繆倩 任春梅 季英華 楊柳 程兆榜

關鍵詞： COP9信號復合體;黃瓜;亞細胞定位

中圖分類號： S642.2?? 文獻標識碼： A?? 文章編號： 1000-4440（2021）04-1084-05

Subcellular location and expression analysis of subunit CsCSN5b from COP9 signaling complex in Cucumis sativus L.

MIAO Qian， REN Chun-mei， JI Ying-hua， YANG Liu， CHENG Zhao-bang

（Institute of Plant Protection，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Lab of Food Quality and Safety of Jiangsu Province-State Key Laboratory Breeding Base Co-constructed by Province and Ministry， Nanjing 210014，China）

Key words： COP9 signaling complex;Cucumis sativus L.;subcellular location

江蘇農業(yè)學報 2021年第37卷第4期

繆 倩等：黃瓜COP9信號復合體亞基CsCSN5b的亞細胞定位和表達分析

COP9信號復合體（Constitutively photomorphogennic signalosome， CSN）是一種在黑暗條件下抑制光形態(tài)建成的調節(jié)蛋白[1]，1992年在研究調控擬南芥的光形態(tài)建成的轉錄因子時被發(fā)現(xiàn)，突變體擬南芥在黑暗條件下，子葉展開，下胚軸縮短，這一表型與野生型擬南芥在光照下幼苗生長的形態(tài)一致。CSN是一種高度保守的多亞基蛋白質復合體，調控動物、植物的生命活動，如生長、分化、繁殖。CSN主要參與調節(jié)泛素-蛋白酶體通路（Ubiquitin proteasome system， UPS）[2]，UPS是蛋白質高效特異性降解的主要途徑，目標蛋白被泛素三酶級聯(lián)反應，靶蛋白進行泛素化修飾后，由26S蛋白酶體催化蛋白質降解[3]。其中SCF型泛素連接酶（CRLs）是泛素連接酶E3中最大的家族，該復合體包括Cullin蛋白、RING蛋白、調控蛋白以及底物識別蛋白[4]，CSN可以催化泛素類蛋白NEDD8從Cullin-RING泛素連接酶上去Nedd化導致CRLs活性喪失，實現(xiàn)CSN影響蛋白質降解過程[5]。在高等真核生物中典型的CSN蛋白由8個不同亞基組成（CSN1～CSN8），這些亞基通常含有2個保守結構域：MPN（MPRI-PADI-N-terminal domain）和PCI（Proteasome COP9 signalosome initiation factor 3 domain）[6]。MPN結構域是由3條α螺旋和9條β線纏繞成β片層組成，一般存在于CSN5和CSN6中，主要識別信號因子，激活下游活動，調控生物學功能[6]。PCI結構域存在于CSN1、CSN2、CSN3、CSN4、CSN7和CSN8中，是復合體亞基裝配完整的關鍵部分，并介導蛋白質的相互作用[7]。

COP9信號復合體亞基已經從多種生物中被克隆并分析，各個亞基的功能也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，如水稻OsCSN5B基因[8]、蘋果MdCSNs基因[9]、甘藍型油菜BnCOP9基因[10]、菊花CmCSN1基因[11]，擬南芥CSN蛋白[12]，煙草CSN4蛋白[13]等。CSN5結構最為特殊，它具備完整的催化活性位點和金屬離子鋅結合位點，在生物體中以單體或小復合體的形式發(fā)揮功能[14]，有研究結果表明人體內的同源基因Jab1與癌癥密切相關[15-17]。CSN5可調控真菌生長發(fā)育和代謝，茶樹內生真菌無花果擬盤多毛孢基因組中找到的同源基因PfcsnE，是分生孢子形成的必需條件，并調控菌株的次級代謝活動[18]。CSN5在植物逆境脅迫中扮演重要角色，雙生病毒編碼的C2蛋白能夠與擬南芥的CSN5A互作，影響擬南芥泛素化蛋白質降解[19]。擬南芥突變體csn5對鹽表現(xiàn)出較高的耐受性，發(fā)現(xiàn)CSN5B通過26S蛋白酶體途徑降解GDP-甘露糖焦磷酸化酶，影響植物抵御非生物脅迫的關鍵因子抗壞血酸（AsA）的合成，CSN5B功能缺失后AsA的含量升高，處于較高水平，可提高植物對環(huán)境脅迫的耐受性[20]。CSN5有2個編碼基因CSN5a和CSN5B，現(xiàn)在研究較多的是CSN5a的功能。

