市售不老莓果汁類產(chǎn)品酚類物質(zhì)與有機(jī)酸解析及抗氧化能力比較

李海波,郜毓堃,魏麗萍,楊亞平,鮑詩晗,蘭天,孫翔宇,馬婷婷*

1(山西潞安石圪節(jié)智華生物科技有限公司,山西 長治,046299) 2(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 楊凌,712100) 3(西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院,陜西 楊凌,712100)

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa(Michx.)Ell.),原產(chǎn)于美國東北部,是一種集食用、藥用、園林和生態(tài)等價(jià)值于一身的珍貴經(jīng)濟(jì)樹種[1],其漿果(俗稱野櫻莓、不老莓)富含黃酮、花青素和多酚等物質(zhì)。20世紀(jì)90年代,不老莓被引種至中國,并于遼西地域開始栽培[2],截至2015年,該樹種在我國栽培面積約為533～600 hm2,遼寧、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古、河南、河北、北京、山東、新疆、江蘇、山西等13個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)均有不同面積種植。近年來,我國相繼完成了繁殖、栽培、區(qū)域試驗(yàn)等方面的研究[3]。2018年9月,不老莓通過我國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)審查,成為新食品原料[4],正式在食品加工領(lǐng)域嶄露頭角。

不老莓提取物具有極強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抑菌等生物活性,在治療和預(yù)防癌癥、心血管疾病、慢性炎癥、輻射病、重金屬中毒癥等多種疾病中起到一定作用[5-8]。同時(shí),不老莓富含多酚類物質(zhì),如花青素、黃酮等的含量高于大部分已知植物[9],是天然的抗氧化劑資源,也是決定不老莓生物活性的關(guān)鍵因素。此外,研究表明不老莓中含有豐富的有機(jī)酸類物質(zhì),也為其生物活性作出貢獻(xiàn)。另一方面,由于其縮合單寧含量較高,使果實(shí)口感較澀,不適宜鮮食。但是,不老莓漿果出汁率可高達(dá)(78.65±1.05)%[10],因此,通過工藝手段將不老莓加工成果汁,可以豐富其口感,降低澀感,同時(shí)較大程度地保留其生物活性?？傮w而言,不老莓果汁類產(chǎn)品具有非常廣闊的市場前景。目前,不老莓果實(shí)中多酚與有機(jī)酸組成已有一定研究,但仍缺乏對不老莓果汁類產(chǎn)品酚類物質(zhì)與有機(jī)酸特征的相關(guān)研究,對于消費(fèi)者的選購與不老莓果汁的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展均造成了一定的影響。

綜上,本研究通過對市售不老莓果汁類產(chǎn)品的有機(jī)酸與酚類物質(zhì)組成進(jìn)行解析,同時(shí)分析與抗氧化能力的相關(guān)性,從而對此類產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值與抗氧化能力作出評價(jià),以期為消費(fèi)者的選購與不老莓果汁的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6種市售不老莓果汁類產(chǎn)品購于超市或網(wǎng)上商城,樣品信息如表1所示。

表1 六種市售不老莓果汁類產(chǎn)品Table 1 Six kinds of commercial A.melanocarpa juices

福林酚(濃度1 mol/L),北京索萊寶科技有限公司；2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine,TPTZ)(純度≥98%)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)(濃度≥98%),上海源葉科技有限公司；DPPH試劑(純度>97.0%),梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；沒食子酸、原花青素B1、原兒茶酸、綠原酸、兒茶素、原花青素B2、龍膽酸、咖啡酸、反式對香豆酸、反式阿魏酸、槲皮素-3-D-β-葡萄皮糖苷、槲皮素、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丙酸(濃度≥98%),美國Sigma公司；甲醇、乙腈(均為色譜純),美國Tedia公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī),德國Eppendorf公司；UV2800紫外分光光度計(jì),尤尼柯(上海)儀器有限公司；Waters 2695高效液相色譜儀,包括自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、Waters 2996 紫外檢測器、Empower 色譜工作站,美國Waters公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

