王冰,朱莉,李茂瑋,詹曉北*

1(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室,江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 2(無錫格萊克斯生物科技有限公司,江蘇 無錫,214125)

β-葡聚糖是葡萄糖以β-糖苷鍵連接而成的同型多糖,具有降低膽固醇、調(diào)節(jié)血糖血脂、調(diào)節(jié)腸胃健康等功效[1-2]。β-葡聚糖的水解產(chǎn)物β-葡寡糖,是一種不可消化的低聚糖,可在不同程度上被腸道微生物菌群發(fā)酵[3],具有促進(jìn)乳酸菌生長和免疫調(diào)節(jié)等的作用[4-5]。近年來,β-葡聚糖成為研究熱點,但發(fā)酵條件、來源等因素影響著β-葡聚糖的溶解性、相對分子質(zhì)量及功能特性。

熱凝膠是一種由土壤桿菌在氮源匱乏條件下合成的僅由β-D-1,3-糖苷鍵連接而成的線性葡聚糖,在韓國、中國臺灣地區(qū)和日本已被注冊為膳食纖維[6]。但是熱凝膠的水不溶性限制了其生物活性的發(fā)揮,一些研究表明,熱凝膠經(jīng)過降解得到的β-1,3-葡聚糖,是一種可被水溶解且有較好生理功能的低聚糖[7],在醫(yī)學(xué)保健、生物、日化等領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價值[8-10]。YANG等[11]研究表明,β-葡聚糖通過不同傳達(dá)方式被吞噬細(xì)胞輸送或釋放,從而產(chǎn)生各種生理活性。但目前利用不同降解方法得到的低分子質(zhì)量葡聚糖依然存在著轉(zhuǎn)化率低、耗能大、污染大、分子質(zhì)量分布不均等問題[12-14]。如果可以用微生物直接發(fā)酵得到低分子質(zhì)量β-1,3-葡聚糖,將會進(jìn)一步擴(kuò)大葡聚糖的應(yīng)用領(lǐng)域。

甘油是被廣泛認(rèn)可并使用的工業(yè)原料[15]。土壤桿菌ATCC 31749 可以將甘油等醇類化合物作為碳源,本研究利用甘油做為碳源對土壤桿菌進(jìn)行馴化挑選,引導(dǎo)菌株生產(chǎn)低分子質(zhì)量β-葡聚糖,在廢物利用的同時提高土壤桿菌合成低分子質(zhì)量β-葡聚糖的活力,并對其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)、抗氧化活性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種

Agrobacteriumsp.ATCC 31749、Agrobacteriumsp.WS-8E3T(由甘油梯度適應(yīng)性馴化篩選獲得),均保藏于糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基 (g/L)：甘油100.0,酵母粉10.0,蛋白胨2.0,魚粉蛋白胨2.0,瓊脂粉 20.0,pH 7.0,121 ℃ 滅菌鍋滅菌20 min。

基礎(chǔ)鑒別培養(yǎng)基：酵母粉10.0 g/L,剛果紅溶液(10 mg/mL 剛果紅水溶液)0.5%(體積分?jǐn)?shù)),瓊脂粉 20.0 g/L,pH 7.0,115 ℃ 滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基 (g/L)：甘油 40.0,酵母粉 6.0,MgSO40.5,KH2PO41.5,pH 7.0,115 ℃滅菌30 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：甘油 100.0,酵母粉 6.0,KH2PO43.0,MgSO41.5,(NH4)2S043.0,pH 7.0,121 ℃ 滅菌20 min。

基礎(chǔ)馴化培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基。馴化過程中培養(yǎng)基中甘油質(zhì)量濃度以10 g/L為梯度增加至100 g/L,其他成分不變。

1.1.3 主要儀器

LC-2010A高效液相色譜儀,Waters；ICS5000離子色譜儀,美國Dionex公司；Thermo Nicolet NEXUS型傅里葉紅外光譜儀,美國尼高力公司；Avance Ⅲ型NMR光譜儀,德國Bruker公司。

1.1.4 主要試劑

木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸及半乳糖、剛果紅、高碘酸鉀、甘露糖、抗壞血酸,分析純,Sigma-Aldrich；Dextran 右旋糖苷標(biāo)準(zhǔn)品,色譜純,美國聚合物標(biāo)準(zhǔn)品公司；蛋白濃度測量試劑盒,碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純,國藥集團(tuán)(上海)。

