李素芬，李 彬，普元倩，楊 娜，王唯斯，自加吉，余 敏，熊 偉

肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌，發(fā)病率和病死率均較高[1]。肝癌可以通過(guò)手術(shù)切除、肝移植、肝定向療法和全身療法進(jìn)行治療，但肝癌的3年生存率僅為12.7%，中位生存期為9個(gè)月[2]。線粒體轉(zhuǎn)錄延伸因子(mitochondrial transcription elongation factor, TEFM)基因又被命名為C17orf42，定位于人的17q11.2，含有4個(gè)外顯子，mRNA全長(zhǎng)為1 357 bp，編碼1個(gè)由360個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)[3]。Agaronyan等[4]首次報(bào)道，TEFM是調(diào)控線粒體基因組轉(zhuǎn)錄與復(fù)制相互轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵分子。研究證實(shí)，TEFM具有調(diào)控線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)轉(zhuǎn)錄延伸和抗轉(zhuǎn)錄終止的功能[5]，并且參與線粒體RNA的轉(zhuǎn)錄后加工[6]，與線粒體能量產(chǎn)生及線粒體疾病的發(fā)生密切相關(guān)[7]。隨著對(duì)TEFM的深入研究發(fā)現(xiàn)，TEFM基因缺失或表達(dá)異?？赡軐?dǎo)致胰腺癌[8]、I型神經(jīng)纖維瘤[9]和腦膠質(zhì)瘤[10]等惡性腫瘤的發(fā)生，但TEFM蛋白在HCC組織中的表達(dá)及與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用免疫組化法檢測(cè)70例HCC組織中TEFM蛋白的表達(dá)，分析其表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集70例HCC患者的組織標(biāo)本，將HCC確診病例組織(70例及復(fù)孔)和配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本(70例)制成組織芯片，HCC組織芯片樣本購(gòu)自武漢賽維爾公司。70例HCC患者中男性66例，女性4例，年齡14.0～69.0歲，中位年齡47.5歲；患者均首次確診為HCC，未行放、化療。HCC患者的組織標(biāo)本根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)/國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)的TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行分期，其中Ⅰ期25例，Ⅱ期5例，Ⅲ期33例，Ⅳ期7例。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)大理大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)6種人類HCC細(xì)胞系(SMMC-7721、BEL-7402、Hep3B、HepG2、QGY-7701、SK-Hep1)和人類正常肝細(xì)胞(THLE-2)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。將細(xì)胞用含10%胎牛血清(FBS)和1%抗生素(100 U / mL青霉素、100 mg / L鏈霉素)的高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng)。將所有細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。所有細(xì)胞系均通過(guò)短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat, STR)分析進(jìn)行鑒定，并使用TransDetect熒光素酶支原體試劑盒檢測(cè)是否存在支原體的污染。

1.3 Western blot法從RIPA細(xì)胞裂解液中收集蛋白質(zhì)樣品，并使用二辛可寧酸(bicinchoninic acid, BCA)試劑盒測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度。用10%SDS-PAGE凝膠分離50 mg總蛋白的樣品，電轉(zhuǎn)移置聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將PVDF膜在TBS中的5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，在4 ℃與兔抗TEFM單克隆抗體(1 ∶1 000, GeneTex, USA)孵育過(guò)夜。用TBST洗滌后，將PVDF膜用辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000, Abcam, USA)在4 ℃下孵育2 h。采用Western blot發(fā)光液檢測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)，并用Image Lab 5.2.1軟件進(jìn)行半定量分析。TEFM蛋白的相對(duì)表達(dá)水平用目的條帶與內(nèi)參條帶之間的累積光密度(accumulated optical density, AOD)之比表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 組織芯片制作HCC組織芯片由武漢賽維爾生物公司制作，70例配對(duì)的HCC組織和癌旁組織用4%多聚甲醛固定24 h后，將組織從固定液取出在通風(fēng)櫥內(nèi)用手術(shù)刀將目的部位組織修平整，將修切好的組織和對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽置于脫水盒內(nèi)。將脫水盒放進(jìn)脫水機(jī)內(nèi)依次梯度乙醇進(jìn)行脫水，將浸好蠟的組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋、凍臺(tái)冷卻，蠟?zāi)毯髮⑾瀴K從包埋框中取出并修整。將修整好的蠟塊置于石蠟切片機(jī)，4 μm厚切片，切片漂浮于攤片機(jī)40 ℃溫水將組織展平，載玻片將組織撈起，60 ℃烘箱內(nèi)烤片，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 免疫組化采用免疫組化SP法染色，標(biāo)本均經(jīng)修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片。石蠟切片脫蠟至水洗，將組織切片置于檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(pH 6.0)的修復(fù)盒中，于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。自然冷卻后將玻片置于PBS(pH 7.4)中洗滌，放入3%雙氧水溶液，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。滴加3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。在切片上滴加用兔抗人TEFM抗體(1 ∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜。滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min。滴加新鮮配制的DAB顯色液，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3 min，中性樹(shù)膠封固。使用倒置顯微鏡檢查，圖像采集分析，蘇木精染細(xì)胞核為藍(lán)色，陽(yáng)性為棕黃色。