10 mL果汁經(jīng)8 000 r/min離心10 min,取上清液稀釋,得到待測樣品。

1.3.2 總酚含量測定

參照LI等[11]采用福林酚法并稍作改動(dòng)。取待測樣品0.2 mL于10 mL比色管,先后加入2 mL 稀釋10倍的福林酚溶液和1.8 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%的Na2CO3溶液,混勻避光放置1 h,于765 nm處測定吸光度值,結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量表示。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為0～200 mg/L,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.005 7x+0.056 6(R2=0.999 0)。

1.3.3 總黃酮含量測定

參照PRAKASH等[12]的方法并稍作改動(dòng)。取5 mL待測樣品于10 mL比色管中,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaNO2溶液0.3 mL,避光反應(yīng)6 min,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Al(NO3)3溶液0.3 mL,避光反應(yīng)6 min,再加入1.0 mol/L NaOH溶液2 mL,并使用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇定容至10 mL,避光反應(yīng)15 min,于510 nm處測吸光度值,結(jié)果以兒茶素當(dāng)量表示。兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0～60 mg/L,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.016 2x+0.016 3 (R2=0.999 2)。

1.3.4 總花色苷含量測定

參照劉樹勛等[13]的方法并稍作改動(dòng)。取一定體積未稀釋原果汁于2支10 mL比色管中,分別使用pH 1.0 HCl-KCl緩沖液和pH 4.5 HCl-CH3CO2Na·3H2O溶液定容至5 mL,于黑暗處反應(yīng)15 min,測定反應(yīng)液在520及700 nm處的吸光度值,pH 1.0反應(yīng)液體系在520及700 nm處吸光度相減記為A1,pH 4.5反應(yīng)液體系在520及700 nm處吸光值相減記為A2,樣品花色苷含量按公式(1)計(jì)算:

(1)

式中：MW,二甲花翠素葡萄糖苷分子質(zhì)量493.5；DF,稀釋倍數(shù)；ε,二甲花翠素葡萄糖苷的消光系數(shù)28 000。

1.3.5 縮合單寧含量測定

參照王儲(chǔ)炎等[14]的方法并稍作改動(dòng)。取待測樣品0.5 mL于10 mL比色管中,先后加入3%的香草醛-甲醇溶液2.5 mL及體積分?jǐn)?shù)30%的硫酸-甲醇溶液2.5 mL,30 ℃避光反應(yīng)20 min后于500 nm處測定吸光度值,結(jié)果以兒茶素當(dāng)量表示。兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0～400 mg/L,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.002 4x+0.008 8 (R2=0.999 5)。

1.3.6 HPLC測定單體酚及有機(jī)酸含量

(1) 樣品處理

取10 mL果汁8 000 r/min離心10 min,上清液使用純凈水稀釋,0.45 μm濾膜過濾后待測。

(2)單體酚含量測定

色譜柱：CAPCELL PAK C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫28 ℃；DAD檢測器,檢測波長280 nm；進(jìn)樣量10 μL,以峰面積外標(biāo)法定量。

梯度洗脫：流速0.5 mL/min；流動(dòng)相A：V(水)∶V(乙腈)=19∶1,含體積分?jǐn)?shù)0.3%乙酸；流動(dòng)相B：V(乙腈)∶V(水)=9∶1,含體積分?jǐn)?shù)0.2%乙酸。

梯度洗脫程序：0～16 min,B為12%～14%；16～18 min,B為14%；18～30 min,B為14%～16%；30～36 min,B為16%～20%；36～46 min,B為20%～24%；46～56 min,B為24%～30%；56～66 min,B為30%～50%；66～70 min,B為50%；70～80 min,B為50%～12%；80～85 min,B為12%。

(3)有機(jī)酸含量測定

色譜柱：CAPCELL PAK C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫45 ℃；DAD檢測器,檢測波長210 nm；進(jìn)樣量10 μL,以峰面積外標(biāo)法定量。

等度洗脫：流速0.5 mL/min；流動(dòng)相A：0.02 mol/L K2HPO4,H3PO4溶液調(diào)節(jié)pH至2.3；流動(dòng)相B：甲醇。

洗脫程序,流動(dòng)相A∶B=99∶1(體積比)。

1.3.7 抗氧化活性測定

(1)鐵離子還原能力(ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)

參照BENZIE等[15]的方法并稍作改動(dòng)。取0.25 mL待測樣品和8 mL TPTZ工作液于10 mL比色管中,37 ℃反應(yīng)15 min,在593 nm處測定其吸光度值,FRAP以Trolox當(dāng)量表示。Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0～1 mmol/L,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.154 4x+0.270 9 (R2=0.999 7)。