黃瓜是瓜類蔬菜作物中具有重要經濟價值的一類，全國范圍內收集的3 283份黃瓜疑似病毒病樣品中，黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）檢出率為21.38%。CGMMV發(fā)展形勢日趨嚴峻，嚴重影響黃瓜的品質和產量，使黃瓜產業(yè)經濟損失達15%～25%[21]。本研究首次從黃瓜中克隆到CsCSN5b，前期研究預測CsCSN5b與CGMMV的CP蛋白有互作關系，猜測CsCSN5b在黃瓜應答CGMMV生物脅迫中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試CGMMV毒源為本實驗室保存的2012年采集于海南的具有典型發(fā)病癥狀的西瓜樣品上[22];植物材料黃瓜9930（Cucumis sativus L.）和本氏煙草（Nicotiana benthamiana）由本實驗室保存;熒光標記載體35S：YFP由南京農業(yè)大學陶小榮實驗室提供。

1.2 植物總RNA的提取和cDNA的合成

黃瓜總RNA提取參照RNA提取試劑盒使用說明書操作，總RNA經Nanodrop2000和瓊脂糖凝膠電泳檢測后，取5 μg RNA為模板，按TaKaRa反轉錄試劑盒（PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit）說明書操作得到cDNA，將剩余的RNA和cDNA于-80 ℃保存，用于后續(xù)試驗。

1.3 CsCSN5b基因克隆及其序列分析

根據公開的黃瓜基因組信息，設計CsCSN5b基因擴增引物COP9-bf：5′-CGGGATCCATGGAGCCGTTTCCATCATC-3′和COP9_bR_dTGA：5′-CGGGATCCGCTTTCCACCATTGGTTCTG-3′（下劃線為引入的Bam H Ⅰ酶切位點），以合成的cDNA為模板，進行PCR擴增。反應程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃變性15 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸70 s，32個循環(huán);72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。純化產物與pMD18-T載體連接，連接體系參照pMD18-T載體試劑盒說明書操作，16 ℃連接過夜，連接產物通過熱激法轉化大腸桿菌感受態(tài)TOP10，挑取單菌落PCR鑒定得到陽性克隆，送于南京金斯瑞生物公司進行測序。利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的Blast在線分析工具進行序列分析，使用MEGA6軟件的臨接法（Neighbor-joining）構建系統(tǒng)進化樹，進化樹的可信度使用1 000次自導復制驗證。

1.4 CsCSN5b-YFP融合表達載體構建

參照質粒提取試劑盒說明書提取pMD18-CsCSN5b質粒，用Bam H Ⅰ進行單酶切，37 ℃酶切1 h，酶切產物通過T4連接酶連接經Bam H Ⅰ單酶切的線性化35S：YFP，連接體系參照T4 DNA Ligase試劑盒說明書操作，22 ℃連接1 h。連接產物通過熱激法轉化大腸桿菌感受態(tài)TOP10，送于南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。

1.5 CsCSN5b蛋白的亞細胞定位觀察

重組質粒CsCSN5b-YFP電擊法轉化農桿菌GV3101，以35S：YFP空載體為對照，在LB平板（含50 mg/L 利福平和50 mg/L硫酸卡那霉素）上篩選培養(yǎng)，經PCR鑒定陽性菌落，用于后續(xù)試驗。

