陳宇錕,黎青華,周景文,張國(guó)強(qiáng)*,李江華

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

α-淀粉酶 (EC 3.2.1.1) 是一類重要的工業(yè)酶,它可以催化水解淀粉等碳水化合物分子內(nèi)部的α-D-(1,4)-糖苷鍵,廣泛應(yīng)用于淀粉糖化、烘焙、紡織等行業(yè)[1-2]。目前,α-淀粉酶仍存在發(fā)酵酶活力低或耐酸、耐熱性不足等問題,并不能完全滿足工業(yè)需求[3]。地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis) 是產(chǎn)α-淀粉酶的重要宿主,具有耐熱,蛋白分泌能力強(qiáng)等特點(diǎn),在淀粉酶發(fā)酵工業(yè)中具有廣泛應(yīng)用[4]。同時(shí),地衣芽孢桿菌作為一種很有潛力的底盤細(xì)胞,在代謝工程、酶工程等領(lǐng)域也備受關(guān)注,實(shí)現(xiàn)了不同酶的高效表達(dá)。然而,關(guān)于地衣芽孢桿菌遺傳操作系統(tǒng)雖然已有報(bào)道[5-10],但是現(xiàn)階段的遺傳操作方法仍存在效率低及不穩(wěn)定等問題。

近年來,基于自動(dòng)化和儀器分析技術(shù)的高通量篩選平臺(tái)突破了人工篩選在效率、穩(wěn)定性和標(biāo)準(zhǔn)化等方面的限制,成為菌種選育與工業(yè)酶改造篩選的重要方法。其中,液滴微流控是一種將反應(yīng)體系微型化的技術(shù),被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)以及微生物、酶的高通量篩選[11-16]。該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)在微體積、大小均一的液滴中對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、反應(yīng)、檢測(cè)和篩選,具有篩選成本低、效率高 (106/h) 等優(yōu)勢(shì)[17]。AGRESTI等[18]利用液滴微流控體系對(duì)辣根過氧化物酶進(jìn)行定向進(jìn)化,通過對(duì)107個(gè)酵母細(xì)胞表面展示的突變體篩選,10 h內(nèi)成功將酶活性提高10倍。HUANG等[19]利用液滴微流控系統(tǒng)篩選誘變處理的α-淀粉酶分泌酵母菌株,對(duì)篩選到的高淀粉酶分泌菌株全基因組測(cè)序,并解析其分泌機(jī)制。

本研究基于實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的產(chǎn)α-淀粉酶地衣芽孢桿菌BLH菌株及其突變體庫,通過單細(xì)胞液滴制備、液滴反應(yīng)時(shí)間與篩選電壓等條件優(yōu)化,建立了高效的產(chǎn)α-淀粉酶地衣芽孢桿菌液滴微流控篩選方法,最終獲得5株高產(chǎn)α-淀粉酶突變菌株。本研究利用高通量篩選方法實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)淀粉酶地衣芽孢桿菌的高效進(jìn)化篩選,也為其他高性能蛋白表達(dá)分泌宿主的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種及培養(yǎng)基

本研究所用的產(chǎn)α-淀粉酶地衣芽孢桿菌BLH及其突變體庫為實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5,胰蛋白胨10,NaCl 10,固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉34；TB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉24,胰蛋白胨12,磷酸氫二鉀12.54,磷酸二氫鉀2.31,甘油5。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料

DQ淀粉底物 (BODIPY熒光素偶聯(lián)淀粉),賽默飛;2% Pico-Surf in Novec 7500/FC40,Dolomite;Droplet Generation Oil for EvaGreen,Bio-Rad;可溶性淀粉及其他化學(xué)試劑,國(guó)藥集團(tuán)。

二硝基水楊酸 (dinitrosalicylic acid,DNS) 還原糖測(cè)定試劑：稱取6.3 g DNS并量取262 mL 2 mol/L NaOH加到酒石酸鉀鈉的熱溶液中 (182 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL去離子水中),再加入5 g結(jié)晶酚和5 g亞硫酸氫鈉,攪拌溶解,冷卻后定容至1 000 mL,貯存于棕色瓶中,放置7 d后使用。

緩沖液 (pH=6.0)：稱取45.23 g Na2HPO4·12H2O和8.07 g一水合檸檬酸,用去離子水溶解并定容至1 000 mL,用pH計(jì)校正后使用。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