(2)DPPH自由基清除能力

參照文獻(xiàn)[16]的方法并稍作改動(dòng)。取0.25 mL待測樣品和4 mL DPPH反應(yīng)液于10 mL比色管中,避光反應(yīng)30 min,在517 nm處測定其吸光度值,DPPH自由基清除能力以Trolox當(dāng)量表示。Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0～1 mmol/L,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-1.228 5x+1.737 (R2=0.999 5)。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果以(x±s)表示。采用SPSS 21.0軟件單因素ANOVA模塊對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,雙變量相關(guān)模塊計(jì)算Pearson系數(shù)對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析,以P≤0.05表示差異顯著,以P≤0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 市售不老莓果汁類產(chǎn)品酚類物質(zhì)含量分析

不老莓果汁類產(chǎn)品的酚類化合物種類與其果實(shí)一致,包括單體多酚及聚合多酚2種。單體多酚由酚酸、黃酮和花青素及其糖苷類化合物組成,其中花色苷是主要的呈色物質(zhì)。聚合多酚即縮合單寧,由不同數(shù)量的表兒茶素微粒和兒茶素聚合而成,為呈澀物質(zhì)[17]。

研究表明,不老莓果實(shí)中花色苷約占總酚含量25%,且遠(yuǎn)高于黃酮類化合物含量[18],這與不老莓果汁類產(chǎn)品的測定結(jié)果有較大差異。如圖1所示,在不老莓果汁類產(chǎn)品中,黃酮類化合物占總酚含量21%～63%,而花色苷最多僅占總酚含量6%,最低為K-30%,未檢出花色苷類物質(zhì)?；ㄉ毡Ａ袈逝c溫度顯著相關(guān),WILKES等[19]研究了不老莓果汁加工過程中及其在25 ℃、6個(gè)月貯存期內(nèi)花青素的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)熱處理后花青素被大量降解,其濃度呈線性下降。而較低溫度和較低pH值貯藏的不老莓中花青素的含量最高,這在HOWARD等[20]的實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,深加工果汁會(huì)造成不老莓果實(shí)中花青素及其糖苷類化合物的較大損失。

不老莓果實(shí)中,呈澀物質(zhì)縮合單寧的總酚含量占比高達(dá)66%[18],由圖1可知,在其果汁類產(chǎn)品中,縮合單寧占總酚含量5%～31%,與果實(shí)相比顯著降低,從而使?jié)薪档?風(fēng)味得到較大改善。然而,縮合單寧具有極強(qiáng)的抗氧化能力,是不老莓生物活性的最重要來源之一。因此,在果汁加工過程中,若一味追求除去縮合單寧以降低澀感,則會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值大大下降。ZH-20%、ZH-30%、ZH-40%產(chǎn)品中,縮合單寧均占總酚含量約30%左右,較好地實(shí)現(xiàn)了果汁產(chǎn)品口感與營養(yǎng)價(jià)值的平衡。

2.2 市售不老莓果汁類產(chǎn)品單體酚組成差異分析

在所有樣品中,共檢測出12種單體酚(表2),其中包括7種酚酸(沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、龍膽酸、咖啡酸、反式對香豆酸、反式阿魏酸),3種黃烷醇(原花青素B1、原花青素B2、兒茶素)及2種黃酮醇(槲皮素-3-D-β-葡萄糖苷、槲皮素)。L-45%是唯一檢測出咖啡酸、反式對香豆酸及槲皮素-3-D-β-葡萄糖苷的樣品；而槲皮素只在ZH-30%、ZH-40%、ZH-100%中存在；K-30%單體酚種類及含量均最低。

表2 市售不老莓果汁類產(chǎn)品單體酚含量及組成差異Table 2 Content and composition differences of mono-phenols in commercial A.melanocarpa juices

