李杰,田俊宇,季圓清,元躍,徐慶陽,陳寧,范曉光

(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457)

L-蘇氨酸是人體必需氨基酸之一,具有恢復(fù)疲勞、促進(jìn)生長發(fā)育的效果,被廣泛應(yīng)用于食品、飼料和醫(yī)療等領(lǐng)域[1]。大腸桿菌是蘇氨酸的主要發(fā)酵菌株,通過對大腸桿菌系統(tǒng)改造能夠有效提升蘇氨酸產(chǎn)量[2]。例如,過表達(dá)蘇氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶以優(yōu)化碳代謝流；弱化競爭支路以積累可利用的前體物；降低胞內(nèi)蘇氨酸消耗；提高胞外運(yùn)輸?shù)萚3-6]。此外,通過優(yōu)化碳氮源、溶氧等發(fā)酵條件,蘇氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量進(jìn)一步提升[7]。最近,研究者在蘇氨酸發(fā)酵過程中加入甜菜堿,提升了發(fā)酵菌株的耐高滲能力以及產(chǎn)酸能力[8]。

甜菜堿是在甜菜糖蜜中發(fā)現(xiàn)的季銨型生物堿,與蛋氨酸、膽堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)比較相似[9]。甜菜堿是高效的甲基供體,對脫氮假單胞菌維生素B12的生物合成具有促進(jìn)作用[10-11]。甜菜堿還是一種重要的細(xì)胞相容性溶質(zhì),在滲透調(diào)節(jié)方面和保持酶活力方面具有重要作用。YING等[12]比較了4種不同的滲透壓保護(hù)劑海藻糖、甘氨酸、甜菜堿、脯氨酸對賴氨酸發(fā)酵的影響,發(fā)現(xiàn)甜菜堿比其他物質(zhì)更能促進(jìn)發(fā)酵菌株的生長以及產(chǎn)物積累。XU等[13]在研究乳酸發(fā)酵時發(fā)現(xiàn),甜菜堿的加入能夠提升高糖濃度下乳酸菌的細(xì)胞生長速率和乳酸脫氫酶的活力,進(jìn)而提高乳酸產(chǎn)量。隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展,從整體水平上研究細(xì)胞的生命活動現(xiàn)象已成為可能。通過定量分析細(xì)胞成分的變化情況,能夠全面地描述并預(yù)測細(xì)胞的代謝過程。因此,本研究以蘇氨酸生產(chǎn)菌株EscherichiacoliTHRD 為研究對象,采用代謝組學(xué)技術(shù),考察產(chǎn)酸期甜菜堿作用下大腸桿菌胞內(nèi)代謝物組成和含量的動態(tài)變化,篩選出與蘇氨酸合成代謝相關(guān)的差異代謝物,從代謝層面揭示甜菜堿對大腸桿菌的作用效果。

1 材料與方法

1.1 蘇氨酸發(fā)酵菌株及培養(yǎng)條件

蘇氨酸生產(chǎn)菌株E.coliTHRD保存于天津科技大學(xué)菌種保藏中心[14]。

種子培養(yǎng)基：蔗糖2.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酵母粉1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、蛋白胨0.6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、KH2PO40.12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、MgSO40.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、FeSO410 mg/L、MnSO410 mg/L、維生素B11.3 mg/L、維生素H 0.3 mg/L、消泡劑1～2滴。調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2。滅菌條件：115 ℃,15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酵母粉0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、蛋白胨0.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、檸檬酸鈉0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、KH2PO40.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、MgSO40.07%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、FeSO4100 mg/L、MnSO4100 mg/L、維生素B10.8 mg/L、維生素H 0.2 mg/L、消泡劑3～5滴。調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2。滅菌條件：115 ℃,15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)方法：將3 mL培養(yǎng)好的種子液接種到裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶(500 mL)中,在37 ℃、220 r/min下培養(yǎng)菌體24 h。以添加0.5 g/L甜菜堿的發(fā)酵培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)組,無添加甜菜堿的為對照組。在發(fā)酵過程中,實(shí)驗(yàn)組補(bǔ)加含2 g/L甜菜堿的60%的葡萄糖溶液,對照組補(bǔ)加60%的葡萄糖溶液。

