)合oe-MyD88轉(zhuǎn)染W(wǎng)I-38細(xì)胞對LPS誘導(dǎo)的體外肺炎模型中IL-6、TNF-α和IL-1β表達(dá)水平的影響；**表示P<0.01,***表示P<0.001。

3 討 論

肺炎是指由微生物及理化因素等造成的終末氣道、肺泡及肺間質(zhì)的炎癥。最常見的為革蘭陰性條件致病菌導(dǎo)致的肺炎[9]。兒童肺炎的發(fā)病率較高，且可引起多種嚴(yán)重并發(fā)癥，影響兒童的發(fā)育，甚至導(dǎo)致死亡[10]。促炎性因子如IL-6、IL-1β和TNF-α等的異常表達(dá)被認(rèn)為是導(dǎo)致肺炎加重及發(fā)生并發(fā)癥的主要因素，抑制促炎性因子的表達(dá)，可以減輕肺組織的損傷[11]。

有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在肺炎中發(fā)揮重要作用，miR-141在LPS誘導(dǎo)的WI-38成纖維細(xì)胞的炎性損傷中發(fā)揮保護作用[4]。此外，miR-1247通過靶向趨化因子CC配體抑制LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞急性損傷[12]。而miR-194和miR-20a對兒童肺炎炎性損傷有促進(jìn)作用。有研究報道，miR-361-3p是一種腫瘤調(diào)節(jié)因子，同時與多種其他疾病如強直性關(guān)節(jié)炎和麻風(fēng)有關(guān)[8,13-15]。然而，miR-361-3p在肺部炎癥中的表達(dá)情況尚不清楚，miR-361-3p在肺部炎癥中的異常表達(dá)是否與炎性損傷相關(guān)尚鮮見報道。本研究發(fā)現(xiàn)肺炎兒童血清中miR-361-3p呈顯著低表達(dá)，且miR-361-3p與促炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。為了進(jìn)一步探究miR-361-3p與肺炎的關(guān)系，本課題組采用LPS刺激WI-38細(xì)胞建立體外肺炎模型，結(jié)果顯示，經(jīng)LPS刺激后，WI-38細(xì)胞中miR-361-3p表達(dá)水平降低。而在WI-38細(xì)胞中過表達(dá)miR-361-3p后，再采用LPS刺激，促炎性因子的表達(dá)水平明顯下降，而降低miR-361-3p的表達(dá)，促炎性因子表達(dá)水平增加。這表明miR-361-3p在肺炎患兒中通過抑制促炎性因子的表達(dá)而發(fā)揮保護作用。

MyD88是Toll樣受體(TLR)信號通路的關(guān)鍵連接分子，在疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。MyD88被證實參與炎性肺損傷，包括肺炎。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)MyD88促進(jìn)了通氣性肺損傷和炎癥[16]。同時，SONEGO等[17]發(fā)現(xiàn)MyD88參與了銅綠假單胞菌誘導(dǎo)的肺部感染。本研究中,本課題組發(fā)現(xiàn)MyD88表達(dá)與miR-361-3p負(fù)相關(guān)，并參與了miR-361-3p介導(dǎo)的WI-38細(xì)胞炎性反應(yīng)過程。此外，本課題組發(fā)現(xiàn)MyD88是miR-361-3p的直接靶點。在WI-38細(xì)胞中過表達(dá)MyD88可增加促炎性因子的表達(dá)。結(jié)果提示，miR-361-3p通過調(diào)控MyD88在WI-38細(xì)胞的炎性損傷中起保護作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)增加miR-361-3p的表達(dá)在兒童肺炎的炎性損傷中具有保護作用。進(jìn)一步探究miR-361-3p減輕LPS誘導(dǎo)的WI-38細(xì)胞炎性損傷的機制，可能為兒科肺炎的治療提供新的治療靶點。