酚酸是不老莓果實(shí)及其加工產(chǎn)品中最主要的單體酚類化合物,綠原酸與新綠原酸被認(rèn)為是不老莓中主要的非類黃酮多酚類化合物[21-22]。ROP等[23]通過對5個(gè)不老莓品種Aron、Fert?di、Hugin、Nero和Viking的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了綠原酸和新綠原酸是非常重要的抗氧化劑,果實(shí)抗氧化能力與二者均呈線性正相關(guān)關(guān)系,相關(guān)函數(shù)分別為y=0.007 5x-0.105 2 (R2=0.788)及y=0.025 8x-1.326 8 (R2=0.940)。在6種被測樣品中,ZH-100%綠原酸含量最高,因此其抗氧化能力較強(qiáng)。

3種黃烷醇類化合物在6種被測樣品中廣泛存在,且含量均較高。原花青素B1、原花青素B2及兒茶素聚合度均小于6,屬于低聚原花青素,是不老莓果實(shí)及其相關(guān)產(chǎn)品中有效的生物活性成分。此外,原花青素聚合程度與其生物利用率關(guān)系顯著,低聚合度更有利于人體腸道對原花青素的吸收[24]。ZH-100%兒茶素及原花青素B2含量顯著高于其他樣品,是人體原花青素的優(yōu)質(zhì)來源。

a-總酚；b-總黃酮；c-總花色苷；d-縮合單寧圖1 市售不老莓果汁類產(chǎn)品酚類物質(zhì)含量Fig.1 Phenolic content of commercial A.melanocarpa juices 注：組間不同小寫字母代表差異顯著(P≤0.05)(下同)

2.3 市售不老莓果汁類產(chǎn)品有機(jī)酸組成差異分析

已有研究表明,不老莓屬于蘋果酸型果實(shí),有機(jī)酸類型以蘋果酸和檸檬酸為主,其鮮果中蘋果酸含量為1.31%,檸檬酸含量為0.21%[28]。此外,不老莓果實(shí)中也含有其他種類的有機(jī)酸,如奎寧酸、莽草酸等,為其抗氧化活性作出貢獻(xiàn)。與鮮果相比,市售不老莓果汁類產(chǎn)品中蘋果酸與檸檬酸含量顯著降低,這說明將不老莓加工成果汁產(chǎn)品,可以使其酸甜度更協(xié)調(diào),改善風(fēng)味,消費(fèi)者接受度更高。具有抗氧化活性的奎寧酸與莽草酸同樣在果汁產(chǎn)品中被檢測到(表3)。

表3 市售不老莓果汁類產(chǎn)品有機(jī)酸含量及組成差異Table 3 Content and composition differences of organic acids in commercial A.melanocarpa juices

研究發(fā)現(xiàn),檸檬汁與5%(體積分?jǐn)?shù))的不老莓果汁混合,得到的混合果汁花青素保留率更高,比單純的檸檬汁或不老莓果汁抗氧化能力更強(qiáng)[29]。ZH-20%、ZH-30%、ZH-40%檸檬酸含量高于同系列100%果汁ZH-100%,表明前者在加工過程中額外添加了檸檬酸,這不僅可以改善果汁風(fēng)味,還對花青素穩(wěn)定性具有積極影響。

2.4 市售不老莓果汁類產(chǎn)品抗氧化活性分析

市售不老莓果汁類產(chǎn)品抗氧化能力測定結(jié)果如圖2所示。L-45%抗氧化能力最強(qiáng),其次是ZH-100%、ZH-40%、ZH-30%和ZH-20%,K-30%抗氧化能力最弱。ZH-20%、ZH-30%、ZH-40%在低濃度果汁產(chǎn)品中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。L-45%抗氧化活性最強(qiáng),這是由于其屬于復(fù)配產(chǎn)品,調(diào)配過程中添加了其他水果的濃縮汁?？寡趸钚詼y定結(jié)果表現(xiàn)與酚類物質(zhì)含量一致,即酚類物質(zhì)含量越高,抗氧化能力越強(qiáng)。

圖2 市售不老莓果汁類產(chǎn)品抗氧化活性Fig.2 Antioxidant capacity of commercial A.melanocarpa juices

褚大可等[30]測定了14種不同類別市售果汁的抗氧化能力,其中葡萄果汁鐵離子還原能力最弱,為1 114.31 μmol Trolox/L；檸檬汁抗氧化能力最強(qiáng),但也僅為3 262.97 μmol Trolox/L。而本實(shí)驗(yàn)測定出ZH系列果汁及L-45%的鐵離子還原能力高達(dá)2.587～24.717 mmol Trolox/L。因此,市售不老莓果汁抗氧化活性遠(yuǎn)高于其他類型果汁,具有極高的營養(yǎng)價(jià)值。

