杜瑤 陳瑞 朱高峰 張吉泉 湯磊

中圖分類(lèi)號(hào) R917;R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）17-2059-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.17.03

摘 要 目的：考察新型降糖化合物L(fēng)SM-13在大鼠肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性，并分析其可能的代謝產(chǎn)物。方法：將LSM-13溶解于由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸啟動(dòng)的大鼠肝微粒體孵育體系中，置于37 ℃水浴中進(jìn)行孵育，分別于孵育0、5、10、15、20、30、45、60 min時(shí)用乙腈終止反應(yīng)。以吲哚美辛為內(nèi)標(biāo)，采用高效液相色譜法測(cè)定孵育體系中LSM-13的質(zhì)量濃度。以孵育0 min時(shí)LSM-13的質(zhì)量濃度為參照，計(jì)算其在不同孵育時(shí)間下的剩余百分比和酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法檢測(cè)并定性分析LSM-13在大鼠肝微粒體中的代謝產(chǎn)物。結(jié)果：孵育60 min時(shí)，LSM-13在大鼠肝微粒體中的剩余百分比為（56.07±0.95）%，半衰期為42.78 min，固有清除率為0.032 4 mL/（min·mg）。與大鼠肝微粒體空白樣品的總離子流圖比較，孵育60 min樣品中新增了3個(gè)色譜峰，對(duì)應(yīng)的準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z 505.133 8、417.102 4、293.111 7[M+H]+，可能是LSM-13脫氫、O-脫芐基、水解的產(chǎn)物。結(jié)論：化合物L(fēng)SM-13在大鼠肝微粒體中的穩(wěn)定性為中等，并可能發(fā)生了脫氫、O-脫芐基和水解反應(yīng)。

關(guān)鍵詞 降糖化合物;LSM-13;大鼠肝微粒體;穩(wěn)定性;代謝產(chǎn)物

Stability Study of Novel Hypoglycemic Compound LSM-13 in Rat Liver Microsomes and Its Metabolites Analysis

DU Yao1，CHEN Rui2，ZHU Gaofeng2，ZHANG Jiquan1，2，TANG Lei2（ 1. College of Pharmacy，Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China; 2. Guizhou Provincial Engineering Technology Research Center for Chemical Drug R&D， Guiyang 550004， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the metabolism stabilities of novel hypoglycemic compound LSM-13 in rat liver microsomes， and to analyze the possible metabolites. METHODS： LSM-13 was dissolved in rat liver microsome incubation system initiated by reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， and was incubated in water at 37 ℃. The reaction was terminated with acetonitrile at 0，5，10，15，30，45 and 60 min， respectively. Using indomethacin as internal standard， the concentration of LSM-13 in incubation system was determined by HPLC. The residual percentage and enzyme kinetic parameters of LSM-13 were calculated at different incubation time points with the concentration of LSM-13 incubated for 0 min as reference. UPLC-Q-TOF/MS was used to analyze and speculate the metabolites of LSM-13 in rat liver microsomes. RESULTS： After 60 min incubation， the remaining percentage of LSM-13 was （56.07±0.95）%， the half-life was 42.78 min， and the intrinsic clearance was 0.032 4? ? ? ?mL/（min·mg）. Compared with total ion flow diagram of rat liver microsome blank samples， three chromatographic peaks were added in the samples incubated for 60 min; the corresponding molecular ion peaks were m/z 505.133 8， 417.102 4， 293.111 7

[M+H]+; the possible metabolites may be dehydrogenation， O-debentylation and hydrolysis products of LSM-13. CONCLUSIONS： The compound LSM-13 has moderate stability in rat liver microsomes， and may undergo dehydrogenation， O-debentylation and hydrolysis.

