孟建宇 張婷婷 楊麗華

摘? ? 要：以內(nèi)蒙古巴丹吉林沙地藥用植物梭梭為材料，采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)，使用有機(jī)磷培養(yǎng)基對(duì)梭梭根際解磷菌進(jìn)行分離，基于16S rRNA基因序列分析進(jìn)行分類鑒定，采用釩鉬比色法測(cè)定其解有機(jī)磷能力，以植酸酶活性表示。從梭梭根際土壤中分離純化得到8株解有機(jī)磷細(xì)菌，分屬根瘤菌屬（Rhizobium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、泛菌屬（Pantoea）、馬西利亞菌屬（Massilia）和節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）。變形菌門（Proteobacteria）是梭梭根際極優(yōu)勢(shì)類群，占總數(shù)的87.5%。其中，菌株Y29 和B333解有機(jī)磷能力最強(qiáng)，植酸酶活分別為24.21，20.43 μg·mL-1，是2株極具開發(fā)潛力的解磷菌。本文揭示了梭梭根際可培養(yǎng)解有機(jī)磷細(xì)菌的類群組成，為認(rèn)識(shí)和利用荒漠解磷菌提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：梭梭;根際;有機(jī)磷降解菌;植酸酶活性;16S rRNA

中圖分類號(hào)：S567? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.08.001

Isolation of Organophosphate-degradation Bacteria from Rhizosphere of Haloxylon ammodendron and Their Organophosphate-degradation? Capability

MENG Jianyu，ZHANG Tingting， YANG Lihua

（Life Sciences College，InnerMongolia Agricultural University， Hohhot 010011， China）

Abstract：Traditional isolation and culture technology and organic phosphorus media were used to isolate organophosphate-degradation bacteria in the rhizosphere of medicinal plant Haloxylon ammodendron from the sandland of Badainjaran in Inner Mongolia. A preliminary identification was based on the 16S rRNA gene.Vanadium-ammonium-molybdate was used to measure the organophosphate-degradation capabilities， and the organophosphate-degradation cability was indicated by phytase activity. The results showed that a total of 8 organophosphate-degradation bacteria were isolated， which belonged to Rhizobium，Sphingomona， Pseudomonas，Enterobacter，Pantoea，Massilia and Arthrobacter， respectively. The Extremely dominant class was Proteobacteria with ratio of 87.5%. The strains Y29 and B333 had the strongest ganophosphate-degradation ability， and the phytase activity was 24.21， 20.43 μg·mL-1， respectively，which were of great potential applicationvalue. This study preliminarily revealed the composition of cultivable organophosphate-degradation bacteria from rhizosphere of Haloxylon ammodendron， which provides a basis for understanding and using desert organophosphate-degradation bacteria for applications.

Key words： Haloxylon ammodendron;rhizosphere;organophosphate-degradation bacteria;phytaseactivity;16S rRNA

磷是植物生長(zhǎng)所需的大量元素、養(yǎng)分資源，對(duì)植物的抗逆性、抗病性和光合作用都有影響[1]。土壤中總磷（Total phosphorus，TP）含量較高，但生物可利用磷（Bioavailable phosphorus，BAP）僅占TP 的0.1 %[2]。BAP 的匱乏導(dǎo)致植物獲取有效磷受限，重影響作物的正常生長(zhǎng)[2-3]。施加磷肥是提高BAP 的主要方法，但過量添加無機(jī)磷會(huì)對(duì)環(huán)境的健康造成嚴(yán)重影響[4]，因其在施用過程中會(huì)對(duì)農(nóng)作物、大氣、土壤等造成影響，對(duì)人或動(dòng)物的毒害越來越大[5-6]，成為21世紀(jì)全球環(huán)境的挑戰(zhàn)[7-8]。

土壤中存在大量解磷微生物（Phosphorus solubilizing microorganism，PSM）可以提高植物對(duì)磷的需求，并且廣泛參與不可溶性磷的轉(zhuǎn)化[9]。微生物分泌特異的酶，如堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和植酸酶等，通過這些酶的催化作用，將植酸鹽等不可溶的有機(jī)磷酸鹽迅速分解成可溶性小分子[10]，也可以通過分解有機(jī)質(zhì)的磷-酯鍵和磷-酐鍵而釋放磷[11]，在磷的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[9]。解磷微生物基因信息豐富、代謝類型多樣、生長(zhǎng)周期短，使得微生物降解效率高、條件溫和且成本低，具有良好的應(yīng)用前景[12]。但目前對(duì)于以植酸磷為惟一磷源的有機(jī)磷降解菌的研究還較少[6]。

