王 月， 劉 佳， 陳 閩， 張艷梅， 孫小芹， 杭悅宇， 周廣燦，2，①

〔1. 江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014； 2. 菏澤學院農業(yè)與生物工程學院， 山東 菏澤 274015〕

水芹〔Oenanthejavanica(Bl.) DC.〕為多年生草本植物，水生，不僅是富含維生素、礦質元素和膳食纖維的蔬菜[1]，也是具有降血壓[2-3]、降血脂[3-4]和抗癌[5]功效的藥用植物。江蘇太湖流域作為水芹主產區(qū)之一，擁有大量的、具有早熟和耐寒等優(yōu)良性狀的地方品種，如‘常熟白芹’(‘Changshubaiqin’)、‘蘇州圓葉芹’(‘Suzhouyuanyeqin’)、‘溧陽白芹’(‘Liyangbaiqin’)、‘玉祁紅芹’(‘Yuqihongqin’)、‘江陰青芹’(‘Jiangyinqingqin’)和‘梅南水芹’(‘Meinanshuiqin’)等，均為水芹遺傳育種和品種改良的重要種質資源。

植物遺傳多樣性研究是植物育種和遺傳保護的重要基礎[6]。在分子標記開發(fā)和應用方面，相對于葉綠體DNA和細胞核rDNA，低拷貝核基因具有進化速率更快、含雙親的遺傳物質和積累多個非連鎖位點的潛力等[7-8]優(yōu)勢。近年來，AOX1和MCM5等低拷貝核基因被廣泛用于植物遺傳關系分析[9-11]。

上述地方品種中，‘玉祁紅芹’原產于江蘇無錫和常州一帶，株高40 cm，生長勢強、基部粗壯，低溫時全株葉片變紫紅色，耐寒性強；嫩莖和軟化葉鞘質地柔嫩，纖維少、蛋白質含量高，是水芹雜交育種中常用的、重要的親本材料[12]。由于水芹大部分品種的植株、花和果實形態(tài)相似，通過形態(tài)學鑒別方法難以將‘玉祁紅芹’與其他地方品種有效區(qū)分。隨著生物技術的發(fā)展，分子標記已成為鑒別植物種類的重要輔助手段[13-14]。研究水芹地方品種間的遺傳多樣性以及開發(fā)鑒定‘玉祁紅芹’的分子標記均有助于更好地開發(fā)水芹種質資源。

基于前人研究結果[15-16]，本研究比較了水芹野生種以及‘常熟白芹’、‘蘇州圓葉芹’、‘溧陽白芹’、‘玉祁紅芹’、‘江陰青芹’和‘梅南水芹’6個地方品種中AOX1和MCM5基因的變異特征，并構建了對應的最大似然法(maximum likelihood，ML)遺傳關系樹；此外，結合ISSR-SCAR技術，開發(fā)‘玉祁紅芹’的特異性分子標記，以期為水芹雜交育種中親本選擇和雜交后代優(yōu)勢預測提供分子基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試水芹野生種采自南京中山植物園；6個地方品種采自蘇州市漕湖蔬菜產業(yè)園，包括‘常熟白芹’、‘蘇州圓葉芹’、‘溧陽白芹’、‘玉祁紅芹’、‘江陰青芹’和‘梅南水芹’。每種材料采集8個單株，取幼嫩且無病蟲害的干凈葉片，硅膠干燥后保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 植物總DNA的提取 采用CTAB法提取水芹野生種和地方品種各單株葉片的總DNA，提取的總DNA樣品經檢測后置于-20 ℃保存、備用。

