王俊淇,李婷婷,劉佳宜,謝晶,林洪,勵(lì)建榮*

1(渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧 錦州,121013) 2(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 大連,116600) 3(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306) 4(中國海洋大學(xué) 食品學(xué)院,山東 青島,266100)

群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)是指細(xì)菌基于基因的表達(dá),通過細(xì)胞間通訊系統(tǒng)協(xié)調(diào)細(xì)菌-細(xì)菌的相互作用和與高等生物的聯(lián)系[1]。細(xì)菌利用分泌的信號(hào)分子感應(yīng)周圍環(huán)境變化,當(dāng)其自身產(chǎn)生的信號(hào)分子分泌量或者感知外界信號(hào)分子濃度達(dá)到一定閾值時(shí),將會(huì)引發(fā)細(xì)菌QS相關(guān)基因的表達(dá),造成細(xì)菌某些生物行為的改變,如生物被膜的形成、毒力因子的表達(dá)等[2]。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(acyl-homoserine lactones,AHLs)和自誘導(dǎo)肽2(AI-2)等小分子在細(xì)菌細(xì)胞中作為信號(hào)分子調(diào)控細(xì)菌的發(fā)病機(jī)制[3],這些信號(hào)分子也參與細(xì)菌的各種生理過程。其中,革蘭氏陰性菌主要分泌的信號(hào)分子為AI-1型信號(hào)分子。

群體感應(yīng)抑制劑(quorum sensing inhibitors,QSIs)是一種能夠特異性干擾細(xì)菌細(xì)胞間通信,且不會(huì)對(duì)細(xì)菌正常生長產(chǎn)生抑制作用的物質(zhì)。牛慧超[4]報(bào)道了1,10癸二醇能夠作為QSI干擾殺鮭氣單胞菌的QS現(xiàn)象,同時(shí)可降低其腐敗活性。張寧[5]利用紫色桿菌(Chromobacteriumviolaceum026,CV026)驗(yàn)證了茶多酚的QSI活性,并進(jìn)一步證實(shí)了其對(duì)肺炎克雷伯菌群體感應(yīng)和毒力因子的影響。丁婷等[6]報(bào)道了米曲霉源環(huán)二肽對(duì)熒光假單胞菌QS現(xiàn)象的抑制作用,并表明其作用機(jī)制可能是由于環(huán)二肽能夠結(jié)合熒光假單胞菌LuxⅠ蛋白,從而降低熒光假單胞菌的信號(hào)分子生成能力,進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)基因表達(dá)量降低。與傳統(tǒng)的食品保鮮劑相比,QSIs以食品腐敗菌QS系統(tǒng)為靶點(diǎn),通過干擾QS系統(tǒng)從而達(dá)到保鮮的目的。因此,利用QSIs作為食品保鮮劑是目前有效抑制食品腐敗的一種新型策略。

微生物是造成水產(chǎn)品腐敗的主要原因。在不同情況的水產(chǎn)品腐敗過程中,部分致腐能力強(qiáng)的微生物將會(huì)參與整個(gè)腐敗過程,這種微生物被稱作特定腐敗菌[7]。因魚類地域廣闊、品種繁多、處理方式不同等,其特定腐敗菌也不盡相同。氣單胞菌 (Aeromonasspp.) 是引發(fā)人畜共患胃腸炎和敗血癥的條件致病菌之一[8],屬于革蘭氏陰性菌,廣泛存在于海水、池塘等水生環(huán)境中[9]。同時(shí)氣單胞菌屬在生鮮魚類的貯藏過程中展現(xiàn)出致腐能力,其分泌的AHLs類信號(hào)分子具有調(diào)控毒力基因表達(dá)的能力[10]。殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)導(dǎo)致的疾病是虹鱒、大西洋鮭等鮭科魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中造成損失的主要因素之一[11]。葛陽楊等[12]研究證明殺鮭氣單胞菌具有QS現(xiàn)象,能夠通過自身分泌AHLs調(diào)控QS相關(guān)基因的表達(dá)。