KEYWORDS? ?Hypoglycemic compound; LSM-13; Rat liver microsomes; Stability; Metabolites

近年來(lái)，新型降糖藥物的研究與開(kāi)發(fā)已成為創(chuàng)新藥物研究的熱點(diǎn)。腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）是治療2型糖尿病的一個(gè)重要靶點(diǎn)[1-2]。該激酶是機(jī)體的能量感受器與代謝調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)中心，可通過(guò)激活下游關(guān)鍵蛋白的磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)糖脂的代謝平衡[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，激活A(yù)MPK不僅能降低患者的血糖水平，而且還對(duì)糖尿病并發(fā)癥（如糖尿病腎病、糖尿病心血管疾病等）具有潛在的治療作用[3]。目前，臨床上使用的2型糖尿病一線治療藥物二甲雙胍和噻唑烷二酮類(lèi)藥物吡格列酮等均被證實(shí)為AMPK間接激動(dòng)劑，雖有很好的降糖作用，但對(duì)糖尿病并發(fā)癥的治療效果有限[4-5]，加之迄今仍未有更具特異性的AMPK直接激動(dòng)劑上市，因此研發(fā)新型、高效的AMPK直接激動(dòng)劑具有重要的臨床意義。

ZG02的化學(xué)名為6-芐氧基-9-（4-氯苯甲?；?四氫咔唑-3-羧酸（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1A），是一個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的四氫咔唑類(lèi)降糖化合物，可通過(guò)激活A(yù)MPK通路來(lái)降低db/db小鼠的血糖與血脂水平[6]。本課題組前期利用ACD/Labs軟件對(duì)該化合物進(jìn)行初步類(lèi)藥性評(píng)估，發(fā)現(xiàn)其具有較高的計(jì)算模擬值（CLogP=5.75），但體內(nèi)代謝不穩(wěn)定。為了進(jìn)一步尋找藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)更佳且降糖活性更優(yōu)的AMPK直接激動(dòng)劑，本課題組前期以ZG02為先導(dǎo)化合物設(shè)計(jì)合成了一系列衍生物，并通過(guò)葡萄糖消耗模型篩選發(fā)現(xiàn)LSM-13{化學(xué)名為8-（芐氧基）-5-（4-氯苯甲?；?7-氟-1，3，4，5-四氫-2H-吡啶并[4，3-b]吲哚-2-羧酸乙酯，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1B}能顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗，促葡萄糖消耗率達(dá)44.78%，顯著高于ZG02（P<0.05）;同時(shí)，在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了LSM-13具有很好的降糖活性。可見(jiàn)，LSM-13作為一個(gè)潛在的AMPK直接激動(dòng)劑，具有進(jìn)一步研發(fā)的價(jià)值。

新藥從發(fā)現(xiàn)到上市需要經(jīng)過(guò)臨床前研究、臨床試驗(yàn)、報(bào)批和上市等4個(gè)階段，其中藥物代謝研究對(duì)前兩個(gè)階段具有重要的指導(dǎo)意義[7]。藥物經(jīng)過(guò)代謝可能使其活性喪失或者生成具有毒性的代謝產(chǎn)物，將直接影響藥物的有效性與安全性[8]。肝臟含有豐富的藥物代謝酶系統(tǒng)，是藥物代謝和生物轉(zhuǎn)化的主要器官，因此探討藥物在肝臟中的穩(wěn)定性及代謝情況顯得尤為重要[9]。本研究采用體外肝微粒體溫育法，以高效液相色譜法（HPLC）考察LSM-13在SD大鼠肝微粒體中的穩(wěn)定性;采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC-Q- TOF/MS）并根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜中的碎片離子信息推測(cè)LSM-13在肝微粒體中的可能代謝產(chǎn)物，旨在初步探討該化合物在肝微粒體中的代謝規(guī)律，為后續(xù)LSM-13的體內(nèi)代謝研究以及臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括：e2695型HPLC儀、? ? XevoG2-XS型UPLC-Q-TOF/MS儀（美國(guó)Waters公司），JN300-2型氮?dú)獯祾邇x（蘇州吉米諾儀器有限公司），AUW220D型電子天平（日本Shimadzu公司），X1型高速離心機(jī)（香港基因有限公司），HC-100型恒溫混勻儀（杭州佑寧儀器有限公司），DRHH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