本研究用到的液滴微流控平臺(tái)包括液滴生成系統(tǒng)、光路系統(tǒng)和分選系統(tǒng)等部分。其中,微液滴生成系統(tǒng)包括液滴生成芯片及微量注射泵,光路系統(tǒng)包括激光器及熒光數(shù)據(jù)采集器,篩選系統(tǒng)包括高壓放大器及液滴微流控分選芯片[20]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 α-淀粉酶熒光檢測(cè)方法

將DQ淀粉配制成質(zhì)量濃度為200 μg/mL的溶液,取標(biāo)準(zhǔn)α-淀粉酶溶液稀釋至不同濃度,分別取50 μL DQ淀粉溶液和50 μL不同濃度的α-淀粉酶溶液加入到熒光檢測(cè)專用酶標(biāo)板中,測(cè)定不同時(shí)間的熒光值 (Ex=488 nm/Em=520 nm),以驗(yàn)證熒光強(qiáng)度與酶活力及反應(yīng)時(shí)間的相關(guān)性關(guān)系。

1.2.2 單細(xì)胞制備方法

將出發(fā)菌株單菌落或突變體庫接種于3 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃ 250 r/min培養(yǎng)10～12 h至OD600=2.0左右。此時(shí)菌體處于指數(shù)生長(zhǎng)期,為菌絲狀態(tài),無法用于單細(xì)胞液滴包埋。因此,將菌液超聲處理1～4 min (950 W,2%,超聲5 s,停5 s),并在顯微鏡下觀察單細(xì)胞分散效果,選擇細(xì)胞分散效果最好且菌體破碎較少的處理時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn),再用5 μm濾膜除去大顆粒及未徹底分散的菌絲,制備獲得單細(xì)胞。

1.2.3 單細(xì)胞液滴包埋方法

用LB培養(yǎng)基清洗突變體庫單細(xì)胞菌體3遍,并將OD600值調(diào)整至0.07,利用液滴生成芯片制備單細(xì)胞液滴。水相為含突變體菌體的LB培養(yǎng)基懸液,其中含有終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的DQ淀粉,總體積400 μL；油相為2% Pico-Surf in FC40、2% Pico-Surf in Novec 7500或者Bio-Rad液滴生成油。將油相和水相分別吸到1 mL無菌注射器內(nèi),注射器安裝到微量注射泵中并用導(dǎo)管與芯片連接,設(shè)定油相流速為400 μL/h,水相流速為200 μL/h,生成直徑約為20 μm的單細(xì)胞液滴,用裝有200 μL對(duì)應(yīng)油相的1 mL無菌注射器收集液滴。將裝有單細(xì)胞液滴的注射器放置在37 ℃下避光靜置培養(yǎng),定時(shí)取樣觀察液滴,評(píng)價(jià)液滴穩(wěn)定性,選擇液滴最穩(wěn)定的油相進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 突變體庫的液滴微流控篩選

將收集到的單細(xì)胞液滴放置在37 ℃下靜置培養(yǎng),定時(shí)取樣觀察液滴中的熒光變化情況,選擇適宜的培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行液滴微流控篩選。篩選時(shí)將裝有油相和液滴的注射器安裝到微量注射泵中,用導(dǎo)管將注射器出口連接到微流控液滴分選芯片對(duì)應(yīng)的入口,設(shè)置油相流速為200 μL/h、液滴流速為10～15 μL/h,此時(shí)液滴流速約為500～1 000個(gè)/s。將藍(lán)色激光 (488 nm) 對(duì)準(zhǔn)篩選芯片的檢測(cè)點(diǎn),并采集每個(gè)液滴的綠色熒光信號(hào) (520 nm),針對(duì)熒光強(qiáng)度最高的30%左右的液滴進(jìn)行加電,電壓設(shè)置為300 或500 V,使這些液滴流向篩選芯片的液滴收集出口,將收集到的液滴涂布到LB平板上。

1.2.5 篩選后菌株搖瓶發(fā)酵

從平板上挑取若干經(jīng)液滴微流控篩選出的單菌落接種到2 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃ 250 r/min培養(yǎng)12 h作為種子液,同時(shí)接種出發(fā)菌株作為對(duì)照。初篩時(shí)將種子液按1%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有10 mL TB培養(yǎng)基的100 mL搖瓶中,復(fù)篩時(shí)按起始OD600=0.05進(jìn)行轉(zhuǎn)接,37 ℃ 250 r/min培養(yǎng)72 h。測(cè)定發(fā)酵液OD600值,并用DNS法測(cè)定上清液中的α-淀粉酶活性。