脫氫乙酸鈉是一種新型的食品保鮮劑,在禽畜肉制品、水產(chǎn)品、果蔬類食品以及飲料中應(yīng)用廣泛[13]。其性質(zhì)穩(wěn)定,添加后不會(huì)對(duì)食品風(fēng)味造成影響,且對(duì)人體無毒副作用。能抑制或殺死食品中的酵母菌、霉菌等微生物,從而有效延長食品貨架期[14]。雖然脫氫乙酸鈉應(yīng)用廣泛,但是目前作為QSI的研究鮮有報(bào)道,故本研究以脫氫乙酸鈉作為QSI,研究其在亞抑菌濃度下對(duì)殺鮭氣單胞菌QS現(xiàn)象的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

紫色桿菌CV026是1株生物報(bào)告菌株,本身不會(huì)產(chǎn)生AHLs,當(dāng)該菌株遇到短鏈的AHLs(C4-HSL～C8-HSL)時(shí),會(huì)產(chǎn)生紫色菌素,通過這種現(xiàn)象可檢測(cè)AHLs產(chǎn)生。其對(duì)卡那霉素具有抗性,使用過程中應(yīng)添加卡那霉素至終質(zhì)量濃度為20 mg/mL。殺鮭氣單胞菌,分離自海鱸魚,上述2種菌株均由渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院保藏。

脫氫乙酸鈉(純度99%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LB肉湯、LB營養(yǎng)瓊脂,青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；正丁醇、冰乙酸、濃硫酸、乙酸異戊酯、苯酚,天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、卡那霉素,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；結(jié)晶紫,天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；脫脂奶粉,美國BD公司；瓊脂粉、蛋白胨、胰蛋白胨、D(+)-葡萄糖,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；NaCl,天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司；鋅片,上海邁砷化工有限公司；AHLs信號(hào)分子(C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL),美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

W-CJ-2FD超凈工作臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；LRH系列生化培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司；MS105UD電子分析天平,瑞士梅特勒-托利儀器有限公司；Czone系列抑菌圈測(cè)定及菌落計(jì)數(shù)儀,杭州迅數(shù)科技有限公司；Imark酶標(biāo)儀,美國BIO-RAD公司；Biofuge Stratos冷凍高速離心機(jī),美國Thermo Fisher公司；SS-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡,日本日立公司；7890 N/5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脫氫乙酸鈉的最小抑菌濃度測(cè)定及QS抑制效果

參照吳雅萍等[15]的方法略加修改。利用牛津杯法測(cè)定脫氫乙酸鈉的最小抑菌質(zhì)量濃度。將菌種CV026和殺鮭氣單胞菌分別接種于LB肉湯中進(jìn)行活化,接種比例為1∶100(體積比),28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)。連續(xù)活化2次后,將活化好的菌液接種于LB營養(yǎng)瓊脂中混勻后倒板,用牛津杯打孔。待其凝固后,將不同質(zhì)量濃度(1.0～5.0 mg/mL)的脫氫乙酸鈉溶液分別取200 μL加入孔中,于28 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h,觀察菌株的變化情況,并記錄抑菌圈直徑大小。以添加去離子水作為空白對(duì)照。

將菌種CV026以1∶100(體積比)的比例接種于LB肉湯中進(jìn)行活化,28 ℃,160 r/min搖床培養(yǎng)。連續(xù)活化2次后,將活化好的菌液接種于LB營養(yǎng)瓊脂中,并添加C6-HSL信號(hào)分子混勻后倒板,待其凝固后牛津杯打孔。將不同質(zhì)量濃度(0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL)的脫氫乙酸鈉溶液分別取200 μL加入孔中,置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h,觀察菌株的變化情況,并記錄抑菌圈的大小。以去離子水作為空白對(duì)照。