1.2 發(fā)酵菌體收集及胞內(nèi)代謝物提取

在取樣時間點(diǎn)用移液器快速量取1 mL發(fā)酵液,13 000 r/min、-4 ℃下離心3 min,用PBS洗滌2次后離心收集菌體。將菌體置于液氮中研磨成粉末,用天平稱取50 mg粉末置于1.5 mL離心管中,加入1 mL預(yù)冷的乙腈提取液,振蕩均勻后置于液氮中1 min,取出等待融化,如此反復(fù)凍融3次,使胞內(nèi)代謝物逐漸被提取液溶出。13 000 r/min、-4 ℃下離心10 min,取上清液100 μL轉(zhuǎn)移至內(nèi)襯管中,待測。

1.3 胞內(nèi)代謝物檢測條件

使用超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(ultra-high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC Q-TOF MS)分析胞內(nèi)代謝物。ACQUITY BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)。UPLC采用正負(fù)2種離子模式進(jìn)行采集。正離子模式的流動相A為0.1%甲酸溶液,流動相B為0.1%甲酸-乙腈溶液。負(fù)離子模式的流動相A為0.1%氨水溶液,流動相B為乙腈溶液。進(jìn)樣量5 μL,進(jìn)樣流速0.5 mL/min,柱溫35 ℃,梯度洗脫程序參照文獻(xiàn)[15]。Q-TOF采用ESI+和ESI-掃描模式,離子源溫度100 ℃,質(zhì)核比掃描范圍50～10 000m/z,數(shù)據(jù)采集模式為Centroid。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將所采集的數(shù)據(jù)使用Masslynx和Progenesis QI軟件(Waters,Milford,USA)進(jìn)行色譜峰的導(dǎo)入、峰對齊、峰提取以及歸一化處理。采用無監(jiān)督主成分分析(principal component analysis,PCA)和有監(jiān)督正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)進(jìn)行多元統(tǒng)計分析。為了驗(yàn)證多元統(tǒng)計分析篩選出的變量是否不同,還利用了 Progenesis QI與SPSS軟件進(jìn)行了差異性檢驗(yàn)(t檢驗(yàn))與差異倍數(shù)檢驗(yàn)(fold change)與變量投影重要性指標(biāo)(variable importance projection,VIP)以確定顯著差異代謝物。根據(jù)差異代謝物的質(zhì)荷比、保留時間以及二級碎片信息,通過Progenesis QI軟件在HMDB以及KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索確定其結(jié)構(gòu)是否與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一致。將鑒定無誤的差異代謝物輸入Metaboa Analyst 3.0和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析、

2.1 甜菜堿作用下大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)蘇氨酸

考察了添加甜菜堿對E.coliTHRD搖瓶發(fā)酵產(chǎn)蘇氨酸的影響。發(fā)酵過程中菌體的生物量變化情況如圖1-a所示,對照組中最高生物量達(dá)到19.05 g/L,與實(shí)驗(yàn)組中最高生物量(20.83 g/L)較為接近,說明甜菜堿的加入不會影響細(xì)胞的正常生長。發(fā)酵過程中對照組和實(shí)驗(yàn)組的葡萄糖消耗量均為135 g/L,產(chǎn)物積累情況如圖1-b所示,24 h對照組中蘇氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別為50.74 g/L和37.45%,與之相比,實(shí)驗(yàn)組中蘇氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率則分別為54.59 g/L和40.69%,分別增加了7.58%和8.65%。由此可以看出,甜菜堿的加入能提高E.coliTHRD的發(fā)酵產(chǎn)酸能力和糖酸轉(zhuǎn)化率。

a-細(xì)胞干重;b-蘇氨酸產(chǎn)量圖1 甜菜堿添加對大腸桿菌細(xì)胞生長和發(fā)酵生產(chǎn) 蘇氨酸的影響Fig.1 Effect of glycine betaine addition on cell growth and threonine production of E.coli THRD

