一種制作組織芯片的簡易方法

張 盛，岳君秋，王明偉

組織芯片也稱組織微陣列[1]，是指將許多不同個體組織標本按一定的順序排列于同一載體上，進行同一指標的原位組織學研究。利用組織芯片可以節(jié)省時間和試劑，同時其也被應用于形態(tài)學教材、實驗室評估和科研等方面。有文獻介紹組織芯片制作技術及其應用，但制作過程相對較復雜。本文采用經(jīng)過脫水、透明和浸蠟處理后的白蘿卜作為載體，用穿刺針獲取供體組織塊的方法，制作出組織芯片。該方法制作的組織芯片價格低廉，適合在臨床病理質(zhì)控和科研等日常工作中推廣應用，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器白蘿卜；經(jīng)皮穿刺針；收集湖北省腫瘤醫(yī)院病理科肝癌組織存檔蠟塊；優(yōu)質(zhì)石蠟；玻片；組織脫水機、包埋機和切片機。

1.2 方法(1)將白蘿卜按3 mm厚度修整成塊，放入包埋框蓋好，置于10%中性福爾馬林中固定4～8 h，梯度乙醇脫水、透明和浸蠟處理后備用。(2)在溫熱狀態(tài)下使用經(jīng)皮穿刺針的針套在白蘿卜組織塊上進行規(guī)則微陣列打孔。(3)病理醫(yī)師復閱所有蠟塊對應的HE切片，鏡下選取代表性的區(qū)域，并用記號筆在石蠟塊上對應標記該目標區(qū)域。采用經(jīng)皮穿刺針的針套從稍預熱的供體蠟塊中穿出目標組織，使用自行磨平的針芯擠出石蠟芯備用。(4)使用眼科鑷子將石蠟芯按設計好的順序注入白蘿卜中的相應孔洞，并做好標記。(5)將所有孔均填滿組織芯的白蘿卜置于包埋模具中，連同包埋模具完全浸泡于65 ℃石蠟中，待組織芯及白蘿卜周圍的石蠟完全熔化并排出氣泡后，取出包埋模具放置冷凍臺上，迅速逐個按壓，使所有組織芯的底面齊平，再包埋制成組織蠟塊。

2 結果

2.1 組織芯片制作的組織芯片所有位點組織形態(tài)清晰可辨，受體蠟塊均未見裂開現(xiàn)象，組織位點排列整齊，位點無丟失。組織芯柱與受體蠟塊結合緊密，未見任何氣泡產(chǎn)生(圖1)。

圖1 組織芯片

2.2 HE染色組織芯片進行常規(guī)的HE染色，顯微鏡下評估組織芯片染色效果，其細胞形態(tài)及結構均清晰可辨(圖2)。

圖2 肝癌組織芯片HE染色

2.3 免疫組化染色組織芯片經(jīng)免疫組化染色檢測Ki-67、Happar-1和E-cadherin的表達，結果顯示，Ki-67、Happar-1和E-cadherin分別定位于細胞核、細胞質(zhì)和細胞膜，其定位分布與常規(guī)石蠟切片行免疫組化染色一致，同時染色強度、特異性與常規(guī)蠟塊染色結果也完全相符(圖3)。

圖3 肝癌組織芯片中Ki-67(A)、Happar-1(B)和E-cadherin(C)的免疫組化染色，EnVision法

3 討論

利用組織芯片可以大大縮短實驗時間和節(jié)省試劑成本[2]。然而，組織芯片制備儀價格高昂，后期維護和保養(yǎng)過程較復雜，對于非大型醫(yī)院或大規(guī)模實驗室都是極大的經(jīng)濟負擔而無法推廣。本實驗介紹的組織芯片具有成本低、性能高的優(yōu)點，能有效解決這一難題。秦廣琪等[3]采用UNITMA公司提供的預鑄蠟塊，制作一種簡便易行的組織芯片。有學者[4-7]通過自行設計工具成功制作了組織芯片，但他們通過澆注的方法制作受體蠟塊，很難保證受體蠟塊與組織芯之間完全融合，易有空隙或氣泡，最終導致組織芯和受體蠟塊分離，陣列紊亂。如何保持陣列的完整性以及組織芯與受體蠟塊的融合性，是組織芯片制作中關鍵的技術要點。本組介紹的組織芯片可以有效解決這一關鍵問題。在實踐中，我們對多種植物材料進行比對，包括白蘿卜、花菜芯、土豆、地瓜、萵筍和海帶梗等。土豆、地瓜等含有淀粉成分，蘇木精染色后被染成淡藍色，行免疫組化復染后影響切片觀察；海帶梗脫水后組織卷曲發(fā)硬。白蘿卜脫水徹底，硬度適中，支持作用良好，利于制片。同時，白蘿卜細胞壁薄，蘇木精復染幾乎不著色，對免疫組化染色沒有影響。

另外，本組介紹的組織芯片在制備過程中有以下注意事項：白蘿卜取材時要求規(guī)整，厚薄不均或過厚將影響脫水效果；白蘿卜水分含量較多，與臨床標本同時處理不能做到徹底脫水，因此應適當延長脫水時間約7 h；脫水、透明和浸蠟后的白蘿卜應在表面沒有固態(tài)石蠟的溫熱狀態(tài)下使用穿刺針進行垂直打孔，以保證白蘿卜在打孔過程中不會破損；包埋前應將填充有組織芯的白蘿卜浸泡于液體石蠟中，直至石蠟完全熔化并逐個排除中間的氣泡，使白蘿卜與組織芯完全融合，保證切片時不出現(xiàn)組織脫離現(xiàn)象。同時，塑料包埋框也應浸泡于液體石蠟中，包埋時使包埋框與石蠟溫度接近，增加包埋框與石蠟的融合度，避免切片時蠟塊與包埋框的分離；穿取供體蠟塊組織制備組織芯時，由于每個蠟塊的組織厚度不同，經(jīng)大批量切片后部分組織可能缺失，導致芯片信息不全，因此可以在供體蠟塊同一指標的陽性部位多穿取幾次，填充于同一孔中，直至填滿，技術上稱為“堆垛”；另外，供體組織可以按病種或抗體系列分類制成芯片蠟塊，作為免疫組化檢測陽性對照使用。

總之，采用白蘿卜作為載體制作組織芯片，與傳統(tǒng)方法相比，更為簡便、經(jīng)濟、實用、可靠。該組織芯片進行HE和免疫組化染色，與常規(guī)蠟塊染色效果相同。手工制作芯片，在組織排列上能夠滿足日常工作的需求，非常適合在病理科或科研機構，尤其是基層單位病理科推廣應用。