1.3.2 脫氫乙酸鈉對(duì)CV026紫色菌素產(chǎn)量的影響

參照孔凡棟等[16]的方法：將菌種CV026以體積比1∶100接種于LB肉湯中進(jìn)行活化,28 ℃,160 r/min搖床培養(yǎng)。連續(xù)活化2次后,將殺鮭氣單胞菌以1∶100(體積比)的比例接種于含有終質(zhì)量濃度為0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL脫氫乙酸鈉的LB肉湯,并且添加C6-HSL信號(hào)分子繼續(xù)搖床培養(yǎng)。另外,設(shè)立不添加信號(hào)分子的實(shí)驗(yàn)組,驗(yàn)證脫氫乙酸鈉對(duì)CV026生長的影響。培養(yǎng)完成后取300 μL培養(yǎng)后的菌液于離心管,加入150 μL 100 mg/mL SDS溶液,振蕩15 s,而后加入600 μL正丁醇振蕩,提取10 s。而后于8 000 r/min離心10 min,吸取200 μL的上清液于96孔板中,并于波長595 nm下測(cè)定OD值。以去離子水為空白對(duì)照。

1.3.3 脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌運(yùn)動(dòng)性的影響

將殺鮭氣單胞菌按體積比1∶100接種于LB肉湯中進(jìn)行活化,28 ℃,160 r/min搖床培養(yǎng)。參照趙龍華等[17]的方法配制群集與泳動(dòng)培養(yǎng)基,并在其中添加過濾后的脫氫乙酸鈉溶液,使其終質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL,混勻倒板。待凝固后,取5 μL連續(xù)活化后的殺鮭氣單胞菌菌液打在含有不同質(zhì)量濃度脫氫乙酸鈉的群集與泳動(dòng)培養(yǎng)基上,風(fēng)干后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,測(cè)量其直徑大小。分別以添加去離子水和C12-HSL為空白和陽性對(duì)照。

1.3.4 脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌胞外蛋白酶活性的影響

參照LEE等[18]的方法,將殺鮭氣單胞菌按體積比1∶100接種于LB肉湯中進(jìn)行活化,28 ℃,160 r/min搖床培養(yǎng)。連續(xù)活化2次后,添加過濾后的脫氫乙酸鈉溶液使其終質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL,繼續(xù)搖床培養(yǎng)48 h。配制牛奶瓊脂固體培養(yǎng)基并倒板,用預(yù)先滅菌的牛津杯打孔,待其凝固后,吸取200 μL上述菌液過濾于孔中。平板置于培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)過程中觀察菌株的變化情況,并測(cè)量其透明菌圈的大小。分別以添加去離子水和C12-HSL為空白和陽性對(duì)照。

1.3.5 脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌生物被膜形成率的影響

參照WEI等[19]的方法,將殺鮭氣單胞菌按體積比1∶100接種于LB肉湯中進(jìn)行活化,28 ℃,160 r/min搖床培養(yǎng)。連續(xù)活化2次后,添加經(jīng)濾膜過濾后的脫氫乙酸鈉溶液使其終質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL。并分裝于1.5 mL無菌離心管中,每管1 mL,每組重復(fù)3次,靜置培養(yǎng)48 h。取上清液測(cè)定菌液密度后,棄上清液,無菌水沖洗3～5次,并干燥40 min。取1 mL 1 mg/mL的結(jié)晶紫溶液染色20 min。棄結(jié)晶紫染液,用無菌水沖洗至干凈透明。用體積分?jǐn)?shù)為33%的冰乙酸溶解。取200 μL溶解后的冰乙酸混合液加入96孔板測(cè)定吸光度。分別以添加去離子水和C12-HSL為空白和陽性對(duì)照。按公式(1)計(jì)算生物被膜相對(duì)形成率：

(1)

式中：OD595(處理組),脫氫乙酸鈉處理后的生物被膜的吸光度值；OD595(空白對(duì)照組),添加去離子水后的生物被膜吸光度值。

1.3.6 脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌生物被膜形態(tài)的影響

參照趙朵等[20]的方法,將鋅片剪裁成邊長為10 mm的正方形,并用拋光機(jī)拋光后置于無水乙醇和去離子水中超聲清洗30 min,烘干后滅菌備用。將連續(xù)活化2次后的菌液與經(jīng)濾膜過濾后的脫氫乙酸鈉溶液混合,使其終質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL,并置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。將滅菌后的鋅片浸沒其中,常溫放置72 h,取出鋅片,無菌水清洗至完全除掉菌液,放入預(yù)先于冰箱中預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液中浸泡4 h,取出鋅片后用體積分?jǐn)?shù)分別為50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫,最后經(jīng)乙酸異戊酯置換2次后用無菌風(fēng)干燥固定。噴金處理后利用掃描電子顯微鏡觀察生物被膜形態(tài)。