1.2.2AOX1和MCM5基因的PCR擴增 以傘形科胡蘿卜(Daucuscarotavar.sativaHoffm.)的AOX1(DCAR_028361)和MCM5(DCAR_014827)基因作為查詢序列，在水芹轉錄組數(shù)據(jù)庫中搜尋同源序列并在該基因的非保守區(qū)域兩端設計引物。擴增水芹AOX1基因所用上游和下游引物的序列分別為5′-ATGTTGATGCGTCATGGCACT-3′和5′-CGAAGCAAAGTGGTTAACATCTC-3′，擴增水芹MCM5基因序列所用上游和下游引物的序列分別為5′-GCAGTTGCAGTTAGACAGCC-3′和5′-CATCGATGCAGACAACTCCAC-3′。以提取的水芹總DNA為模板進行PCR分析。PCR擴增體系總體積25.0 μL，包括20 ng模板DNA、0.2 μmol·L-1上游和下游引物、1.5 mmol·L-1MgCl2、0.5 mmol·L-1dNTPs、50 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.3)以及1 U高保真PCR聚合酶PrimeSTAR〔寶生物工程(大連)有限公司〕。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s、53 ℃～55 ℃退火45 s、72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經質量體積分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳(2 000 bp DNA Ladder，電壓100 V，電泳0.5 h)后，溴化乙錠(EB)染色，用Tanon 3500全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)觀察、拍照。

1.2.3 擴增產物的克隆、測序及數(shù)據(jù)分析 PCR擴增產物純化后，連接到pMD19-T載體〔寶生物工程(大連)有限公司〕，然后將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經氨芐青霉素抗性平板篩選后，挑取單菌落進行PCR檢驗，將陽性克隆交由上海華大基因生物科技有限公司測序。使用Sequencher 4.5軟件對測序結果進行拼接，通過MEGA5.0軟件對序列進行排序和手動校正。使用MEGA5.0軟件對核苷酸序列及其編碼氨基酸序列的相似性進行分析。用胡蘿卜基因組(https：∥phytozome.jgi.doe.gov)中的AOX1、AOX2a(DCAR_021859)、AOX2b(DCAR_029210)、MCM5和MCM3(DCAR_021877)基因作為外類群，構建ML遺傳關系樹分析各材料間的遺傳關系。每種材料選擇5個單株用于遺傳關系分析。

1.2.4 ‘玉祁紅芹’特異性分子標記的建立

1.2.4.1 ISSR-SCAR特異性條帶的克隆及測序 使用ISSR-880引物(5′-GGAGAGGAGAGGAGA-3′)對6個地方品種8個單株總DNA的混合樣進行擴增，PCR擴增體系和擴增程序同“1.2.2”。PCR擴增產物經質量體積分數(shù)2%瓊脂糖凝膠電泳(2000 bp DNA Ladder，電壓80 V，電泳1.5 h)后，EB染色，用上述凝膠成像分析系統(tǒng)觀察、拍照。選擇在‘溧陽白芹’中擴增出的特異性條帶切膠回收，將回收產物連接到pMD19-T載體，然后將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落進行PCR檢驗，將陽性克隆交由南京銳真生物技術有限公司測序。根據(jù)DNA序列分析結果，設計1對SCAR引物用于后續(xù)反應。

1.2.4.2 ISSR-SCAR標記的驗證 使用上述合成的SCAR引物對6個地方品種所有單株進行特異性驗證。PCR擴增體系總體積20.0 μL，包括20 ng·μL-1模板DNA 1.0 μL、2×Reaction Mix(含20 mmol·L-1Tris-HCl、100 mmol·L-1KCl、3 mmol·L-1MgCl2和400 μmol·L-1dNTPs)10.0 μL、10 mmol·L-1上游和下游引物各0.8 μL以及2.5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.4 μL，最后用雙蒸水補足至20.0 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后于72 ℃延伸8 min。PCR擴增產物的檢測方法同“1.2.2”。

按照上述步驟使用ISSR-836引物(5′-AGAGAGAGAGAGAGAGYA-3′)進一步對‘溧陽白芹’和‘玉祁紅芹’進行特異性條帶的克隆、測序及驗證。

2 結果和分析

2.1 AOX1和MCM5基因變異位點分析

2.1.1AOX1基因變異位點分析 克隆和測序結果顯示：水芹野生種和6個地方品種各單株均可擴增出AOX1基因，野生種擴增出2條條帶，長度分別為1 112和1 305 bp；6個地方品種均擴增出1條條帶，長度為1 305～1 316 bp。其中，編碼區(qū)長度為885 bp。水芹野生種和地方品種中AOX1基因的變異位點見表1，AOX1基因的核苷酸序列及其編碼氨基酸序列的相似性見表2。

