王南卜 王志芳 韓玉鳳 康健 方永奇 李翎

〔摘要〕 目的 探討β-細辛醚對淀粉樣前體蛋白（APP）/早老素1（PS1）小鼠的作用機制及對PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬的影響。方法 將APP/PS1小鼠隨機分為模型組、β-細辛醚低、中、高劑量組（15、30、45 mg/kg）、多奈哌齊組（1 mg/kg）、雷帕霉素組（4 mg/kg）、3-甲基腺嘌呤（3-MA）組（4 mg/kg）、環(huán)孢霉素A組（10 mg/kg），另設(shè)正常組，每組10只。各組灌胃給藥，模型組和正常組用等體積蒸餾水代替，1次/d，給藥30 d。觀察各組小鼠水迷宮實驗，蛋白質(zhì)印跡法檢測小鼠海馬中APP、PS1、神經(jīng)突觸素1（SYN1）、β-位點淀粉樣前體蛋白裂解酶1（BACE1）、LC3 I/II、Beclin-1、p62、PINK1、Parkin和p-Parkin蛋白表達水平;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測APP、PS1、BACE1、LC3B、Beclin-1、p62和Parkin mRNA表達水平。結(jié)果 與模型組相比，β-細辛醚高劑量組、β-細辛醚中劑量組和多奈哌齊組APP/PS1小鼠的逃避潛伏期縮短（P<0.05或P<0.01），小鼠海馬內(nèi)APP、PS1、BACE1的表達下降（P<0.01），SYN1表達上升（P<0.05或P<0.01）;與模型組相比，β-細辛醚中劑量組APP/PS1小鼠內(nèi)Beclin-1、LC3B表達均升高（P<0.05或P<0.01），p62表達下降（P<0.05）;與模型組相比，雷帕霉素組Beclin-1、LC3B表達均升高（P<0.05或P<0.01），p62表達下降（P<0.01）;與模型組相比，3-MA組p62表達升高（P<0.05）;與模型組相比，β-細辛醚中劑量組APP/PS1小鼠內(nèi)PINK1、p-Parkin表達均顯著升高（P<0.01）。結(jié)論 β-細辛醚通過激活PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬而影響阿爾茨海默病病理，這為應(yīng)用β-細辛醚治療阿爾茨海默病提供了新的靶點。

〔關(guān)鍵詞〕 阿爾茨海默病;β-細辛醚;線粒體自噬;PINK1;Parkin;淀粉樣前體蛋白;早老素1;神經(jīng)突觸素1

〔中圖分類號〕R277.7? ? ? 〔文獻標(biāo)志碼〕B? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.08.008

β-Asarone Improves Cognitive and Memory Impairment in APP/PS1 Mice by Activating

PINK1/Parkin Mediated Mitochondrial Autophagy

WANG Nanbu1， WANG Zhifang2， HAN Yufeng2， KANG Jian2， FANG Yongqi1， LI Ling1*

（1. The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510405， China;

2. Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510006， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of β-asarone on APP/PS1 mice and its effect on the mitochondrial autophagy mediated by PINK1/Parkin. Methods APP/PS1 mice were randomly divided into model group， low/medium/high dose groups （15， 30， 45 mg/kg） of β-asarone， donepezil group （1 mg/kg）， rapamycin group （4 mg/kg）， 3-methyladenine （3-MA） group （4 mg/kg）， cyclosporine A （CsA） group （10 mg/kg） and normal group， with 10 mice in each group. Each group was given intragastric administration， and model group and normal group were given equal volume distilled water once a day for 30 days. Water maze test was observed in each group. Amyloid precursor protein （APP）， prosenoxin 1 （PS1）， synaptophysin 1 （SYN1）， β-site amyloid precursor protein lyase 1 （BACE1） and LC3I/II， Beclin-1， p62， PINK1， Parkin and p-Parkin were detected in the hippocampus of mice by western blot. The mRNA expression levels of APP， PS1， BACE1， LC3B， Beclin-1， P62 and Parkin were detected by reverse transcription polymerase chain reaction. Results Compared with the model group， the escape latency of APP/PS1 mice in β-asarone high dose group， β-asarone medium dose group and donepezil group was significantly shortened （P<0.05 or P<0.01）， the expression of APP， PS1 and BACE1 in hippocampus of mice decreased （P<0.01）， and the expression of SYN1 increased （P<0.05 or P<0.01）; compared with the model group， the expression of Beclin-1 and LC3B in β-asarone medium dose group increased （P<0.01 or P<0.05）， and the expression of p62 decreased （P<0.05）; compared with the model group， the expression of Beclin-1 and LC3B in rapamycin group increased （P<0.05 or P<0.01）， and the expression of p62 decreased （P<0.01）; the expression of p62 in 3-MA group was higher than that model group （P<0.05）; compared with the model group， the expression levels of PINK1 and p-Parkin in APP/PS1 mice in β-asarone medium dose group were significantly increased （P<0.01）. Conclusion β-asarone may affect Alzheimer's Disease （AD） pathology by activating mitochondrial autophagy mediated by PINK1-Parkin， which provides a new target for the treatment of AD with β-asarone.

〔Keywords〕 Alzheimer's disease; β-asarone; mitochondrial autophagy; PINK1; Parkin; amyloid precursor protein; prosenoxin 1; synaptophysin 1

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease， AD）是以進行性認(rèn)知功能障礙和記憶損害為主要臨床表現(xiàn)的慢性神經(jīng)退行性疾病，我國2015至2018年AD合并患病率為6.6%[1]。根據(jù)發(fā)病機制的研究進展，針對AD的新藥物開發(fā)主要著眼于抑制β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein， Aβ）的異常聚集、減少Tau蛋白過度磷酸化來改善AD患者的學(xué)習(xí)和記憶功能[2]。然而，目前在世界范圍內(nèi)用于治療AD的一線藥物仍以乙酰膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑為主，食品藥品監(jiān)督管理局自2003年以來未批準(zhǔn)任何新藥[3]。因此，對AD的治療方案尚不成熟，仍需要不斷探索和開發(fā)新的治療藥物以滿足臨床的需要。

AD屬中醫(yī)學(xué)的“中風(fēng)”“癡呆”范疇[4]，其主要病機以本虛為主，氣血虛損致病理產(chǎn)物生成，以痰瘀阻竅為標(biāo)，在治療方面，多用補益藥配伍活血、化痰、醒腦開竅藥等。石菖蒲具有芳香走竄、開竅醒神的藥性，其主要有效成分β-細辛醚分子量小，脂溶性強，在體內(nèi)吸收和分布較快的特點[5]，能快速通過血腦屏障，在腦組織內(nèi)分布廣泛[6-7]。并且β-細辛醚對神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，以及抑郁癥、腦梗死等都有一定的治療效果，所以，β-細辛醚具有很好的開發(fā)成AD治療新藥物的前景。

本文以APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為動物模型，以多奈哌齊作為陽性對照藥，設(shè)置β-細辛醚低、中、高劑量組，通過觀察小鼠的水迷宮實驗、避暗實驗和跳臺實驗結(jié)果判斷β-細辛醚對APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力是否具有改善作用;采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot， WB）測定AD小鼠海馬中淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein， APP）、早老素1（presenilin 1， PS1）、神經(jīng)突觸素1（synapsin 1， SYN1）、β-位點淀粉樣前體蛋白裂解酶1（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1， BACE1）的表達和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase

chain reaction， RT-PCR）檢測相關(guān)基因APP、PS1、BACE1 mRNA的表達，證明β-細辛醚是否通過影響APP/PS1小鼠海馬內(nèi)APP、PS1、SYN1和BACE1的基因表達和蛋白質(zhì)合成起到治療作用。以自噬激活劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine， 3-MA）作為自噬研究的雙向?qū)φ账?，通過檢測小鼠海馬內(nèi)LC3I/II、Beclin-1和p62的蛋白表達水平以及LC3II、Beclin-1和p62 mRNA表達水平，進一步研究β-細辛醚對自噬功能的影響。以線粒體自噬抑制劑環(huán)孢霉素A（cyclosporin A， CsA）[8]為PINK1/Parkin信號通路抑制劑為陰性藥，檢測小鼠海馬PINK1、Parkin和p-Parkin蛋白表達水平以及Parkin mRNA表達水平，研究β-細辛醚對該信號通路是否具有調(diào)控作用。

1 材料

1.1? 實驗動物

實驗小鼠由江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供，合格證號：SCXK（蘇）2018-0008，其中：B6C3-Tg（APPswe， PSEN1dE9）85Dbo/J品系的雙轉(zhuǎn)基因小鼠，SPF級，80只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2） g，3月齡;B6C3-Tg（APPswe， PSEN1dE9）85Dbo/J品系陰性小鼠，SPF級，10只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2） g，3月齡。于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗中心進行實驗，實驗單位使用許可證號：SYXK（粵）2018-0092。實驗前先將動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，期間自由飲水、進食標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料;室內(nèi)適度通風(fēng)，光照12 h，室溫（23±2） ℃，濕度（55±5）%。

1.2? 主要藥物與試劑

β-細辛醚由本實驗中心自制。石菖蒲飲片購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，批號：171401。按照《中華人民共和國藥典》中揮發(fā)油提取法[9]，從石菖蒲飲片中提取揮發(fā)油，進行冷凍結(jié)晶，得到β-細辛醚，經(jīng)光譜（GC/MS，NMR，IR）檢測，證實β-細辛醚純度為99.55%。鹽酸多奈哌齊片（中國衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號：1703054）;環(huán)孢素A（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，批號：1703054）;雷帕霉素（美國Selleck Chemicals公司，批號：S1039）;3-MA（美國Sigma公司，批號：M9281）;水合氯醛（天津大茂化學(xué)試劑廠，批號：302-17-0）;吐溫20（上海晶純生化科技股份有限公司，批號：A1318030）;二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）（安徽Biosharp公司，批號：D-5879）;Anti-APP-1抗體（英國Abcam公司，批號：ab220832）;Anti-PS1抗體（英國Abcam公司，批號：ab15456）;Anti-SYN1抗體（英國Abcam公司，批號：ab194778）;Anti-BACE1抗體（英國Abcam公司，批號：ab183612）;Anti-Actin antibody（英國Abcam公司，貨號：ab179467）;Anti-beta Amyloid抗體（英國Abcam公司，批號：ab134022）;2×預(yù)混實時熒光定量快速PCR反應(yīng)體系（含ROX II）（北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司，批號：A304-10）;Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司，批號：AG11705）;氯仿（廣州化學(xué)試劑廠，批號：31004）。

1.3? 主要儀器

Morris小鼠水迷宮儀（型號：XR-XM101，上海欣軟信息科技有限公司）;小鼠避暗儀（型號：SBA-2，中國醫(yī)藥科學(xué)院藥物研究所）;跳臺儀（型號：YLS-3TB，濟南益延科技發(fā)展有限公司）;電子分析天平（型號：AE-200，上海梅特勒-托利多儀器有限公司）;低溫高速離心機（型號：3K30，美國Bio-Rad公司）;Tetra System（型號：Mini-PROTEAN，美國Sigma公司）;酶標(biāo)儀（型號：Multiskan MK3，美國Thermo scientific公司）;BioRad成像儀（型號：ChemiDoc XRS+System，美國Bio-Rad公司）;梯度PCR擴增儀（型號：ABI ProFlex，美國Applied Biosystems公司）;Real-Time PCR儀（型號：CFX96TM，美國Applied Biosystems公司）。