1.3.7 脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌AHLs產(chǎn)量的影響

參照孫曉佳等[21]的方法。AHLs粗提液制備：將殺鮭氣單胞菌按體積比1∶100接種于LB肉湯中進(jìn)行活化,28 ℃,160 r/min搖床培養(yǎng)。連續(xù)活化2次后,添加脫氫乙酸鈉使其終質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL,繼續(xù)搖床培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)好的菌液10 000 r/min離心15 min,取上清液。加入相同體積0.1%冰乙酸酸化后的乙酸乙酯提取液提取,并在提取液中加入一定量的無水硫酸鈉。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑,蒸發(fā)后的殘留物用1 mL甲醇進(jìn)行溶解,置于-20 ℃保存。分別以添加去離子水和C12-HSL為空白和陽性對(duì)照。

GC-MS測(cè)定：以甲醇為溶劑制備6種AHLs標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液,通過GC-MS測(cè)定各類AHLs的保留時(shí)間,而后測(cè)定上述提取AHLs粗提液的保留時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫氫乙酸鈉最小抑菌質(zhì)量濃度測(cè)定及QS抑制效果

通過菌株生長情況可以觀察到脫氫乙酸鈉對(duì)CV026和殺鮭氣單胞菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為2 mg/mL。在此濃度下殺鮭氣單胞菌的生長并不會(huì)受到抑制。綜合考慮,選取亞抑菌質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL。試驗(yàn)中選取脫氫乙酸鈉質(zhì)量濃度為0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL進(jìn)行后期試驗(yàn)。圖1為亞抑菌濃度下脫氫乙酸鈉對(duì)CV026產(chǎn)生紫色菌素的抑制作用。由圖1可知,加入脫氫乙酸鈉水溶液的處理孔周圍有白色不透明抑制圈出現(xiàn),初步表明在CV026生長沒有受到抑制的前提下,脫氫乙酸鈉能抑制CV026產(chǎn)生紫色菌素。這說明了脫氫乙酸鈉能干擾報(bào)告菌株CV026的QS系統(tǒng),進(jìn)而影響紫色菌素的產(chǎn)量。

1-脫氫乙酸鈉(2 mg/mL)；2-去離子水圖1 脫氫乙酸鈉對(duì)CV026產(chǎn)生紫色菌素的抑制活性Fig.1 Inhibitory activity of sodium dehydroacetate against violacein production in CV026

2.2 脫氫乙酸鈉對(duì)CV026紫色菌素產(chǎn)量的影響

通過酶標(biāo)法測(cè)定了不同質(zhì)量濃度脫氫乙酸鈉對(duì)菌株CV026紫色菌素產(chǎn)量的影響(圖2)。隨著脫氫乙酸鈉質(zhì)量濃度的增加,紫色菌素的產(chǎn)量逐漸下降,而對(duì)CV026的菌液密度幾乎沒有影響。與空白對(duì)照相比,脫氫乙酸鈉質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時(shí),紫色菌素的產(chǎn)量下降近63.39%。結(jié)果表明,在亞抑菌質(zhì)量濃度下,脫氫乙酸鈉是通過干擾CV026的QS系統(tǒng)從而抑制CV026產(chǎn)生紫色菌素的能力。

圖2 不同質(zhì)量濃度脫氫乙酸鈉對(duì)CV026產(chǎn)紫色菌素 和菌液密度的影響Fig.2 The effect of sodium dehydroacetate on the production of violacein and bacterial density of CV026 strain

