蔣藝華，王 倩，蔡金玉，呂雪陽，王 琦，周 曉，李菁菁，2

（1.徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，江蘇 徐州 222004；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，江蘇 徐州 222004）

巨噬細(xì)胞泡沫化（macrophage foam）是動脈粥樣硬化的重要因素，脂質(zhì)的過量存積則是泡沫化的主要原因，減少細(xì)胞內(nèi)己經(jīng)存積的脂質(zhì)對抑制泡沫化有重要作用[1-3]。去乙酰化酶1（SIRT1）通過減少泡沫細(xì)胞的形成阻止動脈粥樣硬化[4-6]，使肝X 受體（LXR）去乙酰化后可以上調(diào)后者的活性，促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)將膽固醇從細(xì)胞內(nèi)排出，通過抑制早衰防止內(nèi)皮功能紊亂。已證實(shí)SIRT1 在巨噬細(xì)胞中可以降低動脈粥樣硬化的發(fā)生。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)SIRT1 通過抑制NF-kB 信號通路[7]降低凝集素樣ox-LDL 受體-1（Lox-1）的表達(dá)，從而降低氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的攝取[8，9]。SIRT1 在穩(wěn)定斑塊、降低膽固醇攝取、抑制巨噬細(xì)胞泡沫化以及減輕炎癥反應(yīng)等方面的積極作用，使其成為防治動脈粥樣硬化的新靶標(biāo)。SRT1720 是人工合成的SIRT1 特異性激活劑，SRT1720 通過與氨基末端催化區(qū)的變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合，連接到SIRT1 酶-肽底物復(fù)合物上，降低乙?；孜锏拿资铣?shù)值，從而激活SIRT1[10-13]。已有研究表明[14]，SRT1720 可以抑制巨噬細(xì)胞泡沫化，但是對于SRT1720 的干預(yù)時間對巨噬細(xì)胞的泡沫化的抑制效果的影響報道罕見，本研究分別在巨噬細(xì)胞經(jīng)ox-LDL 干預(yù)不同時間后加入SRT1720，觀察SRT1720 的干預(yù)時間對治療效果的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物及材料 小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海），氧化低密度脂蛋白o(hù)x-LDL 購于上海源葉生物科技有限公司（上海），SIRT1 激活劑SRT1720 購于大連美倫生物科技有限公司（大連），油紅O 購于上海索橋生物科技有限公司（上海），總膽固醇測試盒購于南京建成生物工程研究所（南京）。

1.2 方法 將巨噬細(xì)胞RAW264.7 種植于3 個24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個培養(yǎng)板分3 組培養(yǎng)細(xì)胞，Control組只加培養(yǎng)基，ox-LDL 組加60 μg/ml ox-LDL，ox-LDL+SRT1720 組先加60 μg/ml ox-LDL，分別培養(yǎng)不同時間（0、12、24 h）后再加入10 μmol/L SRT1720干預(yù)，采用油紅O 染色和膽固醇測定，比較巨噬細(xì)胞泡沫化抑制情況。

1.2.1 油紅O 染色 細(xì)胞培養(yǎng)終止后，去掉原細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 漂洗3 次，5 min/次；用4%多聚甲醛室溫下固定15 min，固定結(jié)束后PBS 漂洗5 min×2 次；取油紅O 儲備液6 ml，加入蒸餾水4 ml 配成油紅O工作液，混合后靜置10 min，濾紙避光過濾后配成油紅O 工作液，每孔加入油紅O 工作液200 μl，避光染色40 min；蒸餾水洗10 s×2 次，光鏡下觀察并拍照。