將轉入35S：：CsCSN5b-YFP農桿菌和35S：YFP空載體的農桿菌單菌落用液體LB（含50 mg/L 利福平和50 mg/L硫酸卡那霉素）振蕩培養(yǎng)，至OD600約為1.0，離心收集菌體，棄上清液，加入誘導液[150 μmol/L乙酰丁香酮、10 mmol/L MES（pH5.7）和10 mmol/L MgCl2]重懸菌體，室溫避光靜止2 h，選取4～6葉齡健康本氏煙草的葉片，表皮按壓注射菌液。40 h后取浸潤區(qū)煙草葉片置于載玻片上，于激光共聚焦顯微鏡（ZEIZZ LSM710）488 nm激發(fā)光下觀察上表皮細胞中目標蛋白表達情況及其亞細胞定位特征。

細胞核染色采用DAPI標記法。取浸潤區(qū)煙草葉片置于載玻片上，于激光共聚焦顯微鏡360～400 nm激發(fā)光下觀察。

1.6 CsCSN5b蛋白Western blot分析

按照植物蛋白提取試劑盒（Solarbio）說明書提取煙草葉片植物總蛋白質，加入適量SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（×5），漩渦震蕩混勻，99 ℃金屬浴10 min，冰浴5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液，用于Western blot試驗。取20 μl上述蛋白質樣品于12% SDS-PAGE膠上進行電泳（80 V，30 min;130 V，1 h）檢測，轉印硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉封閉，室溫60 r/min震蕩1 h，然后以1∶5 000的GFP抗體常溫孵育，60 r/min震蕩1 h，經PBST洗滌4次，用辣根過氧化物酶HRP標記的羊抗兔作為二抗1∶5 000常溫孵育，60 r/min震蕩1 h，用PBST洗滌4次。顯色試劑盒ECL Western Blotting Substrate避光顯色，在天能Tanon 5200 Multi全自動熒光/化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)下曝光顯影。

1.7 CsCSN5b轉錄產物的RT-PCR檢測

浸潤區(qū)煙草葉片總RNA提取參照RNA提取試劑盒說明書操作，取5 μg RNA為模板，按TaKaRa反轉錄試劑盒（PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit）說明書合成cDNA。以cDNA為模板，利用35S：YFP上游引物35SBglⅡ-F和CsCSN5b基因擴增引物COP9_bR_dTGA進行PCR檢測，為了驗證35S：：CsCSN5b-YFP在本氏煙草葉片細胞中是否正常轉錄。

1.8 基因表達分析

已感染CGMMV病毒的西瓜葉為接種病原，稱0.1 g新鮮病葉，加入10 ml 0.01 mol/L PBS（pH7.0）緩沖液研磨，在10 d苗齡的黃瓜子葉上均勻噴灑少許金剛砂，吸取500 μl接種液滴在子葉上，手指順著葉脈方向輕輕摩擦葉面，同時以PBS緩沖液接種作為對照組（CK），接種10 min后，對接種的葉片噴灑清水保濕。摩擦接種后第7 d、第15 d和第25 d采集黃瓜葉片。

提取黃瓜葉片樣品的RNA，第一條鏈cDNA鏈的合成參考PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書，以反轉錄得到的cDNA為模板，根據克隆得到的黃瓜CsCSN5b基因序列設計熒光定量PCR引物QCsCOP9-F：5′-ACACCTATCTATGGCTGG-3′，QCsCOP9-R：5′-TTGCACCGAGTCGTTCATAGA-3′，以QCsActin為內參基因，進行熒光定量PCR，檢測CsCSN5b基因在接種CGMMV后的表達情況。擴增條件為：預變性95 ℃ 30 s;變性95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)，每組試驗設3次生物學重復，采用2-△△Ct法對CsCSN5b基因進行相對定量分析，Ct值為達到檢測閾值時的PCR循環(huán)數。使用Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 黃瓜CsCSN5b基因克隆

提取黃瓜葉片總RNA，反轉錄合成cDNA第一條鏈，以cDNA為模板，利用CsCSN5b全長擴增引物進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，擴增到1條大小約1.2 kb的特異性條帶，與預期的目的基因（1 098 bp）大小基本一致。轉化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，驗證重組質粒pMD18T-CsCSN5b序列準確無誤。