2.2 甜菜堿作用下大腸桿菌胞內(nèi)差異代謝物分析

2.2.1 PCA

根據(jù)2.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取發(fā)酵對數(shù)中期12 h以及對數(shù)后期18 h作為取樣點(diǎn),將對照組和實(shí)驗(yàn)組分別標(biāo)記為Con-12、Con-18、Bet-12和Bet-18,每個組包括6個平行發(fā)酵樣本。將質(zhì)譜測定的胞內(nèi)代謝物相對含量的數(shù)值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化處理,再使用PCA技術(shù)處理后得到正、負(fù)離子模式下的PCA得分圖,如圖2所示。PCA是一種無監(jiān)督的多維統(tǒng)計分析方法,能從總體上反應(yīng)各組樣本之間的總體代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。圖2-a和2-b中各組6個樣本緊密聚集,表明組內(nèi)重復(fù)性好,各組間樣本存在明顯分離狀態(tài),表明組間差異性較大。圖中QC表示控制樣本,QC緊密聚集,說明實(shí)驗(yàn)儀器操作重復(fù)性良好,所得數(shù)據(jù)可靠。

a-正離子模式；b-負(fù)離子模式圖2 不同離子模式下的PCA得分圖Fig.2 PCA scoring plots under different ion modes

2.2.2 OPLS-DA

使用OPLS-DA分析正、負(fù)離子模式下Con-12和Bet-12,以及Con-18和Bet-18之間的差異代謝物,結(jié)果如圖3所示。圖中各組樣本分成明顯的2個群且都位于橢圓(95%的置信區(qū)間)內(nèi),說明2個組別的代謝物有明顯的差異。負(fù)離子模式下OPLS-DA模型的Q2<0.5(圖3-b)，說明該模型對于正離子模式下Con-18和Bet-18之間的差異代謝物的預(yù)測能力有限。OPLS-DA模型參數(shù)中的Q2>0.5(圖3-c和3-d)，表示模型預(yù)測能力較好。

a-正離子模式Con-12 vs Bet-12；b-正離子模式Con-18 vs Bet-18；c-負(fù)離子模式Con-12 vs Bet-12；d-負(fù)離子模式Con-18 vs Bet-18圖3 不同離子模式下的OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA scoring plots under different ion modes

2.2.3 顯著差異代謝物的篩選

結(jié)合多元統(tǒng)計分析OPLS-DA的VIP值和單變量統(tǒng)計分析t檢驗(yàn)P值來篩選不同比較組間的顯著差異代謝物,其中以VIP≥1和P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)得到顯著差異代謝物178個,與蘇氨酸合成代謝相關(guān)的顯著差異代謝物有28個,分布在糖酵解(Embden-Meyerhof-Parnas,EMP)途徑、磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway,PPP)、三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)以及氨基酸代謝途徑,結(jié)果如表1所示。

表1 與蘇氨酸合成代謝相關(guān)的顯著差異代謝物Table 1 Significant differential metabolites related to threonine biosynthesis

