祖航天,田小鵬,胡杰,張皓,丁延帥,呂明生*,王淑軍*

1(海洋資源與環(huán)境重點實驗室/海洋生物技術(shù)重點實驗室(江蘇海洋大學(xué)),江蘇 連云港,222005) 2(江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 連云港,222000)

右旋糖酐 (dextran) 是一種在自然界中由微生物產(chǎn)生的具有特異性結(jié)構(gòu)的聚D-葡萄糖,主要以α-1,6糖苷鍵相連[1]。右旋糖酐酶 (dextranase,EC3.2.1.11) 可以特異性水解右旋糖酐中的α-1,6糖苷鍵[2],在食品、醫(yī)藥和生物技術(shù)領(lǐng)域有重要應(yīng)用。在食品行業(yè)中,右旋糖酐酶能夠降解多糖聚合物,達到降低糖黏性的目的[3]；用右旋糖酐酶水解高分子右旋糖酐,可制備不同分子質(zhì)量的右旋糖酐和功能性低聚糖——益生元[4-5]；在醫(yī)藥行業(yè)中,右旋糖酐酶通過降解牙菌斑細菌生物膜結(jié)構(gòu)中的右旋糖酐[6],可用于預(yù)防和治療牙周炎和齲齒等口腔疾病。另外,右旋糖酐酶可用于制備血漿代用品,增強藥物的抗菌療效[7]。目前部分右旋糖酐酶產(chǎn)生菌來源為霉菌,霉菌大都存在產(chǎn)酶周期長和制備工藝復(fù)雜等問題,絕大部分霉菌發(fā)酵液中,次級代謝產(chǎn)物復(fù)雜并可能存在一定的安全隱患[8]。由于海洋的獨特環(huán)境,海洋細菌產(chǎn)生酶制劑具有周期短、最適反應(yīng)溫度低等特點[9-10],從海洋中篩選新穎產(chǎn)酶微生物以及具有特殊酶學(xué)性質(zhì)的酶具有重要意義。隨著對右旋糖酐酶應(yīng)用的拓展,對高效、安全的右旋糖酐酶制劑及其水解產(chǎn)物的需求增大,此項研究具有較好的經(jīng)濟和社會效益[11-12]。

本研究從日照海域海泥中篩選到1株產(chǎn)右旋糖酐酶的海洋細菌,研究了該菌株的形態(tài)學(xué)和生理生化特征,進行了分子鑒定,并對該菌的產(chǎn)酶特性、酶學(xué)性質(zhì)以及酶解得到的產(chǎn)物進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品為山東省日照市海域的海泥；麩皮,本市；藍色葡聚糖2000,GE Healthcare；右旋糖酐T20,國藥集團化學(xué)試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型),天根生化科技(北京)有限公司；細菌微量生化鑒定管,北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑,國藥集團,分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)右旋糖酐酶菌株的篩選與鑒定

1.2.1.1 培養(yǎng)基的制備

初篩培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5,酵母粉1,藍色葡聚糖2000 2,瓊脂20,陳海水配制,pH 8.0；產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5,麩皮5,右旋糖酐T20 10,陳海水,pH 8.0；種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5,酵母粉5,陳海水配制,pH 7.0。

1.2.1.2 菌株初篩和復(fù)篩

將采集的樣品梯度稀釋,涂布初篩培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)48 h。挑取初篩培養(yǎng)基上具有透明圈的菌株進行分離、純化和保藏。將初篩獲得的菌株接種產(chǎn)酶培養(yǎng)基于30 ℃,180 r/min培養(yǎng)48 h,發(fā)酵液離心后取上清液檢測酶活性,選取右旋糖酐酶活性較高的菌株進一步研究。

1.2.1.3 菌株形態(tài)學(xué)觀察與生理生化檢測

取培養(yǎng)12 h的種子液,接種于藍色葡聚糖平板,30 ℃培養(yǎng)24 h,觀察菌落形態(tài)；進行菌株形態(tài)學(xué)觀察；依照使用說明書檢測菌株生理生化特征。

1.2.1.4 菌株的鑒定

提取菌株的基因組(TIANamp Bacteria DNA Kit),擴增選用原核微生物16S rRNA序列的通用引物27F與1492R。PCR產(chǎn)物寄往生工生物工程(上海)股份有限公司測序,將菌株RN22的16S rRNA基因序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫同源性比對,運用MEGA軟件(Neibor-joing method)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.2 酶活力測定[13]