LSM-13原料藥（批號(hào)20201123，純度>99%）由本課題組合成;吲哚美辛對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)J0526A5，純度>98%）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二鈉（NADP-Na2，批號(hào)1011L024）、葡萄糖-6-磷酸-二鈉（G-6-P-Na2，批號(hào)407H033）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-P-DH，批號(hào)20180725）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;甲醇、乙腈為色譜純;氯化鎂、檸檬酸鈉等其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 大鼠肝微粒體

雄性SD大鼠肝微粒體（批號(hào)MIC254034）購(gòu)自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 LSM-13定量分析的HPLC條件

以Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以Waters Symmetry C18 VanGuard Cartidge（5 mm×3.9 mm，5 μm）為保護(hù)柱，以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～6 min，75%A;6～7.5 min，75%A→90%A;7.5～13.5 min，90%A;13.5～15 min，90%A→75%A;15～16 min，75%A）;檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm;流速為1 mL/min;柱溫為35 ℃;進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 代謝產(chǎn)物定性分析的UPLC-Q-TOF/MS條件

以Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）為色譜柱，以0.01%甲酸溶液（A）-0.01%甲酸乙腈溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～1 min，95%A;1～5 min，95%A→60%A;5～10 min，60%A→40%A;10～17 min，40%A→2%A;17～18 min，2%A;18～19 min，2%A→95%A;19～20 min，95%A）;流速為0.30 mL/min;柱溫為35 ℃;進(jìn)樣量為5 μL;采集時(shí)間為20 min。離子源為電噴霧離子源（ESI）;掃描模式為正離子模式;毛細(xì)管電壓為1.5 kV;離子源溫度為120 ℃;脫溶劑氣溫度為400 ℃;脫溶劑氣流量為800 L/h;錐孔氣流量為50 L/h;掃描模式為“MSE continuum”模式;掃描范圍為m/z 50～1 200;碰撞能量為20～40 V。

2.3 溶液的制備

2.3.1 LSM-13與內(nèi)標(biāo)貯備液 精密稱(chēng)取LSM-13原料藥適量，以乙腈溶解并定容，混勻，制得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的LSM-13貯備液;精密稱(chēng)取內(nèi)標(biāo)對(duì)照品適量，同法制得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液。兩者均于4 ℃保存，備用。臨用前，取內(nèi)標(biāo)貯備液適量，以甲醇稀釋至質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL，備用。

2.3.2 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）輔酶溶液 分別稱(chēng)取NADP-Na2 200 mg、G-6-P-Na2 200 mg、氯化鎂133 mg，加水溶解并定容至10 mL，混勻，得A液;分別稱(chēng)取檸檬酸鈉44 mg、G-6-P-DH 1 000 U（相當(dāng)于1.36 mg），加水溶解并定容至25 mL，混勻，得B液。兩者均于-20 ℃下保存，備用。臨用前，將A、B液按體積比5 ∶ 1混合，得濃度為1 mmol/L（按反應(yīng)產(chǎn)物NADPH計(jì)）的輔酶溶液[10]。

2.4 樣品的孵育與處理

2.4.1 孵育體系的建立 取大鼠肝微粒體，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋至5 mg/mL;取上述肝微粒體溶液20 μL，加入“2.3.1”項(xiàng)下的LSM-13貯備液2 μL和Tris-HCl緩沖液148 μL。將上述混合溶液置于37 ℃水浴鍋中孵育5 min后，加入“2.3.2”項(xiàng)下的NADPH輔酶溶液30 μL以啟動(dòng)反應(yīng)。該孵育體系的總體積為200 μL，其中LSM-13的質(zhì)量濃度為5 μg/mL，NADPH的終濃度為1 mmol/L，有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)不超過(guò)1%[11]。