2 方法

2.1? 實驗分組與劑量

將80只APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為8組，雌雄各半，每組10只，即模型組、β-細辛醚低劑量組（15 mg/kg）、β-細辛醚中劑量組（30 mg/kg）、β-細辛醚高劑量組（45 mg/kg）、多奈哌齊組（1 mg/kg）、雷帕霉素組（4 mg/kg）、3-MA組（4 mg/kg）、CsA組（10 mg/kg）。另設(shè)正常組，B6C3-Tg（APPswe， PSE?N1dE9）85Dbo/J品系陰性小鼠10只，雌雄各半。各組灌胃給藥，模型組和正常組用等體積蒸餾水代替，1次/d，給藥30 d。

2.2? 藥物配制

以0.1%吐溫生理鹽水溶解β-細辛醚晶體，高、中、低濃度劑量組分別配置成0.15、0.30、0.45 mg/mL，給藥劑量按照人和動物給藥換算公式及前期實驗經(jīng)驗進行設(shè)置[10];鹽酸多奈哌齊片搗碎，溶于生理鹽水中，配制成濃度為0.06 mg/mL的水溶液。雷帕霉素和3-MA以0.02% DMSO溶解粉劑成濃度為0.04 mg/mL;環(huán)孢素A軟膠囊用0.02% DMSO及生理鹽水充分溶解成濃度為0.1 mg/mL，以上藥物均超聲水浴溶解至無沉淀，存于4 ℃冰箱備用。

2.3? 水迷宮實驗

在水迷宮內(nèi)設(shè)有4個盲端，在水迷宮的終端裝有平臺，高出水面，小鼠游到平臺時代表游泳結(jié)束。給藥第28天后，各組小鼠每只依次在水迷宮內(nèi)進行訓(xùn)練，連續(xù)訓(xùn)練4 d，每天依次訓(xùn)練取得1、2、3、4個盲端，再游完全程，其中設(shè)定總時間為5 min，超過5 min不能游出者，按5 min計。給藥第20天后，把訓(xùn)練好的小鼠進行正式水迷宮實驗，觀察記錄小鼠5 min內(nèi)游泳到平臺所用時間（s）（逃避潛伏期），超過5 min不能游出者，按5 min計[11-12]。

2.4? 取材

水迷宮實驗結(jié)束后，各組小鼠禁食禁水24 h，用0.1 g/mL水合氯醛，根據(jù)體質(zhì)量按照0.35 g/kg進行腹腔注射麻醉，剪開胸部，暴露心臟，50 mL注射器抽取一定量生理鹽水進行心臟灌注（從左心室推進，剪開右心耳排血）。觀察到小鼠雙肺變白，隨即分離頭部，在冰上迅速取出大腦，分離海馬于-80 ℃冷凍待測。

2.5? 指標(biāo)檢測

2.5.1? WB檢測APP/PS1小鼠海馬組織內(nèi)APP、PS1、SYN1、BACE1蛋白表達水平? 取各組小鼠海馬組織加裂解液冷凍勻漿后，離心（13 000 g，4 ℃）10 min，上清液經(jīng)BCA法檢測蛋白濃度后配平。上樣量為20 μL，電泳條件為80 V 20 min，然后100 V 50 min，濕法轉(zhuǎn)膜，條件200 mA 90 min，APP、PS1、SYN1、BACE1抗體和內(nèi)參抗體稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000和1∶10 000，二抗?jié)舛仁?∶10 000，其他方法步驟按常規(guī)WB進行，用ECL試劑盒在化學(xué)發(fā)光檢測器中檢測，用Image-pro進行分析。

2.5.2? RT-PCR檢測APP/PS1小鼠內(nèi)Beclin-1、p62、

LC3B mRNA表達水平? 取小鼠海馬組織，根據(jù)PCR試劑盒操作步驟，提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為DNA，最后進行RT-PCR，實驗結(jié)束后，結(jié)果在Bio-rad CFX Manager中分析，實驗引物序列見表1。