將50 μL酶液與150 μL 30 g/L右旋糖酐T20 混合,60 ℃水浴15 min,在反應(yīng)體系中加入200 μL DNS溶液終止反應(yīng),沸水浴5 min,加入3 mL超純水后振蕩混勻,取200 μL于96孔板檢測540 nm處的吸光值。對照組先加入DNS溶液終止反應(yīng)再加入底物,其他操作同實驗組。

酶活力單位定義(U):60 ℃,pH 7.5條件下,以30 g/L右旋糖酐T20為底物,每1 min釋放1 μmol麥芽糖所需的酶量為1個酶活力單位。

1.2.3 粗酶液的制備

菌株接種量按產(chǎn)酶培養(yǎng)基體積3%接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,180 r/min,30 ℃下發(fā)酵培養(yǎng)48 h后取出,在4 ℃、10 000 r/min離心2 min,上清液即為粗酶液。

1.2.4 菌株產(chǎn)右旋糖酐酶條件優(yōu)化

對影響菌株產(chǎn)右旋糖酐酶的碳源、氮源、發(fā)酵溫度、pH、發(fā)酵時間和誘導(dǎo)劑濃度進行單因素試驗。用5 g/L碳源替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母粉(麩皮、可溶性淀粉、豌豆粉、蔗糖、糊精、葡萄糖、馬鈴薯、木薯、乳糖、麥芽糖)；用5 g/L氮源替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨(豆粕、魚粉蛋白胨、花生粕、尿素、干酪素、氯化銨、硝酸鈉、硫酸銨)。15～45 ℃下培養(yǎng)48 h后,測定酶活力。調(diào)節(jié)初始pH范圍為5～10,30 ℃培養(yǎng)48 h后分別檢測酶活力。發(fā)酵24 h后,每隔6 h取樣測酶活力；發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同濃度的右旋糖酐T20作為產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑,裝液量20%,轉(zhuǎn)數(shù)180 r/min,30 ℃培養(yǎng)48 h后分別測酶的活力。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.5.1 右旋糖酐酶最適作用溫度及熱穩(wěn)定性

在不同溫度下(30～70 ℃)測定右旋糖酐酶的酶活力。將酶液分別保溫于不同溫度下1～5 h后,測定殘余酶活力。

1.2.5.2 酶的最適作用pH及pH穩(wěn)定性

設(shè)置不同pH的緩沖體系：50 mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH 4.0～6.0)、50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.0～7.5)和50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5～9.0),分別測定不同pH下的酶活力以確定其最適作用pH,將酶液與緩沖液混合,30 ℃水浴1 h后,測定殘余酶活力。

1.2.5.3 金屬離子對酶活力的影響

將底物與不同濃度的金屬離子混合(氯化物及硫酸鹽),使金屬離子的終濃度分別為1、5和10 mmol/L,測定酶活力,以未加金屬離子的酶液對為照計算相對酶活力。

1.2.5.4 酶的底物特異性

將不同分子質(zhì)量的右旋糖酐以及可溶性淀粉、殼聚糖、普魯蘭等作為底物,加酶后60 ℃反應(yīng)15 min,測量相對酶活力。

1.2.5.5 有機溶劑對酶活力的影響

在底物中加入有機溶劑(乙醇、乙二醇、異丙醇、正己烷、甲醇、環(huán)己烷、吐溫-80、乙醚、正丙醇、吐溫-20、乙酸乙酯、乙腈、石油醚、β-疏基乙醇、甘油、甲基叔丁基醚),底物和有機溶劑體積比為 9∶1,右旋糖酐T20終質(zhì)量濃度為30 g/L,測定酶活力,以未加有機溶劑的底物對為照,計算相對酶活力。

1.2.5.6 右旋糖酐酶分子質(zhì)量分析

通過SDS-PAGE電泳分析粗酶液中右旋糖酐酶的分子質(zhì)量,采用濃縮膠濃度為5%,分離膠濃度為8%,分離膠中含5 g/L藍色葡聚糖。電泳結(jié)束后,蛋白膠用考馬斯亮藍染色,復(fù)性膠浸入含有體積分數(shù)2.5% Triton X-100的20 mmol/L、pH 7.5的Tris-HCl緩沖液中,室溫下30 min,然后,在不含Triton X-100的20 mmol/L、pH 7.5的Tris-HCl緩沖液中,37 ℃條件下,溫浴至透明的條帶出現(xiàn)。