2.4.2 樣品孵育與處理 將上述孵育體系繼續(xù)置于37 ℃水浴鍋中，分別在孵育0、5、10、15、20、30、45、60 min時(shí)加入含0.5 μg/mL內(nèi)標(biāo)的乙腈800 μL（溫度4 ℃）以終止反應(yīng)。將上述混合物渦旋混勻1 min后，于4 ℃下以13 000 r/min高速離心10 min，收集上清液以氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)靡译?00 μL復(fù)溶，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的孵育樣品平行3份操作。

2.5 生物樣品中LSM-13的定量分析方法學(xué)考察

2.5.1 專(zhuān)屬性考察 分別取適量空白溶劑（乙腈）、LSM-13+內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液（分別含LSM-13和內(nèi)標(biāo)5、2? ? ? ?μg/mL，按“2.3.1”項(xiàng)下方法以乙腈配制）、空白孵育樣品（不含待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)，按“2.4.2”項(xiàng)下方法孵育15 min制得）、在大鼠肝微粒體孵育體系中孵育15 min時(shí)的孵育樣品（按“2.4.2”項(xiàng)下方法孵育并處理所得），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（圖2）。結(jié)果，化合物L(fēng)SM-13的保留時(shí)間約為13.4 min，內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間約為7.1 min;兩者可同時(shí)被檢出且互不干擾，同時(shí)不受內(nèi)源性物質(zhì)的影響，提示該方法專(zhuān)屬性良好。

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.3.1”項(xiàng)下的LSM-13貯備液適量，加至經(jīng)高溫滅活的大鼠肝微粒體孵育體系中，制得質(zhì)量濃度為0.5、1、2、5、10、20、40 μg/mL的LSM-13系列工作溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下方法孵育15 min并處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以LSM-13質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、LSM-13與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（y）作線性回歸，得回歸方程為y=0.997 1x-0.526 6（R2=0.999 1）。結(jié)果，LSM-13檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.5～40 μg/mL，定量下限為0.5 μg/mL。

2.5.3 基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率試驗(yàn) 精密量取“2.3.1”項(xiàng)下的LSM-13貯備液適量，加入乙腈稀釋?zhuān)频玫?、中、高質(zhì)量濃度（1、5、30 μg/mL）待測(cè)樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下方法孵育15 min并處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄LSM-13與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（A1）;取未加藥的滅活的肝微粒體適量，按“2.4.2”項(xiàng)下方法孵育15 min并處理，隨后加入“2.3.1”項(xiàng)下LSM-13貯備液適量，使最終質(zhì)量濃度與上述待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄LSM-13與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（A2）;精密量取“2.3.1”項(xiàng)下的LSM-13貯備液適量，加至滅活的大鼠肝微粒體孵育體系中，配制成與上述待測(cè)樣品質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的質(zhì)控（QC）樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下方法孵育15 min并處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄LSM-13與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（A3）。每個(gè)質(zhì)量濃度平行5份操作。按以下公式計(jì)算：基質(zhì)效應(yīng)=（A2/A1）×100%;提取回收率=（A3/A2）×100%。結(jié)果，提取方法和基質(zhì)效應(yīng)均不會(huì)影響LSM-13質(zhì)量濃度的測(cè)定，詳見(jiàn)表1。

2.5.4 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn) 精密量取“2.3.1”項(xiàng)下的LSM-13貯備液適量，加至滅活的大鼠肝微粒體孵育體系中，制得LSM-13定量下限質(zhì)量濃度（0.5 μg/mL）和低、中、高質(zhì)量濃度（1、5、30 μg/mL）的QC樣品，均平行5份操作。各樣品按“2.4.2”項(xiàng)下方法孵育15 min并處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣3次，考察日內(nèi)精密度;連續(xù)進(jìn)樣3 d，考察日間精密度。將實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，考察準(zhǔn)確度。結(jié)果，定量下限質(zhì)量濃度和低、中、高質(zhì)量濃度QC樣品的日內(nèi)、日間RSD均小于5%，準(zhǔn)確度（以平均值計(jì)）為94.30%～110.08%，符合生物樣品定量分析的要求[12]。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取“2.3.1”項(xiàng)下的LSM-13貯備液適量，加至滅活的大鼠肝微粒體孵育體系中，制得LSM-13低、中、高質(zhì)量濃度（1、5、30 μg/mL）的QC樣品，均平行5份操作。各樣品按“2.4.2”項(xiàng)下方法孵育15 min并處理，處理后的樣品分別于室溫放置12 h、4 ℃放置24 h、反復(fù)凍融3次（-80 ℃～室溫）后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，考察樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果，在上述條件下，各樣品實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度的RSD均小于5%，表明樣品的穩(wěn)定性良好，詳見(jiàn)表3。