1.2 土壤桿菌適應(yīng)性馴化選育過程

將Agrobacteriumsp.ATCC 31749在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后,按10%體積分?jǐn)?shù)的接種量接入含50 g/L甘油的馴化培養(yǎng)基中,于30 ℃、200 r/min 培養(yǎng) 16 h,然后按同樣方法連續(xù)傳代10次,取 0.1 mL 發(fā)酵液稀釋涂布到含有 50 g/L 甘油的鑒別培養(yǎng)基上,于30 ℃培養(yǎng)36 h,挑取菌落形態(tài)圓潤凸起、表觀透明、顏色深紅的單菌落接種到含60 g/L 馴化培養(yǎng)基的24 孔板中進(jìn)行下一輪馴化。在接下來馴化和篩選過程中,甘油質(zhì)量濃度逐漸增加至100 g/L。將高通量篩選獲得的菌株按方法 1.1.2 培養(yǎng)成種子液,按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接種到發(fā)酵搖瓶中,于30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)120 h。測定各菌株β-葡聚糖產(chǎn)量及分子質(zhì)量,篩選產(chǎn)低分子質(zhì)量β-葡聚糖的菌株。

1.3 遺傳穩(wěn)定性實驗

將獲得的Agrobacteriumsp.WS-8E3T連續(xù)傳代,在搖瓶中于30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)120 h,測量每一代 β-葡聚糖分子質(zhì)量、產(chǎn)量、微生物數(shù)量,驗證Agrobacteriumsp.WS-8E3T的遺傳特性是否穩(wěn)定。

1.4 不同分子質(zhì)量多糖的制備

對發(fā)酵液進(jìn)行乙醇分級沉淀操作(圖1)提取多糖,通過冷凍真空干燥得到分級醇沉粗多糖。

圖1 乙醇分級沉淀步驟Fig.1 The steps of ethanol fractionation preciptipation

1.5 分析測定方法

1.5.1 總糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[16]。

1.5.2 蛋白含量測定

利用紫外光譜掃描法,于200～500 nm進(jìn)行紫外掃描測定純化多糖中蛋白質(zhì)含量。

1.5.3 分子質(zhì)量的測定

采用高效液相色譜法。色譜條件:配有2414 示差檢測器的Waters e2695 高效液相色譜儀；UltrahydrogelTMLinear(300 mm×7.8 mm)凝膠柱；流動相 0.1 mol/L NaNO3；流速0.95 mL/min；柱溫45 ℃；進(jìn)樣體積15 μL。

1.5.4 單糖組成分析

按照LIU等[17]的方法稍作修改。將5 mg 樣品與2 mol/L 的三氟乙酸配制成5 mg/mL溶液于120 ℃金屬浴條件下水解,利用高效離子交換層析結(jié)合脈沖電流檢測器對單糖組成進(jìn)行分析。

1.5.5 紅外光譜分析

利用壓片法將樣品粉末與干燥的KBr混合于瑪瑙研缽中并進(jìn)行研磨,采用手動壓片的方式,在500～4 000 cm-1采集紅外光譜[18]。

1.5.6 核磁共振分析

利用0.5 mL D2O溶解20 mg多糖樣品,采用Agilent 400 MHz核磁共振儀進(jìn)行測定,采集樣品的核磁共振光譜。

1.5.7 抗氧化活性的測定

1.5.7.1 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基清除活性的測定如韋錚[19]所述,略有調(diào)整。將2 mL DPPH溶液和2 mL無水乙醇以不同濃度添加到2 mL樣品溶液中。漩渦振蕩后于室溫下35 min避光反應(yīng),測定517 nm處的吸光度。通過公式(1)計算DPPH自由基清除率：

(1)

式中：Ri,多糖溶液(2 mL)和 DPPH(2 mL)溶液混合后的吸光度值;Rj,多糖溶液(2 mL)和無水乙醇(2 mL)的吸光值;R0,DPPH溶液(2 mL)和無水乙醇(2 mL)的吸光值。

1.5.7.2 ·OH清除率的測定

測定510 nm處的吸光度[20],用蒸餾水較零。按公式(2)計算：

(2)