1.2.6 酶活力測(cè)定方法

用DNS法[21]測(cè)定發(fā)酵液上清液中的α-淀粉酶活性,具體方法如下：將可溶性淀粉加去離子水煮沸至完全透明,配制成2%的溶液作為酶反應(yīng)底物,取300 μL底物和100 μL pH=6.0緩沖液到試管中,70 ℃預(yù)熱2 min,再加入100 μL適當(dāng)稀釋的發(fā)酵上清液,70 ℃準(zhǔn)確反應(yīng)5 min后,加入500 μL DNS試劑終止反應(yīng),沸水浴10 min,冰上冷卻至室溫后,將顯色后的反應(yīng)液用去離子水稀釋4倍并測(cè)定540 nm下的吸光值,以滅活酶為對(duì)照,根據(jù)葡萄糖制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算體系中的還原糖量 (以葡萄糖計(jì)),計(jì)算發(fā)酵液上清液中的α-淀粉酶活性,1 U酶活力定義為：1 min降解可溶性淀粉生成1 mg葡萄糖當(dāng)量的還原性糖的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-淀粉酶熒光檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化

本研究中所用DQ淀粉底物骨架上嵌合有BODIPY熒光素,初始狀態(tài)下熒光素處于淀粉顆粒內(nèi)部,無法被激發(fā)產(chǎn)生熒光。當(dāng)?shù)矸郾坏矸勖杆鈺r(shí),淀粉鏈打開,其中的熒光素暴露出來,能被激發(fā)產(chǎn)生熒光,而淀粉水解速度與酶活性具有相關(guān)性,所以可以通過熒光強(qiáng)度檢測(cè)酶活力高低[22]。為建立DQ淀粉底物熒光強(qiáng)度與酶活力的相關(guān)性曲線,將不同酶活力的α-淀粉酶溶液與DQ淀粉底物溶液混合進(jìn)行反應(yīng),并測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間的熒光值。結(jié)果顯示,α-淀粉酶能有效降解DQ淀粉并產(chǎn)生熒光,且反應(yīng)靈敏度高,微量酶活力 (>0.001 U/mL) 條件下,30 min即能產(chǎn)生明顯熒光差異 (圖1)。在一定酶活力范圍內(nèi)(<0.008 U/mL),熒光強(qiáng)度與酶活呈線性關(guān)系 (R2>0.97),同時(shí)也與反應(yīng)時(shí)間呈正相關(guān) (R2>0.96),能完全滿足檢測(cè)液滴內(nèi)單細(xì)胞產(chǎn)生的α-淀粉酶活性的要求。

圖1 基于DQ淀粉底物的熒光檢測(cè)方法的優(yōu)化Fig.1 Optimization of fluorescence test based on DQ starch substrate

2.2 高活性單細(xì)胞制備

地衣芽孢桿菌在指數(shù)生長(zhǎng)期以菌絲狀態(tài)存在 (圖2-a),無法直接用于單細(xì)胞液滴包埋和篩選。雖然培養(yǎng)至穩(wěn)定期菌絲會(huì)斷裂成單細(xì)胞,但是實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定期的地衣芽孢桿菌單細(xì)胞無法在液滴中產(chǎn)酶,甚至無法生長(zhǎng),推測(cè)是由于穩(wěn)定期的菌體活性較低導(dǎo)致,無法適用于進(jìn)一步的液滴包埋、培養(yǎng)和分選等環(huán)節(jié)。因此,為獲得能用于單細(xì)胞液滴包埋和篩選所需要的高活性地衣芽孢桿菌單細(xì)胞,本研究選取指數(shù)生長(zhǎng)期的菌絲進(jìn)行超聲處理 (950 W，2%,超聲5 s,停5 s) 獲得單細(xì)胞菌液[23],再經(jīng)5 μm濾膜過濾去除剩余菌絲及細(xì)胞團(tuán)等顆粒[24]。超聲處理2 min后,大部分菌絲斷裂成單細(xì)胞,雖然仍有部分菌絲,但經(jīng)過濾處理后,菌液中均為單細(xì)胞 (圖2-b)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)也證明超聲波處理后的單細(xì)胞具有較好活力,可以在液滴中有效產(chǎn)α-淀粉酶并用于后續(xù)的液滴篩選。

a-指數(shù)生長(zhǎng)期的地衣芽孢桿菌；b-超聲波處理并過濾后的地衣芽孢桿菌圖2 超聲波處理地衣芽孢桿菌菌絲制備高活性單細(xì)胞Fig.2 Ultrasonic treatment of cell chains for high performance single cells of B.licheniformis