結果(表1)顯示：水芹野生種和6個地方品種AOX1基因中共檢測到22個SNP位點和7個插入/缺失(InDel)位點。上述SNP位點和InDel位點在水芹野生種AOX1a和AOX1b基因中的排列模式差異較大，表明已發(fā)生遺傳分化。其中，AOX1b基因與6個地方品種AOX1基因的相似性更高，且變異位點和變異模式也相似。與AOX1b基因相比，AOX1a基因內含子1中有11 bp的插入(318～328位點)。

表1 水芹野生種和地方品種AOX1基因變異位點的比較

結果(表2)顯示：與水芹野生種AOX1a基因相比較，AOX1b基因與6個地方品種AOX1基因的核苷酸序列的相似性無明顯差異，而編碼氨基酸序列的相似性較高，相似性為99.0%～100.0%。不同地方品種間，‘常熟白芹’、‘溧陽白芹’和‘江陰青芹’間AOX1基因的核苷酸序列及其編碼氨基酸序列相似性均較高，分別為99.9%～100.0%和100.0%；‘玉祁紅芹’與‘蘇州圓葉芹’和‘梅南水芹’AOX1基因的核苷酸序列及其編碼氨基酸序列的相似性也較高，分別為99.8%～99.9%和99.7%。

表2 水芹野生種和地方品種AOX1基因的核苷酸序列及其編碼氨基酸序列的相似性1)

2.1.2MCM5基因變異位點分析 克隆和測序結果顯示：水芹野生種和6個地方品種MCM5基因的長度為1 432或1 433 bp。水芹野生種和地方品種中MCM5基因的變異位點見表3，MCM5基因的核苷酸序列及其編碼氨基酸序列的相似性見表4。

表3 水芹野生種和地方品種MCM5基因變異位點的比較

表4 水芹野生種和地方品種MCM5基因的核苷酸序列及其編碼氨基酸序列的相似性1)

結果顯示：水芹野生種和6個地方品種MCM5基因中共檢測到33個SNP位點和1個位于非編碼區(qū)的InDel位點?；贛CM5基因的SNP位點總體可將供試7種水芹材料分為3組，第1組僅包括水芹野生種，第2組包括‘溧陽白芹’、‘玉祁紅芹’和‘江陰青芹’，第3組包括‘常熟白芹’、‘蘇州圓葉芹’和‘梅南水芹’。水芹野生種和6個地方品種MCM5基因的核苷酸序列相似性為99.1%～100.0%，編碼氨基酸序列的相似性達100.0%?？傮w而言，與AOX1基因相比，供試水芹材料的MCM5基因較保守。

2.2 水芹野生種和地方品種間的遺傳關系分析

基于AOX1和MCM5基因構建水芹野生種和地方品種的ML遺傳關系樹見圖1。結果顯示：AOX1基因的ML遺傳關系樹(圖1-A)先分為2個單系遺傳分支，其中，水芹野生種的AOX1a基因組成基部分支Ⅰ，AOX1b基因與6個地方品種的AOX1基因組成分支Ⅱ。單系遺傳分支Ⅱ可進一步分為2個亞支，其中，亞支Ⅱa由水芹野生種的AOX1b基因及‘常熟白芹’、‘溧陽白芹’和‘江陰青芹’的AOX1基因組成，顯示6個地方品種的AOX1基因是野生種AOX1b基因的直系同源基因；亞支Ⅱb由‘蘇州圓葉芹’、‘玉祁紅芹’和‘梅南水芹’的AOX1基因組成。

MCM5基因的ML遺傳關系樹(圖1-B)的主要結構與AOX1基因的ML遺傳關系樹相同，先分為2個分支，水芹野生種的MCM5基因位于遺傳關系樹的基部分支Ⅰ，6個地方品種的MCM5基因組成分支Ⅱ。分支Ⅱ進一步分為2個亞支，但是2個亞支的組成與AOX1基因的遺傳關系樹不同，亞支Ⅱa由‘常熟白芹’、‘蘇州圓葉芹’和‘梅南水芹’組成，亞支Ⅱb由‘溧陽白芹’、‘玉祁紅芹’和‘江陰青芹’組成。