式中：Qi,多糖溶液的吸光度;Qj,樣品溶液在蒸餾水中的吸光度;Q0,蒸餾水吸光度。

1.5.7.3 還原力的測定

參照鐵氰化鉀法[21]。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 8.5軟件繪制圖表并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,KEGG分析代謝途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 適應(yīng)性馴化篩選結(jié)果

β-葡聚糖與堿性剛果紅溶液的結(jié)合具有高序匹配性,室溫下可以形成紅色物質(zhì)[22]。根據(jù)此特點,利用剛果紅鑒別平板對菌種進(jìn)行挑選,選擇透明、凸起、菌落大、紅色深的130株菌株進(jìn)行24孔板高通量篩選,以β-葡聚糖產(chǎn)量和分子質(zhì)量為指標(biāo),從中選取具有高菌種活力、高產(chǎn)量及低分子質(zhì)量的12株菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。復(fù)篩結(jié)果如圖2所示。經(jīng)過搖瓶復(fù)篩,發(fā)現(xiàn)在分子質(zhì)量差異較小的前提下,有4株菌在100g/L發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)β-葡聚糖的量較高,其中編號為 8E3T的菌株發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖穩(wěn)定性較高。將其命名為Agrobacteriumsp.WS-8E3T。

圖2 搖瓶復(fù)篩結(jié)果Fig.2 Rescreening results of shaking flask

2.2 遺傳穩(wěn)定性

工業(yè)生產(chǎn)中菌種經(jīng)過連續(xù)多次傳代后,會出現(xiàn)菌種退化而致使生產(chǎn)性能下降的情況。為驗證Agrobacteriumsp.WS-8E3T 的穩(wěn)定遺傳特性,連續(xù)傳代培養(yǎng)了6次,測定各代發(fā)酵參數(shù),實驗結(jié)果如表1 所示。從表1 可以看出,該菌株在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵120 h后,菌體量在(3.07±0.17) g/L,β-葡聚糖產(chǎn)量在 1.39 g/L,可穩(wěn)定產(chǎn)生分子質(zhì)量在2 800～3 600 Da之間的新型低分子質(zhì)量多糖BGOs,各項指標(biāo)較穩(wěn)定,具有較好的穩(wěn)定性。

表1 Agrobacterium sp.WS-8E3T 的遺傳穩(wěn)定性測試Table 1 Genetic stability test of Agrobacterium sp.WS-8E3T

2.3 代謝途徑分析

馴化株Agrobacteriumsp.WS-8E3T可以利用甘油生長并合成低分子質(zhì)量β-葡聚糖,而甘油在土壤桿菌中代謝途徑鮮有報道,但在Agrobacteriumsp.CGMCC 11546全基因組序列中卻可查到甘油代謝相關(guān)基因,這是一種glp系統(tǒng)編碼的沉默甘油分解代謝途徑?；诖?初步繪制了土壤桿菌中甘油合成低分子質(zhì)量β-葡聚糖的代謝途徑(圖3)。

如圖3所示,甘油在通道蛋白協(xié)助下進(jìn)入菌體內(nèi)部,然后在甘油磷酸化激酶、3-磷酸甘油脫氫酶、磷酸戊糖異構(gòu)酶的作用下形成3-磷酸甘油醛,進(jìn)入糖酵解及糖異生途徑,在糖異生途徑中,3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮在1,6-二磷酸果糖激酶的作用下產(chǎn)生的6-磷酸果糖異構(gòu)化為6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖變位成1-磷酸葡萄糖進(jìn)入合成途徑,在糖酵解途徑中,3-磷酸甘油醛進(jìn)入三羧酸循環(huán)途徑[23]提供菌體生長和BGOs合成所需能量。結(jié)果顯示,當(dāng)馴化菌株以甘油為底物進(jìn)行發(fā)酵時,合成BGOs的產(chǎn)率較低,原因可能是在代謝途徑中的兩段分支共存的條件下,大量ATP、UTP、(NADH+H+)、多種酶的合成所需Mg2+及能量因子的消耗降低了BGOs的合成能力。

圖3 Agrobacterium sp.WS-8E3T利用甘油合成 BGOs代謝途徑Fig.3 Metabolic pathway of Agrobacterium sp.WS-8E3T using glycerol for BGOs