有研究發(fā)現(xiàn),4 kPa真空度下浸漬有利于不老莓抗氧化成分的穩(wěn)定[31]。這或許可以為不老莓果汁類產(chǎn)品加工工藝的改進(jìn)提供新思路。

2.5 市售不老莓果汁類產(chǎn)品有機(jī)酸及酚類物質(zhì)含量與抗氧化活性相關(guān)性分析

由圖3可知,FRAP及DPPH抗氧化活性與酚類物質(zhì)含量均呈極顯著(P≤0.01)正相關(guān)關(guān)系,包括總酚、總黃酮、總花色苷、縮合單寧以及沒食子酸和奎寧酸2種酚酸。這說明在不老莓果汁類產(chǎn)品中,酚類物質(zhì)是最主要的抗氧化活性來源,沒食子酸及奎寧酸是提供生物活性的重要酚酸類化合物。

圖3 市售不老莓果汁類產(chǎn)品酚類物質(zhì)及有機(jī)酸含量與抗氧化活性相關(guān)熱圖Fig.3 Heat map of phenolic compounds and organic acids content and antioxidant activity of commercial A.melanocarpa juices 注：*代表相關(guān)性顯著,P≤0.05；**代表相關(guān)性極顯著,P≤0.01

原花青素B2、龍膽酸、咖啡酸、反式對香豆酸、槲皮素-3-D-β-葡萄糖苷及有機(jī)酸中的乳酸和乙酸與FRAP、DPPH呈顯著(P≤0.05)正相關(guān)關(guān)系,也為不老莓果汁類產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值作出貢獻(xiàn)。

值得一提的是,乙酸與總酚、總花色苷、縮合單寧均有極顯著(P≤0.01)正相關(guān)關(guān)系,Pearson系數(shù)分別為0.928、1.000和0.956。乳酸與總酚、總花色苷呈顯著正相關(guān)(P≤0.05),Pearson系數(shù)分別為0.908、0.913,與縮合單寧呈極顯著(P≤0.05)正相關(guān),Pearson系數(shù)為0.940。這表明在不老莓果汁加工過程中,以乳酸與乙酸為代表的部分有機(jī)酸對酚類物質(zhì)有一定的保護(hù)作用,可以減少其降解。因此,有機(jī)酸含量較高的ZH-100%是優(yōu)良的低濃度不老莓果汁加工原料。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了K-30%、ZH-20%、ZH-30%、ZH-40%、ZH-100%及L-45%共6種市售不老莓果汁類產(chǎn)品的有機(jī)酸類物質(zhì)、酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性,并進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明,與不老莓果實(shí)相比,深加工為果汁后,6種果汁普遍損失了較多花青素及其糖苷類化合物；ZH-20%、ZH-30%、ZH-40%產(chǎn)品縮合單寧在總酚含量中占比合理,較好地實(shí)現(xiàn)了口感與營養(yǎng)價(jià)值的平衡。ZH-100%綠原酸及低聚原花青素(兒茶素、原花青素B2)含量顯著高于其他樣品,具有良好的抗氧化能力,也是人體原花青素的優(yōu)質(zhì)來源?？偡?、總黃酮、總花色苷、縮合單寧以及沒食子酸和奎寧酸與抗氧化能力呈極顯著正相關(guān)關(guān)系,酚類物質(zhì)是不老莓果汁類產(chǎn)品最主要的抗氧化活性來源,沒食子酸及奎寧酸是為其提供生物活性的重要酚酸類化合物。在不老莓果汁加工過程中,檸檬酸對花青素有一定的保護(hù)作用,因此,與其他低濃度不老莓果汁相比,額外添加檸檬酸的ZH-20%、ZH-30%、ZH-40%花青素穩(wěn)定性更強(qiáng)、含量更高。有機(jī)酸含量較高的ZH-100%是優(yōu)良的低濃度不老莓果汁加工原料,本研究通過對市售不老莓果汁類飲料的生物活性物質(zhì)及抗氧化能力進(jìn)行分析評價(jià),為此類產(chǎn)品的開發(fā)提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ),也為不老莓果汁加工工藝的完善提供了改進(jìn)方向。