分支上數(shù)據(jù)表示基于1 000次重復的支持率(%)，僅顯示支持率大于50%的數(shù)據(jù)The datums on the branches represent the support rate (%) based on 1 000 repeats， and show the support rate greater than 50% only. WS： 水芹野生種Wild species of Oenanthe javanica (Bl.) DC.； CSBQ： ‘常熟白芹’‘Changshubaiqin’； SZYYQ： ‘蘇州圓葉芹’‘Suzhouyuanyeqin’； LYBQ： ‘溧陽白芹’‘Liyangbaiqin’； YQHQ： ‘玉祁紅芹’‘Yuqihongqin’； JYQQ： ‘江陰青芹’‘Jiangyinqingqin’； MNSQ： ‘梅南水芹’‘Meinanshuiqin’； Dcs： 胡蘿卜Daucus carota var. sativa Hoffm.圖1 基于AOX1(A)和MCM5(B)基因構建的水芹野生種和地方品種的ML遺傳關系樹Fig. 1 ML genetic relationship tree of wild species and local cultivars of Oenanthe javanica (Bl.) DC. based on AOX1 (A) and MCM5 (B) genes

進一步將AOX1和MCM5基因手動拼接，構建水芹野生種和地方品種的ML遺傳關系樹(圖2)。結果顯示：該遺傳關系樹的結構與AOX1基因的遺傳關系樹相似，水芹野生種的AOX1a和MCM5基因拼接后組成分支Ⅰ，分支Ⅱ中‘玉祁紅芹’、‘蘇州圓葉芹’和‘梅南水芹’的AOX1和MCM5基因拼接后組成亞支Ⅱa，野生種的AOX1b和MCM5基因拼接后以及‘常熟白芹’、‘溧陽白芹’和‘江陰青芹’的AOX1和MCM5基因拼接后組成亞支Ⅱb。

分支上數(shù)據(jù)表示基于1 000次重復的支持率(%)，僅顯示支持率大于50%的數(shù)據(jù)The datums on the branches represent the support rate (%) based on 1 000 repeats， and show the support rate greater than 50% only. WS： 水芹野生種Wild species of Oenanthe javanica (Bl.) DC.； CSBQ： ‘常熟白芹’‘Changshubaiqin’； SZYYQ： ‘蘇州圓葉芹’‘Suzhouyuanyeqin’； LYBQ： ‘溧陽白芹’‘Liyangbaiqin’； YQHQ： ‘玉祁紅芹’‘Yuqihongqin’； JYQQ： ‘江陰青芹’‘Jiangyinqingqin’； MNSQ： ‘梅南水芹’‘Meinanshuiqin’； Dcs： 胡蘿卜Daucus carota var. sativa Hoffm.圖2 基于AOX1和MCM5基因拼接后構建的水芹野生種和地方品種的ML遺傳關系樹Fig. 2 ML genetic relationship tree of wild species and local cultivars of Oenanthe javanica (Bl.) DC. based on spliced AOX1 and MCM5 genes

2.3 ‘玉祁紅芹’特異性分子標記的建立

基于ISSR-880引物水芹地方品種的PCR擴增結果及特異性片段的序列和SCAR引物位點見圖3。結果顯示：基于ISSR-880引物，‘溧陽白芹’擴增出長度約900 bp的特異性條帶(圖3-A)，將該特異性條帶切膠回收、克隆測序，得到長度為1 148 bp的序列(圖3-B)。根據(jù)該序列設計第1對SCAR引物3-880-F(5′-GGAAGAGTTTAGGTAAGACTTTCTCG-3′)和3-880-R(5′-GGTTGTAAAAGGTTACACTGATGC-3′)，分別對應‘溧陽白芹’特異性片段全序列的50～75及1 096～1 119位點。