1.2.5.7 水解產(chǎn)物高效液相色譜分析

采用高效液相色譜分析,色譜柱為waters sugar-pak1(6.5 mm×300 mm),流動相為去離子水,流速0.4 mL/min,柱溫75 ℃。樣品前處理：標(biāo)準品糖分別稱取5 mg溶于1 mL去離子水中,超聲波處理30 min。配制30 g/L右旋糖酐T20底物,酶液與底物按照體積比1∶3混合,在30 ℃條件下分別反應(yīng)0.5、1、2和3 h,煮沸5 min用微孔濾膜過濾后使用。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗均設(shè)置3個平行樣,試驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準偏差表示,采用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

2.1.1 菌株篩選

產(chǎn)右旋糖酐酶菌株可以水解藍色葡聚糖形成透明圈,發(fā)酵后選擇1株產(chǎn)右旋糖酐酶活性高的菌株,命名為RN22。該菌為革蘭氏陰性桿菌,無鞭毛(圖1-a),菌落邊緣整齊光滑、菌落呈白色濕潤(圖1-b)。甲基紅實驗呈陰性,氧化酶反應(yīng)、鳥氨酸、賴氨酸實驗呈陽性,對糖的利用率較低,多數(shù)糖實驗呈陰性。

a-掃描電鏡形態(tài)(10.00 K)； b-菌株RN22在含有藍色葡聚糖平板上形成的透明區(qū)圖1 RN22菌株形態(tài)特征Fig.1 Features of strain RN22

2.1.2 菌株鑒定

16S rRNA基因序列高度保守并廣泛應(yīng)用于細菌分類[14],在GenBank 數(shù)據(jù)庫中Blast的結(jié)果與Pseudarthrobacter的同源性為99%,構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹見圖2。從進化樹可以看出菌株RN22 與Pseudarthrobacterdefluvii親緣關(guān)系最近,結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化指標(biāo),初步鑒定菌株RN22 屬于假節(jié)桿屬。

圖2 菌株RN22的16S rRNA系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

2.2 菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.2.1 碳、氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

碳、氮源是細菌產(chǎn)酶所需的主要營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源。如圖3所示,不同碳源、氮源對菌株產(chǎn)酶活性存在著顯著性的差異。菌株RN22在麩皮為碳源時產(chǎn)右旋糖酐酶最多(圖3-a),其次是馬鈴薯淀粉和可溶性淀粉,相對酶活力均達到60%以上。

a-碳源；b-氮源；c-碳源質(zhì)量濃度；d-氮源質(zhì)量濃度圖3 碳氮源對菌株RN22發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶的影響Fig.3 Effect of carbon and nitrogen sources on dextranase production by strain RN22

可溶性淀粉和馬鈴薯淀粉屬于工業(yè)中精細加工的產(chǎn)品,麩皮廉價易得同時酶活力最高,非常適合作為最優(yōu)碳源,而使用葡萄糖,麥芽糖,蔗糖為碳源時,檢測不出酶活,與GARCIA 等[15]的實驗結(jié)論相吻合。

氮源中胰蛋白胨可以很好地促進菌株RN22產(chǎn)右旋糖酐酶,而牛肉膏、硝酸銨和酵母粉為氮源時相對酶活力均未超過50%(見圖3-b),由此,選擇胰蛋白胨作為最優(yōu)氮源。當(dāng)麩皮作為最優(yōu)碳源添加量為5 g/L時菌株產(chǎn)酶活力最高(見圖3-c),5 g/L蛋白為菌株產(chǎn)酶的最佳質(zhì)量濃度(見圖3-d)。

2.2.2 發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響

由圖4-a可知,30 ℃時最有利于菌株RN22產(chǎn)右旋糖酐酶,當(dāng)溫度高于35 ℃,低于25 ℃時菌株產(chǎn)酶能力下降；20 ℃以下和40 ℃以上時,菌株不產(chǎn)酶。發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH 值是影響微生物的生長繁殖和產(chǎn)物生成的關(guān)鍵因素,當(dāng)發(fā)酵液pH 8時菌株產(chǎn)酶最高(圖4-b),菌株最佳產(chǎn)酶pH 8接近海洋弱堿性環(huán)境。

a-溫度；b-初始pH；c-右旋糖酐質(zhì)量濃度；d-發(fā)酵時間圖4 不同發(fā)酵條件對菌株RN22發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶的影響Fig.4 Effect of different fermentation conditions on the production of dextranase by strain RN22