1.2.2 膽固醇含量測定 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束，光鏡下帶200 μm 標(biāo)尺拍照，隨機(jī)取10 個細(xì)胞，通過細(xì)胞與標(biāo)尺的比例關(guān)系計算平均細(xì)胞直徑，細(xì)胞密度取水的密度，由球體體積計算公式和細(xì)胞質(zhì)量計算公式算出細(xì)胞質(zhì)量；對細(xì)胞進(jìn)行消化分離，制備細(xì)胞懸液并取出，1000 r/min，離心10 min，棄上清液，留細(xì)胞沉淀；用PBS 清洗2 次，取少量細(xì)胞懸液計數(shù)，計算每孔的細(xì)胞數(shù)量，計算細(xì)胞質(zhì)量；清洗后以1000 r/min 離心速度離心10 min；棄上清液，留細(xì)胞沉淀；加入0.2 ml 無水乙醇進(jìn)行勻漿，冰水浴條件下超聲破碎（功率300 W，3 s/次，間隔9 s，重復(fù)5 次），制備好的勻漿直接測定；準(zhǔn)備96 孔板，以樣本工作液為1∶100 比例混勻，每個樣本3 個平行組加入96 孔板中；37 ℃孵育10 min，設(shè)置分光光度計波長510 nm，測定各管吸光度值；膽固醇含量（mmol/g 組織）=（樣本OD 值-空白OD 值）/（校準(zhǔn)OD 值-空白OD 值）×校準(zhǔn)品濃度（mmol/L）/待測樣本質(zhì)量濃度（g/L）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 油紅O 染色拍照結(jié)束后，采用Image J 分析軟件計算出染紅區(qū)域面積和細(xì)胞總面積的比值，對油紅O 染色的巨噬細(xì)胞進(jìn)行定量分析；采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，用沃勒-鄧肯（W）法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下觀察油紅O 染色處理組巨噬細(xì)胞泡沫化情況 o-xLDL 組及ox-LDL+SRT1720 組0、12、24 h細(xì)胞泡沫化程度均高于Control 組，其中0 h 加入SRT1720 對巨噬細(xì)胞泡沫化的抑制效果最佳，見圖1～圖3。

圖1 ox-LDL 與SRT1720 同時干預(yù)后巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)沉積

圖2 ox-LDL 處理12 h 后加入SRT1720 干預(yù)后巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)沉積

圖3 ox-LDL 處理24 h 后加入SRT1720 干預(yù)后巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)沉積

2.2 油紅O 染色

2.2.1 ox-LDL 處理不同時間加入SRT1720 的巨噬細(xì)胞油紅染色比 SRT1720 直接干預(yù)可以顯著抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化，隨著泡沫化程度的增加，藥物的抑制效果呈遞減趨勢，見圖4。

圖4 ox-LDL 處理不同時間加入SRT1720 的巨噬細(xì)胞油紅染色比

2.2.2 各組細(xì)胞中油紅染色脂質(zhì)沉積比較 與Control組比較，ox-LDL 組0、12、24 h 油紅染色比均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與ox-LDL 組比較，ox-LDL+SRT1720 組0、12 h 油紅染色比降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），24 h 組油紅染色比略降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；巨噬細(xì)胞泡沫化后，SRT1720 越早期給藥其抑制效果越佳，見表1。

表1 各組細(xì)胞中油紅染色脂質(zhì)沉積比較（，%）

表1 各組細(xì)胞中油紅染色脂質(zhì)沉積比較（，%）

注：與Control 組比較，**P＜0.05；與ox-LDL 組比較，*P＜0.05

2.3 膽固醇測定 與Control 組比較，ox-LDL 組0、12、24 膽固醇含量均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與ox-LDL 組比較，ox-LDL+SRT1720 組0 h膽固醇含量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），12、24 h 膽固醇含量均略減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在巨噬細(xì)胞剛開始泡沫化時SRT1720 給藥有抑制效果，見表2。

表2 各組細(xì)胞中膽固醇含量比較（，mmol/g）

表2 各組細(xì)胞中膽固醇含量比較（，mmol/g）

注：與Control 組比較，**P＜0.05；與ox-LDL 組比較，*P＜0.05

3 討論

動脈粥樣硬化是慢性炎癥性、嚴(yán)重危害人類健康的疾病，而脂質(zhì)氧化在動脈粥樣硬化的形成與發(fā)展過程中起著重要作用。有研究表明[2]，巨噬細(xì)胞參與了動脈粥樣硬化的全過程，是泡沫細(xì)胞形成過程中的關(guān)鍵因素；另有研究報道[14]，在兔主動脈晚期動脈粥樣硬化病灶中大約45%的細(xì)胞，在人冠狀動脈粥樣硬化病灶中超過50%的細(xì)胞屬于VSMC 來源，且多于巨噬細(xì)胞。血液中的單核細(xì)胞會在血管內(nèi)皮受損的情況下通過內(nèi)皮間隙，然后在內(nèi)膜下轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞可以介導(dǎo)滲入血管內(nèi)皮下的低密度脂蛋白（LDL）發(fā)生氧化修飾，最終形成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）。巨噬細(xì)胞吞噬大量ox-LDL，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，最終形成泡沫細(xì)胞。因此，減少膽固醇的流入或增加其流出對減少動脈粥樣硬化的發(fā)生具有十分重要的意義。