2.6? 統(tǒng)計方法

各組數(shù)據(jù)用Graph Prism 8.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，用One-Way ANOVA進行兩兩比較，若方差齊則采用Bonferrioni法，若方差不齊則采用Tambanes T2法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? β-細辛醚對AD模型小鼠的影響

3.1.1? 行為學(xué)結(jié)果? 與正常組對比，模型組APP/PS1小鼠的逃避潛伏期延長（P<0.01）。與模型組對比，β-細辛醚高劑量組、β-細辛醚中劑量組和多奈哌齊組APP/PS1小鼠的逃避潛伏期縮短（P<0.05或P<0.01）。見圖1。

3.1.2? β-細辛醚對APP/PS1小鼠海馬內(nèi)APP、PS1、BACE1、SYN1蛋白表達的影響? 與正常組對比，模型組APP/PS1小鼠內(nèi)APP、PS1、BACE1表達顯著升高，SYN1表達顯著降低（P<0.01）。與模型組對比，β-細辛醚低劑量組、β-細辛醚中劑量組、β-細辛醚高劑量組、多奈哌齊組APP/PS1小鼠內(nèi)APP、PS1表達降低（P<0.01）。與模型組對比，β-細辛醚高劑量組、多奈哌齊組APP/PS1小鼠內(nèi)SYN1表達升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組對比，β-細辛醚高劑量組APP/PS1小鼠內(nèi)BACE1表達下降（P<0.05）。見圖2。3.1.3? β-細辛醚對APP/PS1小鼠海馬內(nèi)APP、PS1、BACE1 mRNA表達的影響? 與正常組對比，模型組APP/PS1小鼠內(nèi)APP、PS1、BACE1 mRNA表達升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組對比，β-細辛醚低劑量組、β-細辛醚中劑量組、β-細辛醚高劑量組、多奈哌齊組APP/PS1小鼠內(nèi)APP mRNA表達降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組對比，β-細辛醚中劑量組、β-細辛醚高劑量組、多奈哌齊組APP/PS1小鼠內(nèi)PS1 mRNA表達降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組對比，β-細辛醚高劑量組APP/PS1小鼠內(nèi)BACE1表達降低（P<0.01）。見圖3。

3.2? β-細辛醚對AD模型小鼠海馬體內(nèi)自噬的影響

3.2.1? β-細辛醚對APP/PS1小鼠海馬內(nèi)LC3 I/II、Beclin-1、p62蛋白表達的影響? 與正常組對比，模型組APP/PS1小鼠內(nèi)LC3 I/II、Beclin-1表達下降（P<0.05或P<0.01），p62表達升高（P<0.05）。與模型組對比，β-細辛醚中劑量組APP/PS1小鼠內(nèi)LC3 I/II、Beclin-1表達均升高（P<0.05或P<0.01）;3-MA組APP/PS1小鼠內(nèi)LC3 I/II、Beclin-1表達均下降（P<0.01）;雷帕霉素組LC3 I/II、Beclin-1表達均升高（P<0.01），p62表達下降（P<0.001）。見圖4。

3.2.2? β-細辛醚對APP/PS1小鼠海馬內(nèi)LC3B、Beclin-1、p62 mRNA表達的影響? 與正常組對比，模型組APP/PS1小鼠內(nèi)Beclin-1、LC3B mRNA表達下降（P<0.05或P<0.01），p62 mRNA表達升高（P<0.01）。與模型組對比，β-細辛醚中劑量組APP/PS1小鼠內(nèi)Beclin-1、LC3B mRNA表達均升高（P<0.05或P<0.01），p62 mRNA表達下降（P<0.05）。與模型組對比，雷帕霉素組Beclin-1、LC3B mRNA表達均升高（P<0.01或P<0.05），p62 mRNA表達下降（P<0.01）;3-MA組p62 mRNA表達下降（P<0.05）。見圖5。