2.6 LSM-13在SD大鼠肝微粒體中的穩(wěn)定性考察

按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行體外代謝穩(wěn)定性研究，采用底物消除法[9]考察LSM-13的代謝情況。將孵育0 min時(shí)LSM-13的質(zhì)量濃度記為100%，計(jì)算不同孵育時(shí)間點(diǎn)LSM-13在大鼠肝微粒體中的剩余百分比。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行3次操作，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，在大鼠肝微粒體中孵育60 min后，LSM-13的剩余百分比為（56.07±0.95）%。

將各孵育時(shí)間點(diǎn)LSM-13的平均剩余百分比的自然對(duì)數(shù)對(duì)孵育時(shí)間作線性回歸，求得斜率k;根據(jù)k可計(jì)算出LSM-13在大鼠肝微粒體中的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)[半衰期（t1/2）與固有清除率（CLint）]。其中，t1/2=-0.693/k，CLint=[0.693/t1/2×孵育液體積（mL）]/肝微粒體質(zhì)量（mg）[10]。結(jié)果，LSM-13的t1/2為42.78 min，CLint為0.032 4 mL/（min·mg）。肝微粒體代謝穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下：t1/2<30 min，表明受試化合物不穩(wěn)定;t1/2為30～90 min，表明受試化合物穩(wěn)定性為中等;t1/2>90 min，表明受試化合物穩(wěn)定[10]。由此可見(jiàn)，LSM-13在大鼠肝微粒體中具有中等穩(wěn)定性。

2.7 LSM-13代謝產(chǎn)物的定性分析

收集“2.6”項(xiàng)下孵育60 min時(shí)的肝微粒體孵育樣品與空白孵育樣品（空白大鼠肝微粒體同“2.4”項(xiàng)下方法孵育60 min所得）。由于代謝產(chǎn)物濃度可能較低，故將收集的樣品適當(dāng)濃縮，然后再按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析。通過(guò)比較空白孵育樣品與孵育60 min樣品的總離子流圖（圖3），發(fā)現(xiàn)新的色譜峰;再根據(jù)各色譜峰的準(zhǔn)分子離子及碎片離子信息，推測(cè)LSM-13代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。

2.7.1 代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn) 比較空白孵育樣品與孵育60 min樣品的總離子流圖，發(fā)現(xiàn)在14.06、12.69、9.93、6.15 min處出現(xiàn)4個(gè)色譜峰（M0～M3），其m/z依次為507.150 2、505.133 8、417.102 4、293.111 7（圖4）。其中，m/z 507.150 2[M+H]+為L(zhǎng)SM-13的準(zhǔn)分子離子峰（M0），其余3個(gè)（M1～M3）則是LSM-13在大鼠肝微粒體中的代謝產(chǎn)物峰。

2.7.2 LSM-13質(zhì)譜裂解規(guī)律 LSM-13的分子式為C28H24ClFN2O4，分子量為506.140 9，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 507.150 2[M+H]+。LSM-13的主要二級(jí)碎片離子峰有 m/z 138.998 4、280.118 7、418.107 8、461.114 9[M+H]+等，提示其結(jié)構(gòu)中的芐氧基、乙氧基和對(duì)氯苯甲?；赡軙?huì)在質(zhì)譜碰撞能量的作用下發(fā)生斷裂。LSM-13的二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解規(guī)律見(jiàn)圖5。