梭梭抗旱、抗熱、抗寒、耐鹽堿性都很強(qiáng)，防風(fēng)固沙能力強(qiáng)，是我國(guó)西北和內(nèi)蒙古干旱荒漠地區(qū)固沙造林的優(yōu)良樹種，而且是一種名貴的中藥材，可清肺化痰、降血脂、降血壓和殺菌等。本研究選擇以植酸鈣為唯一磷源，從梭梭根際土中分離高效有機(jī)磷降解菌，以期認(rèn)識(shí)和利用荒漠中解磷菌類群，為降解有機(jī)磷的微生物肥料提供高效穩(wěn)定的菌種來源及基礎(chǔ)資料，對(duì)于維護(hù)干旱荒漠地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，改善荒漠化狀態(tài)具有重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 樣品為采集自內(nèi)蒙古阿拉善巴丹吉林梭梭根際土，用已滅菌的刷子輕輕將梭梭根際土刷至聚乙烯塑料無菌采樣袋中，4 ℃保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。1.1.2 培養(yǎng)基 1/2R2A培養(yǎng)基：酵母膏0.25 g，蛋白胨0.25 g，酸水解絡(luò)素0.25 g，葡萄糖0.25 g，淀粉0.25 g，磷酸氫二鉀0.15 g，丙酮酸鈉0.15 g，硫酸鎂0.025 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，酵母粉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15 g，蛋白胨3 g，可溶性淀粉20 g，硫酸銨0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸錳0.3 g，硫酸亞鐵0.3 g，磷酸二氫鉀0.4 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5。

有機(jī)磷培養(yǎng)基：取2 mL植酸溶于400 mL去離子水中;取6 g醋酸鈣于100 mL去離子水中;將二者緩慢攪拌混勻。將混合液不斷攪拌，并加熱至沸騰，冷卻至室溫，于4 ℃過夜。將葡萄糖10 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，硫酸鎂0.3 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g加入混合液，并補(bǔ)水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.5。制備固體培養(yǎng)基時(shí)加入20.0 g瓊脂。

1.2 解磷菌的分離鑒定

稱取植物根際土 0.5 g，加入 49.5 mL無菌水，震蕩 30 min，靜置 10 min。吸取 1 mL上清液，用無菌水稀釋成 10-6～10-2五個(gè)梯度，各自涂布在固體有機(jī)磷培養(yǎng)基，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行。28 ℃條件下培養(yǎng)1周，挑取形態(tài)各異的單菌落，用四區(qū)劃線法劃線培養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，記錄菌株的生長(zhǎng)能力：第1天接菌，第2天開始觀察，第3天記錄，第3天長(zhǎng)出的菌，記為“+++++”，第4天長(zhǎng)出的菌，標(biāo)記為“++++”，依此類推，第7天長(zhǎng)出的菌，標(biāo)為“+”，若第7天還未生長(zhǎng)，則標(biāo)為“-”。

利用細(xì)菌通用引物27F和1492R對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行16S rRNA基因PCR擴(kuò)增[13]，擴(kuò)增產(chǎn)物送生上海工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，利用EzTaxon對(duì)測(cè)序所得16S rDNA片段序列進(jìn)行同源性分析，以確定菌株的種屬關(guān)系。

1.3 解磷能力測(cè)定

采用釩鉬比色法[14]對(duì)菌株進(jìn)行解磷能力測(cè)定。將分離的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、170 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)過夜。取適量發(fā)酵液，在10 000 r·min-1的離心機(jī)中離心10 min，取1 mL上清液，加入1 mL 5 mmol·L-1植酸鈉，37 ℃保溫30 min，再添加3 mL終止液中止反應(yīng)，充分振蕩，靜置15 min后，4 000 r·min-1離心15 min，然后在波長(zhǎng)415 nm處測(cè)定吸光值。根據(jù)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活，每個(gè)樣品均做3個(gè)平行。酶活力單位（IU）的定義為：37 ℃、pH 5.5的條件下，從濃度為8.4 g·L-1的植酸鈉溶液里每分鐘所釋放出1 μmol有機(jī)磷所需要的植酸酶量。以415 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光值為X軸、標(biāo)準(zhǔn)磷濃度為Y軸繪制有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），其方程式為y=12.652x+0.006（R2=0.9948），符合使用標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷菌的分離與鑒定