1.6 細(xì)胞陽(yáng)性率判斷使用PANNORAMIC全景切片掃描儀將組織切片上機(jī)后，切片會(huì)在掃描儀的鏡頭下逐步移動(dòng)，一邊移動(dòng)、一邊成像將組織切片的信息均掃描成像形成文件夾。文件夾用CaseViewer 2.2軟件打開(kāi)，可以1～400倍放大進(jìn)行觀察。使用Halo v3.0.311.314分析軟件中TMA插件設(shè)置芯片組織點(diǎn)直徑大小和行列數(shù)，軟件自動(dòng)生成編號(hào)。使用Indica Labs-Multiplex IHC v2.2.0模塊，分別定量每張芯片每個(gè)點(diǎn)的目的區(qū)域陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、總細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞陽(yáng)性率。

1.7 組織芯片H-score評(píng)分將每張切片內(nèi)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)及其染色強(qiáng)度以特定的公式轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的數(shù)值，達(dá)到對(duì)組織染色目的蛋白質(zhì)半定量的目的。H-score=∑(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量×代表著色強(qiáng)度)=(弱陽(yáng)性細(xì)胞的百分比×1)+(中度陽(yáng)性細(xì)胞的百分比×2)+(強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比×3)。

2 結(jié)果

2.1 TEFM蛋白在6種人類HCC細(xì)胞中的表達(dá)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TEFM蛋白的表達(dá)量在BEL-7402細(xì)胞中最低(1.412±0.007)，在Hep3B細(xì)胞中最高(2.210±0.008) 。與體外培養(yǎng)的人類正常肝細(xì)胞(THLE-2)相比，TEFM蛋白的表達(dá)量在6種人類HCC細(xì)胞系(SMMC-7721、BEL-7402、Hep3B、HepG2、QGY-7701和SK-Hep1)中均顯著上調(diào)[(1.803±0.275)倍](P<0.05，圖1)。

圖1 Western blot法檢測(cè)TEFM蛋白在正常肝細(xì)胞(THLE-3)和6種肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞中的表達(dá)：A.電泳圖；B.直方圖

2.2 HCC、癌旁組織中細(xì)胞陽(yáng)性率和TEFM蛋白的相對(duì)表達(dá)量HCC組織芯片中收集70例HCC患者的組織標(biāo)本，該芯片結(jié)果包括HCC確診病例組織及復(fù)孔和配對(duì)的癌旁組織。使用Halo v3.0.311.314分析軟件中TMA插件設(shè)置芯片組織點(diǎn)直徑大小和行列數(shù)，軟件自動(dòng)生成編號(hào)(圖2)。本組根據(jù)HCC組織及其癌旁組織的細(xì)胞陽(yáng)性率進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示：HCC組織的細(xì)胞陽(yáng)性率高于其配對(duì)癌旁組織(t=2.235，P=0.041，圖3A)。