2.2 CsCSN5b蛋白的生物信息學分析

黃瓜CsCSN5b基因核苷酸序列全長1 098 bp，編碼1個含有365個氨基酸的蛋白質，相對分子質量大小約36 700。利用NCBI Conserved Domain Search分析保守結構域，發(fā)現(xiàn)CsCSN5b編碼的蛋白質屬于COP9信號復合體CSN第5亞基家族，含有典型的MPN保守功能域，并且有1個鋅結合位點，很可能與復合體的催化活性有關。MPN同源蛋白進化樹分析結果顯示，CsCSN5b與葫蘆科植物番南瓜（Cucurbita maxima）、中國南瓜（Cucurbita moschata）、西葫蘆（Cucurbita pepo）、甜瓜（Cucumis melo）、小黃瓜（Cucumis sativus）CSN5b的氨基酸序列具有較高的同源性，其中與小黃瓜的親緣關系最近，與荷花（Nelumbo nucifera）、棕櫚（Elaeis guineensis）、玉米（Zea mays）的親緣關系較低。

2.3 CsCSN5b-YFP融合表達載體構建

克隆CsCSN5b基因時在基因的兩端加入了BamH Ⅰ酶切位點，因此通過Bam H Ⅰ單酶切pMD18-CsCSN5b獲得2條片段，其中一條是pMD18T載體片段，大小約為2 000～3 000 bp，另一條大小約1 200 bp的條帶，與預期的1 098 bp CsCSN5b基因片段大小相近。對最終篩選的陽性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。測序驗證的陽性克隆，序列正確的帶有YFP標簽的融合表達載體命名為35S：：CsCSN5b-YFP。為了確保插入方向正確，35S：：CsCSN5b-YFP融合表達載體進一步用載體引物35SBglⅡ-F和CsCSN5b基因擴增引物COP9_bR_dTGA進行菌落PCR篩選，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到另一條大小約1 200 bp的條帶，與預期的1 098 bp CsCSN5b基因片段大小相近。進一步Bam H Ⅰ酶切鑒定，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，有2個條帶，其中一條是35S：YFP載體，大小在15 000 bp左右，另一條大小約1 200 bp，與預期的1 098 bp CsCSN5b基因片段大小相近。

2.4 CsCSN5b編碼的蛋白質亞細胞定位分析

激光共聚焦顯微鏡觀察到綠色熒光蛋白在煙草表皮細胞高效瞬時表達，35S：：CsCSN5b-YFP融合蛋白在細胞核和細胞質中均有綠色熒光信號，用DAPI處理發(fā)現(xiàn)35S：：CsCSN5b-YFP融合蛋白在表皮細胞的細胞核中有熒光信號，所以可以推測CsCSN5b蛋白的亞細胞定位在細胞核和細胞質中。

2.5 CsCSN5b-YFP的表達檢測

浸潤CsCSN5b-YFP的煙草葉片可以擴增到1條與CsCSN5b目的片段大小一致的條帶，空載體沒有出現(xiàn)對應條帶，表明重組蛋白轉錄正常。

提取浸潤處煙草葉片植物總蛋白質，進行Western Blotting蛋白質印跡檢測，結果顯示，63 000處有單一目的條帶，與預期的CsCSN5b-YFP融合蛋白大小一致，接種YFP的煙草在27 000處有條帶，與預期的YFP大小一致。表明提取的植物蛋白質與抗YFP抗體發(fā)生特異性結合，說明構建的融合蛋白成功表達。

2.6 CsCSN5b基因表達分析

熒光定量PCR結果表明，與對照組相比，CGMMV處理的黃瓜葉片中CsCSN5b基因相對表達量隨著時間的推移升高，CGMMV處理的第7 d CsCSN5b基因表達量是對照組的1.24倍，第15 d CsCSN5b基因表達量是對照組的1.67倍，第25 d CsCSN5b基因表達量是對照組的5.74倍。說明CsCSN5b基因能夠響應CGMMV侵染脅迫，上調表達，該基因可能是CGMMV生物脅迫的反應基因。