M： 2 000 bp DNA Ladder； 1： ‘常熟白芹’‘Changshubaiqin’； 2： ‘蘇州圓葉芹’‘Suzhouyuanyeqin’； 3： ‘溧陽白芹’‘Liyangbaiqin’； 4： ‘玉祁紅芹’‘Yuqihongqin’； 5： ‘江陰青芹’‘Jiangyinqingqin’； 6： ‘梅南水芹’‘Meinanshuiqin’. 箭頭示特異性條帶The arrow shows the specific band. 下劃線示SCAR引物位點The underlines show SCAR primer sites.圖3 基于ISSR-880引物水芹地方品種的PCR擴增結果(A)及特異性片段的序列和SCAR引物位點(B)Fig. 3 PCR amplification result of local cultivars of Oenanthe javanica (Bl.) DC. based on ISSR-880 primer (A) and sequence of specific fragment and SCAR primer sites (B)

采用上述SCAR引物對6個地方品種的所有單株進行驗證，結果見圖4。結果顯示：‘溧陽白芹’和‘玉祁紅芹’的8個單株中均擴增出1條清晰的、長度為1 069 bp的條帶，其他4個地方品種的所有單株中均未擴增出該特異性條帶。

M： 2 000 bp DNA Ladder； 1-8： ‘常熟白芹’‘Changshubaiqin’； 9-16： ‘蘇州圓葉芹’‘Suzhouyuanyeqin’； 17-24： ‘溧陽白芹’‘Liyangbaiqin’； 25-32： ‘玉祁紅芹’‘Yuqihongqin’； 33-40： ‘江陰青芹’‘Jiangyinqingqin’； 41-48： ‘梅南水芹’‘Meinanshuiqin’.圖4 基于第1對SCAR引物水芹地方品種單株的擴增結果Fig. 4 Amplification result of individuals of local cultivars of Oenanthe javanica (Bl.) DC. based on the first pair of SCAR primers

為了進一步區(qū)分‘溧陽白芹’和‘玉祁紅芹’，采用ISSR-836引物進行擴增，將‘玉祁紅芹’長度約500 bp的特異性條帶(圖5-A)切膠回收、克隆測序，得到長度為514 bp的序列(圖5-B)。根據(jù)該序列設計第2對SCAR引物4-836-F(5′-ATGAAGCAGAGGAAGAGACATTC-3′)和4-836-R(5′-ACTACCCTCTTTACCTCTGATGTAC-3′)，分別對應‘玉祁紅芹’特異性片段全序列的45～67和448～472位點。

采用這對SCAR引物對‘玉祁紅芹’和‘溧陽白芹’的所有單株進行驗證，結果見圖6。結果顯示：‘玉祁紅芹’8個單株均可擴增出1條清晰的、長度為428 bp的條帶，而‘溧陽白芹’8個單株均未擴增出該特異性條帶。

M： 2 000 bp DNA Ladder； 1： ‘溧陽白芹’‘Liyangbaiqin’； 2： ‘玉祁紅芹’‘Yuqihongqin’. 箭頭示特異性條帶The arrow shows the specific band. 下劃線示SCAR引物位點The underlines show SCAR primer sites.圖5 基于ISSR-836引物水芹地方品種‘溧陽白芹’和‘玉祁紅芹’的PCR擴增結果(A)及特異性片段的序列和SCAR引物位點(B)Fig. 5 PCR amplification result of local cultivar ‘Liyangbaiqin’ and ‘Yuqihongqin’ of Oenanthe javanica (Bl.) DC. based on ISSR-836 primer (A) and sequence of specific fragment and SCAR primer sites (B)

M： 2 000 bp DNA Ladder； 1-8： ‘溧陽白芹’‘Liyangbaiqin’； 9-16： ‘玉祁紅芹’‘Yuqihongqin’.圖6 基于第2對SCAR引物水芹地方品種‘溧陽白芹’和‘玉祁紅芹’單株的擴增結果Fig. 6 Amplification result of individuals of local cultivar ‘Liyangbaiqin’ and ‘Yuqihongqin’ of Oenanthe javanica (Bl.) DC. based on the second pair of SCAR primers