2.4 產(chǎn)物組成及結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 紫外光譜分析

圖4 多糖的紫外光譜圖Fig.4 UV spectra of polysaccharides

從圖4可以看出,在波長280 nm處[24]沒有紫外吸收,說明經(jīng)純化得到的BGOs中蛋白質(zhì)含量可以忽略不計,對后續(xù)分子特性實驗無影響。

2.4.2 單糖組成及紅外光譜分析

使用離子色譜儀和傅里葉紅外光譜對新型多糖BGOs的單糖組成和官能團(tuán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果見圖5。

離子色譜儀共對比了8種單糖,各個組分的保留時間如圖5-a所示。經(jīng)測定,BGOs樣品中只含有一組峰,其保留時間與標(biāo)準(zhǔn)糖混合溶液中的葡萄糖的保留時間相同,證明了樣品是僅由葡萄糖單體組成的聚合物。

傅里葉紅外光譜可以對糖苷鍵類型進(jìn)行初步判斷,例如吡喃型糖環(huán)只有2個特征強(qiáng)吸收峰、β-和β-吡喃型糖苷鍵分別在840和890 cm-1有特征吸收峰[17]。按照1.1.5所述的方法,對BGOs的官能團(tuán)信息和糖苷鍵類型進(jìn)行分析,特征吸收峰結(jié)果如圖5-b 所示。BGOs在波數(shù)890.6和1 272.2 cm-1處有特征吸收峰,而在840和790 cm-1處無吸收峰,說明BGOs為β-糖苷鍵構(gòu)型。另外在波數(shù)為3 351.7(—OH)、2 893.7 (—CH3—或—CH2)、1 657.4及1 272.2 cm-1處有多糖的特征吸收峰,而在1 616 cm-1處無—NH2的吸收峰,說明不存在蛋白質(zhì)多糖,與紫外掃描光譜一致。1 028.9、1 166.6 cm-1處的吸收峰表示BGOs中的糖環(huán)構(gòu)型是吡喃型。由此推測,BGOs為β-吡喃型葡萄糖苷鍵鏈接的多糖。

a-單糖組成分析圖;b-紅外光譜圖 1-巖藻糖；2-鼠李糖；3-阿拉伯糖；4-半乳糖；5-葡萄糖； 6-木糖；7-甘露糖；8-果糖圖5 BGOs的單糖組成及紅外光譜分析Fig.5 The monosaccharide compositions analysis and FT-IR spectra of BGOs

2.4.3 核磁共振分析

核磁共振圖譜可以分析多糖的糖苷鍵型,比如:氫譜中,α型糖苷鍵質(zhì)子信號一般小于5 ppm,α型糖苷鍵大于5 ppm,碳譜中,異頭碳和非異頭碳的信號主要分別出現(xiàn)在90～110和60～85 ppm處,C-1的出峰位置基于α-構(gòu)型和β-連接的化學(xué)位移范圍分別是δ90-102和δ102-112[25]。按照1.5.6所述的方法,對BGOs的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果如圖6所示。

由圖6-a可以看出,BGOs的H1質(zhì)子信號出現(xiàn)在5.22 ppm處,說明是單一β-型糖苷鍵,且在5.22(s,1H,OH-6)、4.82(m,2H,OH-2,OH-4)、4.56(s,1H,OH-6)、3.92(s,1H,H-6)、3.65(m,2H,H-3,H-6)、3.43(m,3H,H-4,H-2,H-5) ppm 處出現(xiàn)異頭質(zhì)子信號,說明BGOs是由單一的β-1,3-糖苷鍵相連。由圖6-b可以看出,BGOs只有一個異頭碳信號,且它的主干信號均出現(xiàn)在109.69 (C-1)、85.38 (C-3)、83.39 (C-2)、77.55 (C-4)、81.85(C-5) 以及72.47 (C-6) ppm處,說明 BGOs是沒有分支的單鏈。以上結(jié)果與紅外光譜和單糖組成分析結(jié)果一致。

a-1H-NMR;b-13C-NMR圖6 BGOs核磁共振圖譜Fig.6 NMR spectra of BGOs

2.5 分子質(zhì)量分析

高效凝膠過濾色譜法測定了純化后多糖的分子質(zhì)量(Mw)與保留時間(t)關(guān)系,以lgMw為縱坐標(biāo),t為橫坐標(biāo),多糖分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7-a所示,為lgMw=-0.141 1t+6.068,R2=0.997 4。

a-多糖分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線;b-BGOs的高效凝膠色譜圖圖7 高效凝膠色譜圖Fig.7 High performance gel chromatogram