已有研究表明，SIRT1 是去乙?；讣易澹⊿IRT1-7）的一員，在維持細(xì)胞能量、脂質(zhì)代謝及葡萄糖穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用[7]。近年來，SIRT1 在動脈粥樣硬化防治方面的保護(hù)作用逐漸受到研究者的關(guān)注。SRT1720 是人工合成的SIRT1 特異性激活劑，通過與氨基末端催化區(qū)的變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合，連接到SIRT1 酶-肽底物復(fù)合物上，降低乙?；孜锏拿资铣?shù)值，從而激活SIRT1。曹小潔等[7]的研究已證明SRT1720 可以抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞的形成，但是對其最佳的給藥時間尚無研究。為了提高藥物的利用率和降低藥物對人體的傷害，不同時期的動脈粥樣硬化治療應(yīng)該對應(yīng)不同的藥物。SRT1720 具有一定的毒性，因此通過設(shè)定準(zhǔn)確的服藥時間，不僅可以給獲得較好的治療效果，還能降低不必要用藥給人體帶來的危害。

本研究采用在同等操作環(huán)境下，巨噬細(xì)胞經(jīng)ox-LDL 處理不同時間SRT1720 給藥，比較巨噬細(xì)胞泡沫化的抑制情況。油紅O 染色和膽固醇測定結(jié)果顯示，ox-LDL 干預(yù)時間越久，其泡沫化程度越高，ox-LDL 與SRT1720 同時加入可以顯著抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化，由此推測動脈粥樣硬化在此時期給予SRT1720 治療，幾乎可以完全抑制巨噬細(xì)胞對氧化低密度脂蛋白的攝取。而隨著泡沫化程度的增加，相同量的SRT1720 抑制巨噬細(xì)胞泡沫化的效能有所降低。因此推測SRT1720 可以抑制巨噬細(xì)胞對氧化低密度脂蛋白的攝入，對已經(jīng)泡沫化的巨噬細(xì)胞發(fā)生逆向轉(zhuǎn)變的效果并不明顯。

研究顯示[15]，在動脈粥樣硬化早期發(fā)現(xiàn)疾病的患者較少，動脈粥樣硬化疾病早期病理變化和特征性標(biāo)志是斑塊內(nèi)泡沫巨噬細(xì)胞的浸潤，泡沫細(xì)胞的數(shù)量和分布是引起斑塊不穩(wěn)定性的重要發(fā)病基礎(chǔ)，與臨床急性心血管事件的發(fā)生呈顯著相關(guān)。有研究試圖通過影像學(xué)手段，實(shí)現(xiàn)對動脈粥樣硬化易損斑塊形態(tài)和成分性質(zhì)的早期可視化診斷[16]，經(jīng)過診療一體化納米粒子[17]的預(yù)治療，可以降低血管完全堵塞的風(fēng)險。尤其是對斑塊內(nèi)泡沫巨噬細(xì)胞進(jìn)行早期識別及動態(tài)定量監(jiān)測，對于預(yù)防急性心腦血管事件的發(fā)生具有重要意義，因此診療一體化納米探針的制備在預(yù)防動脈粥樣硬化斑塊形成的研究具有重要意義。

綜上所述，SRT1720 對于動脈粥樣硬化的早期治療效果最好。如果可將其制成納米探針，對斑塊內(nèi)泡沫巨噬細(xì)胞進(jìn)行早期靶向診斷治療。由于研究表明對于中晚期的動脈粥樣硬化巨噬細(xì)胞泡沫化抑制情況并不明顯，因此其治療方法及加藥量尚不明確。SRT1720 對巨噬細(xì)胞泡沫化的影響還有待進(jìn)一步研究，可能對于提高其臨床的治療效果具有重要意義。