使用有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基，對(duì)內(nèi)蒙古阿拉善巴丹吉林梭梭根際解磷細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，共篩選得到具有解有機(jī)磷-植酸磷能力的解磷細(xì)菌8株（表1）。分別以8株解磷菌的基因組DNA為模板進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增，擴(kuò)增片段測(cè)序后在EzTaxon數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性分析（表2）。變形菌門（Proteobacteria）為主要類群，共有7株，占總數(shù)的87.5%，其中α-變形菌綱（α-Proteobacteria）有3株，菌株B58、B280屬于根瘤菌屬（Rhizobium），B174屬于鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）;γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria）有3株，W78屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），B9屬于腸桿菌屬（Enterobacter），W29屬于泛菌屬（Pantoea）;β-變形菌綱（α-Proteobacteria）有1株，屬于馬西利亞菌屬（Massilia）的B333。放線菌門有1株，屬于節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）的Y29。

2.2 解有機(jī)磷能力

用釩鉬比色法對(duì)8株菌進(jìn)行解有機(jī)磷-植酸磷能力的定量測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如圖2所示。這些菌株植酸酶活力在1.61～24.21 μg·mL-1。菌株Y29和B333解有機(jī)磷能力最強(qiáng)，植酸酶活分別為（24.21±1.21）μg·mL-1和（20.43±1.02） μg·mL-1，W78株植酸酶活力為16.54±0.83 μg·mL-1，B58株植酸酶活力為11.77±0.58 μg·mL-1，菌株B9植酸酶活力為9.14±0.45 μg·mL-1，B174、W29解有機(jī)磷能力最弱，植酸酶活都小于2 μg·mL-1。

3 結(jié)論與討論

從環(huán)境中分離有機(jī)磷高效降解微生物，研制解磷功能的微生物有機(jī)肥對(duì)解決植物可溶性磷供應(yīng)問題是一有效途徑[15]。近年來，有機(jī)磷降解菌的應(yīng)用逐步引起人們的關(guān)注，并在農(nóng)作物上已有應(yīng)用報(bào)道[16]，但其在荒漠固沙植物上的應(yīng)用卻鮮有報(bào)道，特別是中藥材根際解有機(jī)磷細(xì)菌研究較少[17]。

自然界中的部分功能微生物對(duì)有機(jī)磷具有降解作用，研究比較深入的是細(xì)菌和真菌。細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、黃桿菌屬（Xanthomonas）、固氮菌屬（Azotobacter）和硫桿菌屬（Thiobacillus）等。假單胞菌屬（Pseudomonas）、擬桿菌屬（Bacteroides）、紅螺菌屬（Rhodospirllum）、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）、沙雷氏菌屬（Serratia）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、腸桿菌屬（Enterobacter）、泛生菌屬（Pantoea）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella）等。解磷菌分布受土壤類型、有機(jī)質(zhì)含量、土壤地質(zhì)等因素的影響[18]，本文從荒漠灌木梭梭根際分離純化獲得8株解有機(jī)磷細(xì)菌，分屬2個(gè)門7個(gè)屬，與已分離的荒漠解磷菌種屬類似[19-21]。其中，根瘤菌屬（Rhizobium）有2株，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）有1株，假單胞菌屬（Pseudomonas）有1株，腸桿菌屬（Enterobacter）有1株，泛菌屬（Pantoea）有1株，馬西利亞菌屬（Massilia）有1株，節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）有1株;變形菌門（87.5%）是梭梭根際極優(yōu)勢(shì)類群。對(duì)分離的菌株進(jìn)行解有機(jī)磷能力測(cè)定，植酸酶活性普遍較高，處中上等水平，其中菌株Y29 和B333解有機(jī)磷能力最強(qiáng)，植酸酶活分別為（24.21±1.21） μg·mL-1和（20.43±1.02） μg·mL-1，高于已報(bào)道菌株的解有機(jī)磷能力[19，22-24]。本研究為內(nèi)蒙古荒漠地區(qū)植物根際解磷菌資源的研究提供了理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)，其中篩選所得的2株菌（Y29和B333）在微生物肥料及農(nóng)藥降解方面具備較高的應(yīng)用價(jià)值，為微生物肥料的開發(fā)利用以及農(nóng)藥的微生物降解奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] ALORI E T， GLICK B R， BABALOLA O O. Microbial phosphorus solubilization and its potential for use in sustainable agriculture[J]. Frontiers in Microbiology， 2017， 8： 971.

[2] INGLE K P， PADOLE D A. Phosphate solubilizing microbes： an overview[J]. International Journal of Current Microbiology and Applied Science， 2017， 6（1）： 844-852.