BGOs分子質(zhì)量如圖7-b所示,樣品的保留時間為18.167 min,由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出其相對分子質(zhì)量為3.218 kDa,研究表明,低分子質(zhì)量β-葡聚糖更容易發(fā)揮其多功能性[26],通過適應(yīng)性馴化的菌株利用甘油生產(chǎn)的BGOs分子質(zhì)量分布均勻,將具有廣闊的市場應(yīng)用潛力。

2.6 抗氧化性能研究

2.6.1 DPPH自由基清除率

多糖溶液與DPPH自由基反應(yīng)生成紫色,顏色變化程度與多糖清除自由基的能力有一定的劑效關(guān)系[27]。BGOs對DPPH自由基清除能力如圖8-a所示。在與BGOs濃度相近的濃度下,抗壞血酸具有較高的DPPH自由基清除能力。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時,BGOs對DPPH自由基的清除能力接近(78.95±2.35)%,且增長趨勢趨于平緩,許女等[28]研究表明,雞腿菇子實體多糖質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時,對DPPH自由基清除率為48.4%,說明BGOs在較低濃度下即可達(dá)到食用菌多糖同等效果。

2.6.2 ·OH清除率

圖8-b顯示,BGOs具有較強(qiáng)的·OH清除能力,這一發(fā)現(xiàn)與DPPH自由基清除能力的結(jié)果一致,在實驗濃度范圍內(nèi),BGOs對·OH的清除程度為(80.5±1.4)%。隨著BGOs濃度的增大,·OH清除率隨之增大,并且表現(xiàn)出了一定的伴隨性。

2.6.3 鐵還原力

在鐵還原體系中,具有強(qiáng)還原力的多糖可以還原Fe3+為Fe2+,因此可以通過顏色變化(吸光值的變化)來判斷多糖的還原能力。由圖8-c可知,隨著底物濃度的增加,BGOs呈現(xiàn)出一定程度的還原作用,當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時,吸光值達(dá)到(1.70±0.04),說明BGOs可以作為一種良好的電子供應(yīng)者。綜上所述,通過對不同濃度BGOs作用下各抗氧化性指標(biāo)的檢測,表明BGOs具有良好的抗氧化活性。

a-BGOs的DPPH清除速率;b-BGOs的·OH清除速率;c-BGOs的還原力圖8 抗氧化活性測定Fig.8 Determination of antioxidant activities

3 結(jié)論

本研究將甘油作為碳源,采取梯度馴化的方法,通過40、60、80、100 g/L甘油連續(xù)傳代培養(yǎng)選育,結(jié)合剛果紅平板初篩、高通量篩選和搖瓶復(fù)篩的方法,以初始產(chǎn)率及分子質(zhì)量為目標(biāo),篩選獲得了1株以甘油為碳源、可穩(wěn)定獲得低分子質(zhì)量多糖的高活力菌株Agrobacteriumsp.WS-8E3T,該菌株在100 g/L甘油質(zhì)量濃度下發(fā)酵120 h,可穩(wěn)定產(chǎn)生分子質(zhì)量在2 800～3 600 Da的新型低分子質(zhì)量多糖BGOs。經(jīng)過結(jié)構(gòu)鑒定,判斷該BGOs為β-1,3-葡聚糖,并具有一定的抗氧化活性。在實驗濃度范圍內(nèi),BGOs的DPPH自由基和·OH清除效果可達(dá)到抗壞血酸的80%,還原力可達(dá)到抗壞血酸的50%,隨著質(zhì)量濃度的增加,呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性,表明其具有良好的抗氧化活性。

研究結(jié)果顯示,通過馴化的方式獲得低分子質(zhì)量多糖具有可行性。該多糖呈現(xiàn)出的抗氧化活性,體現(xiàn)出了其作為功能性多糖的多應(yīng)用性。此外還需進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基組成、探索代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá),以提高BGOs的產(chǎn)量并探究BGOs的潛在功能性,進(jìn)一步確定BGOs作為新型營養(yǎng)素、食品添加劑或抗氧化補(bǔ)充劑的適用性。