2.3 結(jié)合代謝通路解析甜菜堿對大腸桿菌合成蘇氨酸的影響

蘇氨酸屬于天,其合成與葡萄糖中心代謝以及天冬氨酸支路代謝密切相關(guān)。蘇氨酸合成是一個高還原力(還原型輔酶Ⅱ,NADPH)需求的過程,而細(xì)胞內(nèi)NADPH主要通過PPP途徑提供,因此葡萄糖向EMP途徑和PPP途徑的代謝流量分配會直接影響蘇氨酸的合成。如圖4所示,Bet-12組6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛的相對含量與Con-12組相比分別下降了55%和49%,而6-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖酸的相對含量與Con-12組相比分別上升了13%和312%。Bet-18組6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛的相對含量與Con-18組相比分別下降了48%和82%,而5-磷酸木酮糖和4-磷酸赤蘚糖的相對含量與Con-18組相比分別上升了44%和198%。以上結(jié)果表明,在蘇氨酸合成期加入甜菜堿對葡萄糖代謝分配的影響是持續(xù)性的,葡萄糖流經(jīng)EMP途徑的代謝通量減弱,而流經(jīng)PPP途徑的代謝通量增強(qiáng)。細(xì)胞通過PPP途徑回補(bǔ)缺失的6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛。這一過程雖然伴隨著碳源的損失,但為蘇氨酸合成提供了充足的NADPH,從而使得Bet-12組和Bet-18組的蘇氨酸相對含量明顯提升。蘇躍穩(wěn)[16]利用MATLAB軟件考察了甜菜堿對蘇氨酸菌種代謝流分布的影響,發(fā)現(xiàn)添加甜菜堿后細(xì)胞內(nèi)葡萄糖流向PPP途徑的代謝流量提高了57.3%。LI等[17]發(fā)現(xiàn)甜菜堿的添加能夠提升蘇氨酸菌種6-磷酸果糖脫氫酶的酶活力以及其編碼基因zwf的表達(dá)量,6-磷酸果糖脫氫酶催化的反應(yīng)伴隨著NADPH的形成,因此為蘇氨酸的合成提供了更多的還原力。上述研究結(jié)果與本研究代謝組學(xué)的分析結(jié)果一致。

天冬氨酸作為蘇氨酸合成的重要前體物,是由草酰乙酸接受谷氨酸轉(zhuǎn)移的氨基形成的,該反應(yīng)由谷-草轉(zhuǎn)氨酶催化。細(xì)胞內(nèi)天冬氨酸的合成量與底物草酰乙酸和谷氨酸的供給情況密切相關(guān)。從圖4可知,Bet-12組和Bet-18組谷氨酸的相對含量與Con-12組和Con-18組相比分別提高了21%和49%,脯氨酸的相對含量與Con-12組和Con-18組相比分別下降了25%和77%,說明在蘇氨酸合成期加入甜菜堿有助于增強(qiáng)谷氨酸的合成代謝,弱化谷氨酸的支路代謝,進(jìn)而為轉(zhuǎn)氨反應(yīng)提供充足的底物。在大腸桿菌中,草酰乙酸的供應(yīng)主要有2種途徑,一種是通過TCA循環(huán),另一種是通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的CO2固定反應(yīng)。Bet-12組乙酰輔酶A、檸檬酸和α-酮戊二酸的相對含量與Con-12組相比分別下降了64%、11%和18%,而琥珀酸和蘋果酸的相對含量與Con-12組相比變化不大,說明在蘇氨酸合成早期加入甜菜堿會減弱草酰乙酸到檸檬酸的代謝,增強(qiáng)磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸的代謝。Bet-18組乙酰輔酶A、檸檬酸和α-酮戊二酸的相對含量與Con-12組相比分別上升了307%、49%和44%,而琥珀酸和蘋果酸的相對含量與Con-12組相比分別下降了33%和42%,說明在蘇氨酸合成中后期加入甜菜堿會強(qiáng)化整個TCA循環(huán)的代謝通量流向草酰乙酸和谷氨酸?？傮w來說,甜菜堿加入有助于細(xì)胞積累谷氨酸和草酰乙酸用于合成前體物天冬氨酸,從而使得Bet-12組和Bet-18組的蘇氨酸相對含量明顯提升。郭群群[18]研究了甜菜堿對蘇氨酸生物合成關(guān)鍵酶活性的影響,發(fā)現(xiàn)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性提高了16.3%,草酰乙酸的合成量有了明顯提高。此外,甜菜堿能夠上調(diào)乙酰輔酶A合成酶基因和檸檬酸合成酶基因的轉(zhuǎn)錄水平,提升TCA循環(huán)的代謝通量。上述研究結(jié)果與本研究代謝組學(xué)的分析結(jié)果一致。