3.3? β-細辛醚介導(dǎo)AD模型小鼠海馬體內(nèi)PINK1/Parkin通路的變化

3.3.1? β-細辛醚對APP/PS1小鼠內(nèi)PINK1、Parkin、p-Parkin蛋白表達的影響? 與正常組對比，模型組APP/PS1小鼠內(nèi)PINK1、Parkin、p-Parkin蛋白表達均下降（P<0.05或P<0.01）。與模型組對比，β-細辛醚中劑量組APP/PS1小鼠內(nèi)PINK1、p-Parkin蛋白表達均顯著升高（P<0.01）。見圖6。

3.3.2? β-細辛醚對ADAPP/PS1小鼠內(nèi)Parkin mRNA表達的影響? 與正常組對比，模型組APP/PS1小鼠內(nèi)Parkin mRNA表達下降（P<0.01）。與模型組對比，β-細辛醚中劑量組APP/PS1小鼠內(nèi)Parkin mRNA表達升高（P<0.01）。見圖7。

4 討論

AD的主要病理特征是Aβ的細胞外沉積、神經(jīng)元纖維纏結(jié)和廣泛神經(jīng)元缺失[13-14]。研究[15]表明，自噬與APP的代謝、Aβ的形成關(guān)系密切。在健康人的大腦中，APP主要通過β-分泌酶進行代謝，而在AD患者的大腦中則普遍發(fā)生α-分泌酶減少、β-分泌酶增加或活性增強[16]而引起APP代謝異常。β-分泌酶主要包括BACE1和BACE2，既往動物實驗[17]和細胞實驗[18]都表明，BACE1的降低可以減少Aβ生成，但針對此機制的藥物的研發(fā)并不順利。一項全球多中心雙盲臨床研究[19]表明，在早期和輕度AD患者中，拉那司他的BACE1抑制劑與安慰劑相比，未體現(xiàn)出改善AD患者認(rèn)知功能下降、延緩病情進展的效果。由于BACE2在神經(jīng)系統(tǒng)中分布較少、缺乏代表性，本研究采用BACE1作為評價β-細辛醚藥效作用的指標(biāo)之一。動物實驗[20]提示，SYN1對APP/PS1小鼠腦內(nèi)Aβ斑塊的形成具有抑制作用。本研究利用雙轉(zhuǎn)基因小鼠朊病毒蛋白因子能啟動突變的PS1和APP基因，以模擬人類AD發(fā)病過程的APP/PS1小鼠作為研究對象，給予相應(yīng)的藥物治療。研究結(jié)果提示，與正常組對比，模型組小鼠的水迷宮實驗中模型組APP/PS1小鼠的逃避潛伏期延長，海馬內(nèi)APP、PS1、BACE1表達升高，SYN1表達的降低（P<0.01），提示APP/PS1小鼠處于AD的狀態(tài)，神經(jīng)突觸在造模后明顯受損，且該表型不會隨著時間推移出現(xiàn)改善癥狀。與模型組相比，多奈哌齊組和β-細辛醚低、高劑量組APP/PS1小鼠的逃避潛伏期縮短（P<0.05或P<0.01），表明多奈哌齊和β-細辛醚都能改善小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。與模型組對比，高劑量β-細辛醚可提高海馬內(nèi)SYN1表達，降低APP、PS1、BACE1表達（P<0.05或P<0.01），提示β-細辛醚可能通過抑制AD海馬內(nèi)APP的異常表達和β-分泌酶的異常增高，保護APP/PS1小鼠神經(jīng)突觸功能起到治療AD的作用。