2.3 單細(xì)胞液滴包埋條件優(yōu)化

液滴穩(wěn)定性是液滴微流控技術(shù)的關(guān)鍵影響因素[11],已有報(bào)道表明水相和油相性質(zhì)等對(duì)液滴的穩(wěn)定性影響較大[25]。為評(píng)價(jià)不同油相對(duì)產(chǎn)α-淀粉酶地衣芽孢桿菌微液滴包埋的影響并選出合適的油相,本研究分別選用2% Pico-Surf in FC40、2% Pico-Surf in Novec 7500和Bio-Rad液滴生成油進(jìn)行單細(xì)胞液滴包埋并評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性。其中2% Pico-Surf in FC40黏度較大,無法在芯片中生成液滴。2% Pico-Surf in Novec 7500和Bio-Rad液滴生成油均能生成直徑20 μm左右的均一液滴,將兩者放置在37 ℃下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)6 h后,分別取樣觀察液滴,發(fā)現(xiàn)2% Pico-Surf in Novec 7500生成的液滴較穩(wěn)定 (圖3-a),所有液滴直徑均保持在20 μm左右；而Bio-Rad液滴生成油生成的液滴出現(xiàn)部分較大的液滴 (圖3-b),約10%的液滴直徑達(dá)到了30～40 μm,說明部分液滴發(fā)生了破碎和融合,因此本研究選用2% Pico-Surf in Novec 7500進(jìn)行單細(xì)胞液滴包埋。

a-2% Pico-Surf in Novec 7500生成的單細(xì)胞液滴； b-Bio-Rad液滴生成油生成的單細(xì)胞液滴圖3 不同油相對(duì)單細(xì)胞液滴穩(wěn)定性的影響Fig.3 The stability of single cell droplets in different oil phase

2.4 突變體庫的液滴微流控篩選

將突變體庫單細(xì)胞液滴放置在37 ℃下靜置避光培養(yǎng),定時(shí)取樣觀察熒光,以確定合適的液滴分選時(shí)間。結(jié)果表明：液滴培養(yǎng)2 h,液滴中出現(xiàn)較弱的熒光；繼續(xù)培養(yǎng)至3 h,液滴熒光增強(qiáng),達(dá)到液滴微流控篩選的分選范圍。此時(shí),部分液滴熒光較強(qiáng),另一部分液滴熒光較弱,說明液滴中的單細(xì)胞產(chǎn)出的α-淀粉酶活性有差異 (圖4)。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)單細(xì)胞液滴熒光的影響Fig.4 Effect of culture time for fluorescence intensity in single cell droplets

由于不同批次液滴的熒光強(qiáng)度分布具有差異,液滴分選時(shí)需要根據(jù)實(shí)際熒光信號(hào)分布進(jìn)行篩選閾值的優(yōu)化,對(duì)高于篩選閾值的液滴進(jìn)行適當(dāng)加電篩選 (圖5),備選電壓有300和500 V。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,使用500 V進(jìn)行篩選時(shí),液滴內(nèi)的細(xì)胞存活率降低,大部分情況平板上無菌落長(zhǎng)出；篩選電壓降到300 V時(shí),細(xì)胞存活率提高至15%左右,菌落數(shù)足夠用于后續(xù)的搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證。根據(jù)以上單細(xì)胞液滴培養(yǎng)時(shí)間和篩選參數(shù)的優(yōu)化,將單細(xì)胞液滴在37 ℃下靜置避光培養(yǎng)3 h后進(jìn)行液滴篩選,篩選時(shí)將電壓設(shè)置為300 V,同時(shí)設(shè)置合適的閾值以篩選出熒光強(qiáng)度最高的3‰左右的液滴,將篩選出的液滴涂布到LB平板上。

圖5 液滴篩選閾值設(shè)置Fig.5 Threshold setup for droplet sorting

2.5 菌株的搖瓶發(fā)酵評(píng)價(jià)