2.3 脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌運(yùn)動(dòng)性的影響

圖3、4表明不同質(zhì)量濃度的脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌的群集和泳動(dòng)的影響。隨著脫氫乙酸鈉質(zhì)量濃度的增加,菌群的遷移直徑會(huì)逐漸減少?？梢耘袛鄽Ⅴq氣單胞菌的運(yùn)動(dòng)能力與脫氫乙酸鈉質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān),當(dāng)脫氫乙酸鈉終質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時(shí),殺鮭氣單胞菌的群集和泳動(dòng)能力分別下降了82.76%和73.41%。說明在亞抑菌質(zhì)量濃度情況下,殺鮭氣單胞菌的運(yùn)動(dòng)能力微弱。當(dāng)添加C12-HSL信號(hào)分子時(shí),殺鮭氣單胞菌遷移直徑明顯增加。渠宏雁等[22]報(bào)道了抑制劑抑制副溶血弧菌的群集與泳動(dòng)的現(xiàn)象。

a-群集平板圖;b-遷移直徑 1-C12-HSL；2-去離子水；3-0.4 mg/mL； 4-0.8 mg/mL；5-1.2 mg/mL；6-1.6 mg/mL圖3 脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌群集的影響Fig.3 The effect of sodium dehydroacetate on swarming motility of A.salmonicida

a-群集平板圖;b-遷移直徑 1-C12-HSL；2-去離子水；3-0.4 mg/mL；4-0.8 mg/mL； 5-1.2 mg/mL；6-1.6 mg/mL圖4 脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌泳動(dòng)的影響Fig.4 The effect of sodium dehydroacetate on swimming motility of A.salmonicida

2.4 脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌胞外蛋白酶活性的影響

新鮮水產(chǎn)品因肌肉中水分和蛋白質(zhì)含量高、不飽和脂肪酸易氧化等特點(diǎn),為微生物的生長繁殖提供優(yōu)良的環(huán)境,微生物則是造成水產(chǎn)品腐敗的主要原因。而胞外蛋白酶能快速分解魚類蛋白質(zhì)導(dǎo)致魚類腐敗變質(zhì),周圍[23]研究表明粘質(zhì)沙雷氏菌胞外蛋白酶的分泌量受到AHLs介導(dǎo)的QS系統(tǒng)的調(diào)控。如圖5所示,隨著脫氫乙酸鈉質(zhì)量濃度的增加,胞外蛋白酶分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的水解圈直徑變小。當(dāng)添加外源信號(hào)分子C12-HSL時(shí),胞外蛋白酶水解圈直徑與陰性對(duì)照組相比明顯增加。梅永超等[24]證實(shí)了綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌的胞外蛋白酶起到抑制作用。由此可以看出,殺鮭氣單胞菌胞外蛋白酶活性是由AHLs所介導(dǎo)的QS系統(tǒng)影響,脫氫乙酸鈉通過干擾殺鮭氣單胞菌的QS系統(tǒng),從而抑制其胞外蛋白酶的活性。

a-牛奶平板圖;b-蛋白酶水解直徑 1-C12-HSL；2-去離子水；3-0.4 mg/mL；4-0.8 mg/mL；5-1.2 mg/mL； 6-1.6 mg/mL圖5 脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌胞外蛋白酶的影響Fig.5 The effect of sodium dehydroacetate on extracellular protease activity of A.salmonicida

2.5 脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌生物被膜相對(duì)形成率的影響

細(xì)菌生物被膜是由附著于惰性或活性實(shí)體表面的細(xì)菌細(xì)胞和包裹細(xì)菌的水合性胞外聚合物組成的結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落[25]。生物被膜是大多數(shù)細(xì)菌在自然狀態(tài)下的一種存在形態(tài)，這使得細(xì)菌具有更好的自我競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。一些細(xì)菌生物被膜的形成受到其自身QS系統(tǒng)的調(diào)控,并且該系統(tǒng)所調(diào)控的多種生理行為主要依賴與群體密度影響[26]。由圖6可知,脫氫乙酸鈉對(duì)菌液密度的影響不大,但隨著脫氫乙酸鈉質(zhì)量濃度升高,生物被膜的形成率反而有所下降,說明脫氫乙酸鈉能有效抑制殺鮭氣單胞菌生物被膜的形成。同時(shí),與陰性對(duì)照相比，當(dāng)添加終質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL脫氫乙酸鈉,生物被膜相對(duì)形成率僅為31.78%,而作為陽性對(duì)照添加外源信號(hào)分子C12-HSL生物被膜相對(duì)形成率達(dá)到129.37%。由此看出,脫氫乙酸鈉可能通過干擾殺鮭氣單胞菌的QS系統(tǒng)調(diào)控生物被膜的形成。