圖4 甜菜堿對大腸桿菌胞內(nèi)代謝的影響Fig.4 Effect of betaine on intracellular metabolism of E.coli THRD 注：圖中白色斜紋條表示不加甜菜堿組,黑色條表示加甜菜堿組；所有的胞內(nèi)代謝物含量均進(jìn)行了歸一化處理；代謝物縮寫如下：G1P,1-磷酸果糖;G6P,6-磷酸葡萄糖;6PG,6-磷酸葡萄糖酸;Ribu5P,5-磷酸核酮糖;R5P,5-磷酸核糖;S7P,7-磷酸景天庚酮糖;X5P,5-磷酸木酮糖;E4P,4-磷酸赤蘚糖;F6P,6-磷酸果糖;GAP,3-磷酸甘油醛;PEP,磷酸烯醇式丙酮酸;Cit,檸檬酸;α-KG,α-酮戊二酸;Suc,琥珀酸;Fum,延胡索酸;Mal,蘋果酸;Oxa,草酰乙酸;Asp,L-天冬氨酸;Lys,L-賴氨酸;Thr,L-蘇氨酸;Ile,L-異亮氨酸;Met,L-甲硫氨酸;Glu,L-谷氨酸;Arg,L-精氨酸;Pro,L-脯氨 酸;Ser,L-絲氨酸;Ala,L-丙氨酸;Val,L-纈氨酸;Leu,L-亮氨酸

大腸桿菌內(nèi)其他氨基酸的合成會競爭性的影響葡萄糖流經(jīng)蘇氨酸的代謝通量,因此對其他氨基酸濃度進(jìn)行監(jiān)測有助于進(jìn)一步理解甜菜堿的作用效果。從圖4可知,Bet-12組和Bet-18組絲氨酸的相對含量與Con-12組和Con-18組相比分別下降了22%和25%,說明在蘇氨酸合成期加入甜菜堿會減弱3-磷酸甘油醛向絲氨酸的支路代謝,增加了3-磷酸甘油醛的供給。Bet-18組丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸的相對含量與Con-18組相比變化不大,說明甜菜堿的加入不會顯著影響丙酮酸向這些氨基酸的支路代謝。Bet-18組賴氨酸和異亮氨酸的相對含量與Con-18組相比分別下降了16%和10%,說明甜菜堿的加入會減少天冬氨酸和蘇氨酸的支路代謝,促進(jìn)蘇氨酸的合成。Bet-18組高絲氨酸的相對含量與Con-18組相比下降了73%,而甲硫氨酸和蘇氨酸的相對含量與Con-18組相比分別提高了60%和276%,說明甜菜堿的加入會促進(jìn)高絲氨酸的支路代謝,但更偏向于促進(jìn)高絲氨酸向蘇氨酸的轉(zhuǎn)化。

3 結(jié)論

為了提高蘇氨酸的合成效率,本研究在蘇氨酸發(fā)酵過程中加入甜菜堿,并利用代謝組學(xué)系統(tǒng)分析了甜菜堿對大腸桿菌合成蘇氨酸的影響。發(fā)酵結(jié)果表明,甜菜堿的加入能夠明顯提高大腸桿菌的蘇氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率。組學(xué)結(jié)果表明,甜菜堿的加入能夠改變EMP以及PPP途徑的碳流分配,使得更多的葡萄糖流經(jīng)PPP途徑為蘇氨酸的合成提供還原力；能夠動態(tài)調(diào)節(jié)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的CO2固定反應(yīng)和TCA循環(huán),使細(xì)胞能夠積累更多的草酰乙酸和谷氨酸用于合成蘇氨酸；能夠減弱絲氨酸、賴氨酸和異亮氨酸的合成,減少3-磷酸甘油醛、天冬氨酸以及蘇氨酸的支路代謝。本研究從代謝層面揭示了甜菜堿的作用效果,為甜菜堿在其他工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)品中的應(yīng)用提供了理論參考。后續(xù)研究需要進(jìn)一步考察關(guān)鍵代謝節(jié)點(diǎn)處的酶表達(dá)以及酶活力變化情況,從分子層面闡明甜菜堿對于大腸桿菌的作用方式和作用機(jī)制。