待平板上長(zhǎng)出菌落,隨機(jī)挑取81個(gè)單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵初篩。從結(jié)果可以看出,與出發(fā)菌株BLH相比,除個(gè)別菌株酶活力降低外,其他菌株酶活力均有不同程度的提高,其中最高酶活力為969 U/mL,提高了63% (圖6-a)。通過對(duì)發(fā)酵酶活力降低的菌株分析發(fā)現(xiàn),發(fā)酵酶活力的降低主要由單位細(xì)胞產(chǎn)酶能力降低或者菌體生長(zhǎng)能力不足造成。因此,生產(chǎn)菌株需要在菌體生長(zhǎng)和單位細(xì)胞產(chǎn)酶能力之間達(dá)到一個(gè)最佳的平衡點(diǎn)才能使得總產(chǎn)酶量最大化。

a-搖瓶初步評(píng)價(jià)酶活分布；b-高產(chǎn)菌株搖瓶驗(yàn)證圖6 篩選菌株酶活評(píng)價(jià)及高產(chǎn)菌株搖瓶驗(yàn)證Fig.6 α-amylase activity distribution and reassessment of several best strains

選擇初篩發(fā)酵酶活力最高的5株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩驗(yàn)證。結(jié)果顯示,這5株菌的發(fā)酵酶活力分別為：817、832、847、802和900 U/mL,較出發(fā)菌株BLH (541 U/mL) 分別提高了51%、54%、57%、48%和66%,單位細(xì)胞酶活力較BLH分別提高了23%、25%、42%、76%和43% (圖6-b)?？梢钥闯霭l(fā)酵酶活力提升的比例與單位細(xì)胞酶活力提升的比例并不完全一致,發(fā)酵酶活力最高的菌株的菌體濃度和單位細(xì)胞酶活力均處于中間偏高的位置,這也進(jìn)一步說明菌體生長(zhǎng)和單位細(xì)胞產(chǎn)酶能力需要一定的平衡才能達(dá)到最優(yōu)的產(chǎn)酶效率。

3 結(jié)論

地衣芽孢桿菌作為產(chǎn)α-淀粉酶的重要工業(yè)微生物,廣泛應(yīng)用于食品、紡織等行業(yè)。針對(duì)地衣芽孢桿菌的微生物育種研究也越來越多,但缺乏適用于地衣芽孢桿菌的高通量篩選方法成為目前主要的障礙。本研究以產(chǎn)α-淀粉酶地衣芽孢桿菌為例,通過超聲處理將指數(shù)生長(zhǎng)期的地衣芽孢桿菌菌絲制備成高活性的單細(xì)胞,并選用2% Pico-Surf in Novec 7500作為油相包埋獲得穩(wěn)定的單細(xì)胞液滴,最后優(yōu)化了培養(yǎng)時(shí)間和篩選電壓分別為3 h和300 V,構(gòu)建基于液滴微流控的高通量篩選方法,并成功從地衣芽孢桿菌BLH的突變體庫中篩選出了5株α-淀粉酶產(chǎn)量有效提高的突變體,發(fā)酵酶活力最高提高66%。

為進(jìn)一步解析菌株高產(chǎn)α-淀粉酶的機(jī)制,我們將從高產(chǎn)菌株的基因組中挖掘分析突變位點(diǎn),從中找出提高酶的表達(dá)和分泌量的關(guān)鍵突變位點(diǎn),為提高地衣芽孢桿菌中的分泌表達(dá)效率提供指導(dǎo)。此外,在實(shí)驗(yàn)過程中,我們發(fā)現(xiàn)液滴微流控篩選時(shí)的電壓對(duì)菌體的存活率影響較大。針對(duì)這一點(diǎn),可以繼續(xù)優(yōu)化水相和油相的成分,并對(duì)篩選芯片通道進(jìn)行改進(jìn),達(dá)到在更低電壓下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)液滴偏轉(zhuǎn)的效果,提高篩選菌株存活率。隨著人工智能等領(lǐng)域的快速發(fā)展,液滴微流控設(shè)備不斷成熟,硬件條件基本能滿足大部分微生物的包埋、培養(yǎng)等。因此,如何針對(duì)不同目標(biāo)底物或產(chǎn)物開發(fā)特異性篩選方法將成為構(gòu)建液滴微流控等高通量篩選方法的關(guān)鍵,也將進(jìn)一步擴(kuò)大其在工業(yè)生物技術(shù)中的應(yīng)用[26]。