圖6 脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌生物被膜相對(duì)形成率的影響Fig.6 The effect of sodium dehydroacetate on biofilm formation of A.salmonicida

2.6 脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌生物被膜形態(tài)的影響

圖7是經(jīng)不同質(zhì)量濃度脫氫乙酸鈉處理后,殺鮭氣單胞菌形成的生物被膜的掃描電鏡圖。由圖7可知,陽性對(duì)照組中生物被膜形態(tài)結(jié)構(gòu)粗糙致密,堆疊狀態(tài)加深、結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。從圖7可知，隨著脫氫乙酸鈉的質(zhì)量濃度增加,生物被膜形態(tài)破壞愈劇烈。

1-C12-HSL；2-去離子水；3-0.4 mg/mL；4-0.8 mg/mL； 5-1.2 mg/mL；6-1.6 mg/mL圖7 脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌生物被膜影響的 掃描電子顯微鏡圖Fig.7 Scanning electron microscopic images showing the effect of sodium dehydroacetate on biofilm formation of A.salmonicida

結(jié)果與上述酶標(biāo)法測(cè)定生物被膜形成量一致,印證了脫氫乙酸鈉可顯著降低殺鮭氣單胞菌生物被膜的形成能力。ZHANG等[26]研究發(fā)現(xiàn)乙醇脫氫酶可以調(diào)節(jié)不動(dòng)桿菌QS現(xiàn)象,從而對(duì)生物被膜的形成造成影響。

2.7 脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌AHLs產(chǎn)量的影響

RANI等[27]利用GC-MS測(cè)定銅綠假單胞菌AHLs信號(hào)分子的的分泌情況。圖8是6種混合AHLs(C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL)標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS檢測(cè)圖。6種混合標(biāo)準(zhǔn)品已經(jīng)完全分離,峰形尖銳,其相應(yīng)特征峰的保留時(shí)間依次為3.296、4.895、6.742、8.760、11.143、13.908 min。圖9表示殺鮭氣單胞菌所產(chǎn)的AHLs是C12-HSL,且在相同培養(yǎng)條件下,隨著脫氫乙酸鈉質(zhì)量濃度增加,AHLs的峰面積逐漸減小,兩者呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明,脫氫乙酸鈉可以有效抑制殺鮭氣單胞菌AHLs的產(chǎn)生。結(jié)合上文所述,證實(shí)了脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌信號(hào)分子的產(chǎn)生具有抑制作用。

圖8 AHLs混合標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS圖Fig.8 GC-MS diagram of AHLs mixed with the standard

圖9 脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌AHLs產(chǎn)量的影響Fig.9 The effect of sodium dehydroacetate on the production of AHLs from A.salmonicida

3 結(jié)果與討論

本文通過殺鮭氣單胞菌測(cè)定脫氫乙酸鈉的最小抑菌濃度,并利用報(bào)告菌株CV026驗(yàn)證了脫氫乙酸鈉具有QS抑制性。通過QS現(xiàn)象表型如：細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性、胞外蛋白酶水解活性以及生物被膜的抑制性以及破壞作用,進(jìn)一步證實(shí)在亞抑菌濃度情況下,脫氫乙酸鈉對(duì)殺鮭氣單胞菌的QS現(xiàn)象均起到抑制作用。最后,通過GC-MS進(jìn)行特征峰分析抑制能力。綜上所述,脫氫乙酸鈉具有抑制殺鮭氣單胞菌自身分泌AHLs信號(hào)分子的能力,從而達(dá)到影響殺鮭氣單胞菌的QS系統(tǒng)的效果。