2.2.3 誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度對菌株產(chǎn)酶的影響以及最佳產(chǎn)酶時間的確定

由圖4-c可見,當(dāng)右旋糖酐T20的質(zhì)量濃度為10 g/L時,最利于菌株產(chǎn)酶；不加誘導(dǎo)劑時,菌株產(chǎn)酶量為0,當(dāng)右旋糖酐質(zhì)量濃度超過10 g/L時酶活力下降,因此將右旋糖酐T20的終質(zhì)量濃度確定 10 g/L,右旋糖酐在低質(zhì)量濃度促進菌株產(chǎn)酶,在高質(zhì)量濃度會出現(xiàn)抑制,與LAI等[16]研究結(jié)果一致。如圖4-d所示,當(dāng)菌株發(fā)酵時間為48 h時,產(chǎn)酶達到最高,48～60 h內(nèi)酶活力保持穩(wěn)定,隨后酶活力下降。與已報道的霉菌相比,菌株RN22的產(chǎn)酶達到最高酶活力時間短。擬青霉屬(Paecilomyces)[17]需要8 d酶活力才能達到最高值,黃綠青霉(Penicilliumcitreoviride)[18]則需要13 d,細菌發(fā)酵產(chǎn)酶可以節(jié)約時間成本。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

在60 ℃時酶活力達到最高峰(圖5-a),隨后酶活力開始下降,酶在45～60 ℃之間的酶活力均在60%以上。細菌來源的右旋糖酐酶最適溫度多在40～60 ℃[8,12]。圖5-b顯示酶在40 ℃保溫5 h后剩余酶活力80%以上,根據(jù)文獻報道,大多海洋細菌產(chǎn)的酶在高于50 ℃會喪失大部分的酶活力[19-20],在50 ℃保溫2 h剩余酶活力80%以上,表明該菌株所產(chǎn)右旋糖酐酶熱穩(wěn)定較好。

2.3.2 最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

圖5-c顯示該酶催化反應(yīng)的pH值范圍,在pH值5.0條件下相對酶活力檢測不出,pH值>5.0后酶活力迅速升高,在pH 6.0～8.0范圍內(nèi)有70%以上的酶活力,其最適反應(yīng)pH值為7.5(Tris-HCl),海洋細菌產(chǎn)生的酶具備一定的耐堿性[21]。目前所報道的右旋糖酐酶最適pH多在4.0～6.0[22-24]。該酶在pH 5.0～9.0下保存1 h后的剩余酶活力見圖5-d,酶在pH 5穩(wěn)定性差,保存后檢測不到酶活力。但是酶在pH 5.5～9.0的條件下保存1 h后剩余活力均在60%以上,該酶在此pH值中性偏堿性范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好。

a-溫度對右旋糖酐酶活影響；b-溫度穩(wěn)定性；c-pH對右旋糖酐酶活力的影響；d-pH穩(wěn)定性圖5 溫度、pH對酶活力以及穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of temperature and pH on dextranase activity and stability

2.3.3 金屬離子對酶活力的影響

在終濃度為1、5和10 mmol/L時,不同濃度的金屬離子對右旋糖酐酶活性的影響如表2所示。Mg2+、Na+、Ba2、Si2+、K+可以提高酶的活性,Cd2+、Ni2+抑制酶活性,低濃度的Co2+對酶活力有促進作用,但濃度5、10 mmol/L時對酶活性有抑制。加入Cu2+、Zn2+、Fe3+可以使酶活性完全喪失,在HUANG等[25]和ZHANG等[26]的研究中,Cu2+、Zn2+、Fe3+對酶活力具有不同程度的抑制效果,其他金屬離子在以上濃度對酶活力影響較小。

表1 金屬離子右旋糖酐酶的影響Table 1 Effect of metal ion on dextranase

2.3.4 底物特異性及催化產(chǎn)物

如表2所示,該菌株所產(chǎn)右旋糖酐酶能特異水解由α-1,6糖苷鍵組成的不同分子質(zhì)量的右旋糖酐,對由α-1,4和α-1,6糖苷鍵組成的可溶性淀粉仍有8.5%的催化活性,對只含有α-1,4糖苷鍵和β-1,4糖苷鍵組成的殼聚糖和普魯蘭均沒有催化活力,從而可以得出結(jié)論,該酶只能夠特異性水解含α-1,6糖苷鍵。