圖2 肝細(xì)胞性肝癌和對(duì)應(yīng)癌旁組織的全芯片組織掃描：其中第1、4、7、10、13、16列為癌旁組織；其余列為肝細(xì)胞性肝癌組織

根據(jù)H-score評(píng)分比較HCC組織及其配對(duì)癌旁組織的TEFM相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，HCC組織的TEFM相對(duì)表達(dá)量增高(t=2.569，P=0.038，圖3B)。

圖3 肝細(xì)胞性肝癌和癌旁組織中的細(xì)胞陽(yáng)性率及TEFM相對(duì)表達(dá)量：A.肝細(xì)胞性肝癌組織與癌旁組織的細(xì)胞陽(yáng)性率；B.肝細(xì)胞性肝癌組織與癌旁組織的TEFM相對(duì)表達(dá)量

2.3 不同TNM分期的HCC和癌旁組織中的TEFM相對(duì)表達(dá)量本組HCC組織芯片結(jié)果顯示，TEFM蛋白陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。本組結(jié)果顯示，相同TNM分期的TEFM蛋白表達(dá)量在

HCC組織中比對(duì)應(yīng)的癌旁組織高，但HCC的TNM分期與TEFM蛋白表達(dá)量高低之間并無(wú)明顯關(guān)聯(lián)(圖4)。

圖4 TEFM蛋白在不同病理分期的肝細(xì)胞性肝癌和癌旁組織中的表達(dá)：A.Ⅰ期肝細(xì)胞性肝癌的癌旁組織；B.Ⅰ期肝細(xì)胞性肝癌組織；C.Ⅱ期肝細(xì)胞性肝癌的癌旁組織；D.Ⅱ期肝細(xì)胞性肝癌組織；E.Ⅲ期肝細(xì)胞性肝癌的癌旁組織；F.Ⅲ期肝細(xì)胞性肝癌組織；G.Ⅳ期肝細(xì)胞性肝癌的癌旁組織；H.Ⅳ期肝細(xì)胞性肝癌組織，SP法

2.4 不同分化程度的HCC組織與癌旁組織中TEFM相對(duì)表達(dá)量根據(jù)HCC的臨床病理結(jié)果將HCC組織劃分為高、中和低分化組，HCC細(xì)胞分化程度越低，則HCC的惡性程度越高。本組結(jié)果顯示，無(wú)論高、中分化或者低分化HCC組織中的TEFM蛋白表達(dá)水平均高于癌旁組織(圖5)。

圖5 TEFM蛋白在不同分化程度的HCC組織及癌旁組織中的表達(dá)：A.高分化肝細(xì)胞性肝癌的癌旁組織；B.高分化肝細(xì)胞性肝癌組織；C.中分化肝細(xì)胞性肝癌的癌旁組織；D.中分化肝細(xì)胞性肝癌組織；E.低分化肝細(xì)胞性肝癌的癌旁組織；F.低分化肝細(xì)胞性肝癌組織，SP法

2.5 HCC組織中TEFM的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系根據(jù)H-score評(píng)分得出本組TEFM相對(duì)表達(dá)水平由低到高排列。將TEFM相對(duì)表達(dá)量按中位表達(dá)量進(jìn)行分組，低于中位表達(dá)量的標(biāo)本為低表達(dá)組，高于中位表達(dá)量的標(biāo)本為高表達(dá)組。本組TEFM低表達(dá)組35例，高表達(dá)組35例。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：TEFM相對(duì)表達(dá)量與AFP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；其與患者年齡、性別、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、HBV感染、肝硬化、血管侵犯、腫瘤數(shù)量、腫瘤大小、腫瘤包膜完整性和腫瘤復(fù)發(fā)均無(wú)相關(guān)性(P均>0.05，表1)。

表1 肝細(xì)胞性肝癌中TEFM蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.6 HCC組織中TEFM表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系本組應(yīng)用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗(yàn)HCC患者預(yù)后與TEFM表達(dá)的關(guān)系，繪制總生存期(overall survival, OS)和無(wú)瘤生存期(disease-free survival, DFS)生存曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TEFM蛋白的表達(dá)與HCC患者的OS(P=0.539，圖6A)以及DFS(P=0.994，圖6B)均無(wú)相關(guān)性。