3 討論

CSN首先發(fā)現(xiàn)于擬南芥中，相對分子質量為450 000～550 000[23]，后來在人類、果蠅、酵母等生物中相繼發(fā)現(xiàn)，不同亞基在不同生物體中的功能和數目有較大的差異[24]。CSN主要通過金屬蛋白酶活性、去泛素化活性和蛋白激酶活性在生物體內發(fā)揮生物學作用[25-27]，參與植物激素信號傳導、逆境脅迫應答、次生代謝等活動。N基因是抗煙草花葉病毒（TMV）的典型基因，煙草中證實NbRar1和NbSGT1對N基因介導的抗病毒作用是必需的，采用酵母雙雜技術和免疫共沉淀技術發(fā)現(xiàn)NbCOP9復合物與這2種基因有聯(lián)系，利用VIGS技術發(fā)現(xiàn)NbCOP9復合體表達水平下降導致N基因介導的TMV抗性下降[28]。雙生病毒C2蛋白與CSN5互作，改變CSN復合物的活性，干擾寄主對病毒蛋白泛素化過程。

CSN5比較特別，它參與各種細胞活動的調控，如細胞的增殖和凋亡[29]，單獨或以復合體形式存在都可以發(fā)揮功能[30]。CSN5的催化中心是Jab1/MPN/Mov34（JAMM）子結構域，它可以調節(jié)降解類泛素化酶的活性，為CSN發(fā)揮作用提供幫助。2014年發(fā)現(xiàn)擬南芥中CSN5是由2個同源基因編碼的CSN5a和CSN5b異構體組成，在擬南芥生長過程中突變其中1個基因植物能生長，2個基因同時突變就會產生典型的cop/det/fus突變體致死表型，說明兩者行使了部分重疊功能[31]。2011年在CSN5基因沉默突變株中發(fā)現(xiàn)茉莉酸的合成量大大降低，水楊酸含量無變化[32];2018年發(fā)現(xiàn)擬南芥csn5a缺陷型影響表面毛狀體和花青素、苯丙素、類胡蘿卜素等化合物的合成，從而改變了TTG1/bHLH/MYB轉錄復合物的調控協(xié)同性[33];2017年在小麥上接種葉銹病病菌發(fā)現(xiàn)高抗性的宿主體內TaCSN5轉錄豐度較高[34]。

黃瓜是瓜類蔬菜作物中具有重要經濟價值的一類[35-38]，近年來CGMMV在葫蘆科作物上的危害漸趨嚴重，并已成為危害設施瓜類作物的主要病毒。本研究首次從黃瓜中克隆了COP9信號復合體亞基CsCSN5b基因，該基因ORF全長1 098 bp，編碼的蛋白質相對分子質量36 700，該蛋白質含有1個保守的MPN功能域，與CSN5蛋白結構相似，氨基酸序列比對分析結果發(fā)現(xiàn)，CsCSN5b與葫蘆科植物的CSN親緣關系較近。本研究構建了帶有YFP熒光標簽的重組表達載體CsCSN5b-YFP，轉化農桿菌后浸潤接種煙草，進一步研究其亞細胞定位特征，發(fā)現(xiàn)帶YFP標簽的CsCSN5b蛋白成功在煙草細胞核和細胞質中表達，這是首次在黃瓜中克隆CsCSN5b基因并研究其亞細胞定位特征，為研究其功能提供了基礎。在本研究中，CGMMV侵染黃瓜苗后，CsCSN5b基因表達量逐漸上升，說明該基因參與了病毒脅迫的應答機制，響應CGMMV感染脅迫。但是CsCSN5b基因在黃瓜受CGMMV感染后具體表達模式和調控機制尚不明確，需要更深入的探究。

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（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2020-10-23

基金項目：江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項目[CX（19）3108];國家公益性行業(yè)科研專項（201303028）;國家自然科學基金項目（31501610）

作者簡介：繆 倩（1986-），女，江蘇常州人，碩士研究生，主要從事植物病毒研究。（E-mail）：miaoqian603@163.com

通訊作者：程兆榜，（E-mail）onlyone8501@126.com