3 討 論

3.1 水芹地方品種間AOX1和MCM5基因的變異

本研究基于低拷貝核基因AOX1和MCM5進行擴增，在水芹野生種的所有單株中均擴增出長度分別為1 112(AOX1a)和1 305 bp(AOX1b)的2條條帶，而在6個地方品種的所有單株中僅擴增出1條條帶，長度為1 305～1 316 bp。為了明確品種間存在的差異，本研究對堿基變異位點、插入/缺失(InDel)分析以及核苷酸序列和編碼氨基酸序列進一步比對，結果表明：水芹6個地方品種的AOX1基因是AOX1b基因的直系同源基因，而其旁系同源基因AOX1a可能在水芹馴化過程中丟失。此外，AOX1a和AOX1b基因的主要區(qū)別在于AOX1a基因內含子1中有11 bp的插入，這些變異位點可能通過調控轉錄和選擇性剪接過程影響植物基因的表達[17-21]，從而造成不同品種的表型差異。

本研究擴增的MCM5基因位于E6-E10區(qū)域，該區(qū)域對應的蛋白質結構域可與MCM2、MCM3、ORC2L、ORC6L和STAT1等染色質蛋白因子結合組成DNA復制起始復合體[16，22-23]。該MCM5基因中共有33個SNP位點，其中有3個SNP位點位于編碼區(qū)，且均為同義突變。AOX1蛋白參與應激反應[15]，MCM5蛋白參與DNA復制[16]，與AOX1基因相比，MCM5基因比較保守，這可能是2個基因編碼蛋白的功能不同，受到的選擇壓力也不同所致。

3.2 水芹地方品種間的遺傳關系

在基于AOX1基因構建的ML遺傳關系樹上，‘常熟白芹’、‘溧陽白芹’和‘江陰青芹’3個地方品種聚為一個亞支，‘蘇州圓葉芹’、‘梅南水芹’和‘玉祁紅芹’3個地方品種聚為另一個亞支，這2個亞支組成的分支與水芹野生種AOX1a基因所在分支之間的支持率較高，因此，該遺傳關系樹穩(wěn)定、可靠。盡管低拷貝核基因遵守雙親遺傳方式且能提供大量信息位點，可用于研究低等分類階元之間的系統(tǒng)發(fā)育關系，但是不同的低拷貝核基因在物種演化過程中所受的演化壓力不同，因此，篩選合適的低拷貝核基因是構建低等分類階元之間穩(wěn)定系統(tǒng)發(fā)育關系的重要前提。

3.3 ‘玉祁紅芹’的特異性標記

太湖流域的水芹地方品種中，‘玉祁紅芹’具有許多優(yōu)良品質。目前，僅通過形態(tài)觀察將‘玉祁紅芹’與其他地方品種進行區(qū)分，存在一定的局限性，不利于種質資源的保護和利用。在開發(fā)‘玉祁紅芹’特異性分子標記的過程中發(fā)現(xiàn)，水芹地方品種間差異較小，分子標記開發(fā)存在難度。本研究基于ISSR-SCAR標記開發(fā)了兩步法鑒別‘玉祁紅芹’的特異性位點PCR分子標記，該方法先基于ISSR-880引物擴增得到‘溧陽白芹’的特異性片段，設計的第1對SCAR引物將‘溧陽白芹’和‘玉祁紅芹’與其他4個地方品種區(qū)分開，再基于ISSR-836引物擴增得到‘玉祁紅芹’特異性片段，設計的第2對SCAR引物將‘玉祁紅芹’與‘溧陽白芹’區(qū)分開。與傳統(tǒng)的基于形態(tài)、理化指標或非特異性分子標記相比，該標記具有準確性高、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定、可靠的優(yōu)點。‘玉祁紅芹’特異性分子標記的開發(fā)為其他優(yōu)質水芹地方資源的種質鑒定、保存和創(chuàng)新利用提供了理論依據(jù)和指導意義。