自噬在神經(jīng)退行性疾病的病程中起延緩疾病進程或加速疾病進程的雙向作用[21]，自噬系統(tǒng)功能紊亂會導(dǎo)致細胞內(nèi)異常蛋白沉積，與AD的Aβ積聚關(guān)系密切[22]。APP是自噬性降解的底物，自噬小體可能是APP產(chǎn)生的場所[23]。Tau蛋白的主要清除途徑包括自噬-溶酶體系統(tǒng)[24]，可見自噬功能變化會對AD的病理過程產(chǎn)生影響。而細胞內(nèi)Aβ的過度積累可能會損害自噬清除，從而增加AD損傷的神經(jīng)元內(nèi)自噬功能損傷。AD患者的大腦中表現(xiàn)出獨特的Aβ相關(guān)自噬病理：自噬泡（autophagic vacuoles， AVs）大量積聚在營養(yǎng)不良性神經(jīng)突內(nèi)，Aβ與AD大腦中的LE或多囊泡和AVs相關(guān)。促進Aβ螯合可減少細胞內(nèi)和細胞外Aβ，而抑制自噬體成熟和溶酶體水解，卻能增加細胞內(nèi)Aβ并降低細胞外Aβ[25]。根據(jù)β-細辛醚對小鼠逃避潛伏期和腦內(nèi)APP、PS1、BACE1、SYN1的變化結(jié)果，選取改善最明顯的β-細辛醚中劑量組進行機制研究。本研究結(jié)果表明，β-細辛醚中劑量能升高APP/PS1小鼠海馬內(nèi)LC3 I/II、Beclin-1并降低p62表達（P<0.05或P<0.01），作用與雷帕霉素相似，能夠促進自噬的發(fā)生。

作為選擇性自噬的一種，線粒體相關(guān)的自噬同樣貫穿AD的發(fā)病及疾病全程。線粒體是參與細胞能量合成代謝的重要細胞器。AD病患者表現(xiàn)出線粒體功能受損和線粒體清除缺陷的過程，如氧化磷酸化和腺苷三磷酸（adenosine triphosphate， ATP）產(chǎn)生減少，顯著增加氧化應(yīng)激并破壞抗氧化防御系統(tǒng)。ATP是細胞正常生命活動所需能量的直接來源，而線粒體產(chǎn)生ATP，可以維持自身穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)元的正常生存[26]。在AD患者中，Aβ異常增多影響線粒體正常功能，其沉積也會阻礙受損線粒體的自我清除，線粒體功能障礙在AD發(fā)病中起著重要作用。PINK1/Parkin通路是一條具有調(diào)節(jié)哺乳動物中線粒體的自噬途徑，其作用方式為通過泛素化Parkin以激活自噬[27]。PINK1為線粒體受損的主要探測器，當(dāng)線粒體受損時，PINK1在線粒體外膜磷酸化Parkin將其從細胞質(zhì)內(nèi)募集至受損線粒體，進而磷酸化胞漿中的E3泛素蛋白連接酶Parkin誘導(dǎo)其從細胞質(zhì)內(nèi)向受損的線粒體外膜上募集[28]，介導(dǎo)p62聚集物被VDAC1激活，啟動線粒體清除的過程[29]，而在大腦中逐漸減少的Parkin能夠反映出增強的線粒體自噬功能的損傷[30-31]。本研究中β-細辛醚對PINK1/Parkin信號通路的作用結(jié)果提示，模型組和CsA組PINK1和Parkin的表達均受抑制（P<0.05或P<0.01）。此外，與模型組相比，β-細辛醚中劑量組中的PINK1和Parkin水平升高（P<0.01），提示β-細辛醚可能通過激活PINK1/Parkin通路改善AD病程中的自噬損傷，促進AD鼠自噬功能，這可能是β-細辛醚對APP/PS1小鼠治療作用的機制之一。

綜上所述，β-細辛醚調(diào)節(jié)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬改善APP/PS1小鼠AD癥狀。本研究結(jié)果證明，β-細辛醚可能通過激活PINK1/Parkin信號通路，促進線粒體自噬，修復(fù)受損突觸功能，這可能為應(yīng)用β-細辛醚治療AD提供了新的靶點。

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