圖6 TEFM蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞性肝癌預(yù)后的關(guān)系：A.總生存期；B.無(wú)瘤生存期

3 討論

HCC是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，每年全球有近100萬(wàn)新的HCC確診病例，中國(guó)占病例總數(shù)的50%以上[11]。盡管HCC的早期診斷和HCC的治療取得一定程度進(jìn)展，但HCC患者的預(yù)后仍然較差，復(fù)發(fā)率較高[12]。因此，分析HCC發(fā)生、發(fā)展的病理、生理機(jī)制，以尋求新的診斷方法，改善HCC患者的預(yù)后水平至關(guān)重要。TEFM在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、維持細(xì)胞呼吸鏈功能和能量代謝等具有重要作用[13]。目前，TEFM蛋白與HCC的發(fā)生、發(fā)展、臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系尚不明確。

本組首先通過(guò)Western blot法檢測(cè)人類正常肝細(xì)胞(THLE-2)和6種HCC細(xì)胞(SMMC-7721、BEL-7402、Hep3B、HepG2、QGY-7701和SK-Hep1)中TEFM蛋白的表達(dá)差異。TEFM蛋白在6種人類HCC中的表達(dá)與THLE-2相比，其表達(dá)均上調(diào)。采用組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化檢測(cè)HCC組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織中細(xì)胞陽(yáng)性率和TEFM蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明：與癌旁組織相比，HCC組織細(xì)胞陽(yáng)性率增高，且TEFM蛋白在HCC組織中表達(dá)量增高；提示TEFM基因的作用可能類似于細(xì)胞癌基因，參與HCC的發(fā)生。免疫組化結(jié)果還顯示，TEFM蛋白僅在HCC組織的細(xì)胞質(zhì)中呈陽(yáng)性。已有研究表明，HCC的發(fā)生不僅與細(xì)胞核內(nèi)的DNA相關(guān)，也與細(xì)胞質(zhì)中的mtDNA密切相關(guān)[14]。Qiao等[15]發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，HCC組織中mtDNA拷貝數(shù)降低、突變率增加，通過(guò)線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)蛋白過(guò)表達(dá)促進(jìn)mtDNA轉(zhuǎn)錄，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TEFM蛋白也在HCC組織中高表達(dá)，提示TEFM蛋白可能與TFAM蛋白協(xié)同作用，促進(jìn)mtDNA的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞能量代謝促進(jìn)HCC發(fā)生。此外，本組還對(duì)TEFM蛋白的相對(duì)表達(dá)量與HCC臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TEFM相對(duì)表達(dá)量與HCC患者的血清AFP有相關(guān)性(P<0.01)。由于臨床上僅有血清AFP 的升高并不能直接確診肝癌，單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的指標(biāo)敏感性和特異性有一定的局限，聯(lián)合診斷是提高診斷效能的重要方法之一。TEFM蛋白檢測(cè)與血清AFP的檢測(cè)聯(lián)合使用，可能成為HCC診斷的輔助手段。本組使用Kaplan-Meier生存模型對(duì)TEFM相對(duì)表達(dá)量和HCC患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TEFM相對(duì)表達(dá)量與HCC患者OS和DFS均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，提示TEFM蛋白表達(dá)量不能作為HCC患者預(yù)后的有效指標(biāo)。由于本組收集的HCC樣本量較小、人群異質(zhì)性和缺乏隨機(jī)性，導(dǎo)致分析結(jié)果可能存在一定的誤差，需擴(kuò)大樣本的數(shù)量進(jìn)一步分析。

總之，本組發(fā)現(xiàn)TEFM蛋白在HCC細(xì)胞和組織中表達(dá)增高，反映TEFM可能為HCC診斷的潛在腫瘤標(biāo)志物之一。同時(shí)，TEFM蛋白檢測(cè)可與血清AFP檢測(cè)聯(lián)合作為HCC的輔助診斷手段。未來(lái)可進(jìn)一步探索TEFM蛋白在HCC發(fā)生、發(fā)展中的功能，進(jìn)而尋找有效抑制TEFM過(guò)表達(dá)的siRNA或小分子抑制劑，有助于HCC的臨床治療。