表2 酶的底物特異性研究Table 2 Substrate specificity of dextranase

2.3.5 有機溶劑對酶活力的影響

所用的有機溶劑對酶的活性均有不同程度的抑制作用(表3),其中甲基叔丁基醚、乙酸乙酯對酶活力抑制效果較弱,而正丙醇、吐溫-20、乙醇對酶活力抑制效果最強,β-疏基乙醇加入后即有沉淀產(chǎn)生。

表3有機溶液對酶活力的影響Table 3 Effect of organic solution on dextranase activity

酶的表面電勢、活性位點、結(jié)構(gòu)受到有機溶劑的影響,對酶活力具有抑制作用[27]。

2.3.6 右旋糖酐酶蛋白SDS-PAGE電泳

右旋糖酐酶蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖6所示。經(jīng)復(fù)性后出現(xiàn)1條透明帶,是復(fù)性后右旋糖酐酶水解分離膠中的藍色葡聚糖形成。對應(yīng)位置條帶在經(jīng)考馬斯亮藍染色的凝膠蛋白maker 70 kDa處,說明該右旋糖酐酶的分子質(zhì)量在70 kDa左右。

M-蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準；1-復(fù)性右旋糖酐酶條帶；2-考馬斯亮藍染色圖6 右旋糖酐酶粗酶SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of crude dextranase

2.3.7 水解產(chǎn)物分析

麥芽七糖、麥芽六糖、麥芽五糖、麥芽四糖、麥芽三糖、麥芽二糖、葡萄糖等標(biāo)準糖依次出峰,如圖7-a所示。

a-糖標(biāo)品；b-不同反應(yīng)時間圖7 酶液水解右旋糖酐T20的水解產(chǎn)物高效液相色譜圖Fig.7 High performance liquid chromatogram of hydrolysate of dextran T20 by dextranase

對照標(biāo)準糖出峰時間可以看出右旋糖酐酶解產(chǎn)物主要產(chǎn)物為麥芽七糖,及少量的葡萄糖,麥芽二糖,麥芽四糖,麥芽五糖。結(jié)果表明,菌株RN22所產(chǎn)右旋糖酐酶為內(nèi)切酶[28]。圖7-b和表4顯示,隨著水解時間的增長,麥芽七糖峰面積逐漸增大,底物逐漸減少。葡萄糖和麥芽二糖在水解產(chǎn)物中所占的比例幾乎不變,比例一直穩(wěn)定在5%左右,麥芽四糖和麥芽五糖含量分別從3.08%和4.47%增加到12.27%和12.75%,麥芽七糖含量從85.67%減少到68.33%。該酶水解右旋糖酐后,得到單一寡糖(七糖)含量較高,對該酶的應(yīng)用,以及酶結(jié)構(gòu)的深入研究都具有重要意義。

表4 右旋糖酐酶水解右旋糖酐T20產(chǎn)物含量Table 4 Content of dextran T20 hydrolyzed by dextranase

3 結(jié)論

篩選得到產(chǎn)右旋糖酐酶的菌株P(guān)seudarthrobactersp.RN22,該菌株產(chǎn)酶條件為：碳氮源為麩皮和胰蛋白胨,均為5 g/L,右旋糖酐T20 10 g/L,陳海水,pH 8.0,溫度30 ℃,最佳產(chǎn)酶時間48 h。該菌株產(chǎn)生的右旋糖酐酶的最適溫度為60 ℃,最適pH7.5,該酶在30～70 ℃可保持較高酶活性,熱穩(wěn)定性較好,在pH 5.5～8.0穩(wěn)定。分子質(zhì)量約為70 kDa,Mg2+、Na+、K+等金屬離子可以提高酶的活性,有機溶劑對酶活力具有不同程度的抑制效果,該酶是專一性水解α-1,6糖苷鍵的內(nèi)切酶,水解產(chǎn)物主要為寡糖,值得關(guān)注的是麥芽七糖的含量達到80%以上,該酶在寡糖的生產(chǎn)上具有較好的應(yīng)用前景。