[3] KIHARA J， NJOROGE S. Phosphorus agronomic efficiency in maize-based cropping systems： a focus on western Kenya[J]. Field Crops Research， 2013， 150： 1-8.

[4] KANG J， AMOOZEGAR A， HESTERBERG D， et al. Phosphorus leaching in a sandy soil as affected by organic and inorganic fertilizer sources[J]. Geoderma， 2011， 161（3/4）： 194-201.

[5] 魏欣. 中國(guó)農(nóng)業(yè)面源污染管控研究[M]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2015.

[6] 陳娟， 王治業(yè)， 杜津昊， 等. 當(dāng)歸根系土壤有機(jī)磷降解菌的分離鑒定及其生長(zhǎng)特性的研究[J]. 中國(guó)釀造， 2018， 37（9）： 78-82.

[7] 李險(xiǎn)峰， 郭昭濱. 黑土區(qū)水土保持生態(tài)修復(fù)模式探討[J]. 防護(hù)林科技， 2018（7）： 83-84.

[8] 鄭金玲. 國(guó)家農(nóng)發(fā)水保項(xiàng)目東北黑土區(qū)水土流失綜合治理初探[J]. 科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新， 2017（35）： 94-95.

[9] BABALOLA O O， GLICK B R. Indigenous African agriculture and plant associated microbes：current practice and future transgenic prospects[J]. Science Research and Essays， 2012， 7（28）： 2431-2439.

[10] 張黎麗， 張閣， 王欣藝， 等. 土壤中降解有機(jī)磷微生物的篩選[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2019， 50（5）： 774-777.

[11] SUZUKI M T， PARROT D， BERG G， et al. Lichens as natural sources of biotechnologically relevant bacteria[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2016， 100（2）： 583-595.

[12] 白云鵬， 程歡， 許建和. 有機(jī)磷水解酶的挖掘、改造及應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)報(bào)， 2017， 57（8）： 1168-1179.

[13] KALANETRA K M， HUSTON S L， NELSON D C. Novel， attached， sulfur-oxidizing bacteria at shallow hydrothermal vents possess vacuoles not involved in respiratory nitrate accumulation[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2004， 70（12）： 7487-7496.

[14] 徐丹丹， 趙邯鄲， 王秀然， 等. 兩種測(cè)定植酸酶酶活的方法比較及發(fā)酵條件研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2019， 58（12）： 134-137.

[15] 王歡， 王敬敬， 徐松， 等. 有機(jī)磷降解菌的篩選及其促生特性[J]. 微生物學(xué)報(bào)， 2017， 57（5）： 667-680.

[16] 蘇輝蘭， 莫雪雪， 余炳鋒， 等. 貢柑果園高效解磷菌的篩選及其解磷條件優(yōu)化[J]. 北方園藝， 2019（5）： 101-107.

[17] 杜慧慧， 朱芙蓉， 楊敏， 等. 不同生境滇重樓根際解磷菌的篩選與鑒定[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2021， 46（4）： 915-922.

[18] 滕澤棟， 李敏， 朱靜， 等. 解磷微生物對(duì)土壤磷資源利用影響的研究進(jìn)展[J]. 土壤通報(bào)， 2017， 48（1）： 229-235.

[19] 賈麗娟， 唐凱， 高曉丹， 等. 庫布齊沙地生物土壤結(jié)皮中解磷菌的分離鑒定及解磷能力[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)， 2018， 24（2）： 390-394.

[20] 楊鴻儒. 西鄂爾多斯荒漠灌木根際細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的研究[D]. 呼和浩特： 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2016.

[21] 鞏瑞紅， 王小兵， 趙吉睿， 等. 荒漠草原植物根際溶磷細(xì)菌的分離鑒定及其溶磷能力的比較[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技， 2014（4）： 6-9， 81.

[22] JORQUERA M A， HERNNDEZ M T， RENGEL Z， et al. Isolation of culturable phosphobacteria with both phytate-mineralization and phosphate-solubilization activity from? ?Biology and Fertility of Soils， 2008， 44（8）： 1025-1034.

[23] BEHERA B C， YADAV H， SINGH S K， et al. Phosphate solubilization and acid phosphatase activity of Serratia sp. isolated from mangrove soil of Mahanadi river delta， Odisha， India[J]. Journal， Genetic Engineering & Biotechnology， 2017， 15（1）： 169-178.

[24] 上官亦卿， 常帆， 呂睿， 等. 解磷菌的分離、篩選、鑒定及解磷能力研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2019， 58（1）： 30-34， 38.