2.7.3 代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析 本研究對(duì)代謝產(chǎn)物M1、M2、M3的可能結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析。

（1）代謝產(chǎn)物M1：該化合物的保留時(shí)間為12.69 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 505.133 8[M+H]+，與LSM-13相比質(zhì)量減少了2，推測(cè)該代謝產(chǎn)物與原型化合物相比減少了2個(gè)H，可能為L(zhǎng)SM-13的脫氫產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)式可能為C28H22ClFN2O4。M1的主要碎片離子峰有m/z 477.098 3、138.996 4[M+H]+等，提示其脫氫位置可能在LSM-13的吡啶并[4，3-b]吲哚環(huán)上;此外，m/z 477.098 3[M+H]+碎片離子與M1相比質(zhì)量減少了28，提示可能是其在質(zhì)譜碰撞能量的作用下掉了1個(gè)乙基，M1上可能存在乙基。M1的二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解規(guī)律見(jiàn)圖6。

（2）代謝產(chǎn)物M2：該化合物的保留時(shí)間為9.93 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 417.102 4[M+H]+，與LSM-13相比質(zhì)量減少了90，推測(cè)該代謝產(chǎn)物與原型化合物相比減少了1個(gè)芐基，可能為L(zhǎng)SM-13的O-脫芐基產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)式可能為C21H18ClFN2O4。M2的主要碎片離子峰有m/z 138.997 8、277.099 1、371.060 5[M+H]+等，提示其結(jié)構(gòu)中的碳氮鍵、碳氧鍵可能會(huì)在質(zhì)譜碰撞能量的作用下發(fā)生斷裂。M2的二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解規(guī)律見(jiàn)圖7。

（3）代謝產(chǎn)物M3：該化合物的保留時(shí)間為6.15 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 293.111 7[M+H]+，與LSM-13相比質(zhì)量減少了214，提示可能為L(zhǎng)SM-13的2個(gè)酰胺鍵水解加四氫咔唑環(huán)2次脫氫的產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)式可能為C18H13FN2O。M3的主要二級(jí)碎片離子為m/z 202.056 9[M+H]+，與M3相比質(zhì)量減少了91，提示可能是結(jié)構(gòu)中的碳氧鍵在質(zhì)譜碰撞能量的作用下發(fā)生了斷裂。M3的二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解規(guī)律見(jiàn)圖8。

3 討論

與體內(nèi)代謝研究相比，體外代謝研究可排除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，具有簡(jiǎn)單快速、結(jié)果重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，有助于直接觀察藥物的代謝特征，適用于體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化率低的成分以及候選化合物的早期代謝研究及篩選[13-14]。為此，本研究采用體外肝微粒體溫育法，考察了LSM-13在大鼠肝微粒體中的穩(wěn)定性及代謝情況。

在體外代謝研究中，藥物濃度會(huì)影響酶代謝穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)：若藥物濃度過(guò)低，則可能在很短時(shí)間內(nèi)被代謝完全，不便于檢測(cè);若藥物濃度過(guò)高，則代謝酶將達(dá)飽和狀態(tài)，無(wú)法反映真實(shí)的代謝狀態(tài)[15-16]。因此，本實(shí)驗(yàn)前期考察了LSM-13在1、5、10 μg/mL等3個(gè)質(zhì)量濃度條件下的代謝情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為5 μg/mL時(shí)，LSM-13在孵育60 min時(shí)能達(dá)到底物20%的清除率，故確定5 μg/mL為最終試驗(yàn)質(zhì)量濃度。

本研究借助HPLC法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LSM-13在大鼠肝微粒體孵育體系中反應(yīng)60 min后，剩余百分比為（56.07±0.95）%，t1/2為42.78 min，CLint為0.032 4 mL/（min·mg），表明LSM-13在體外大鼠肝微粒體孵育體系中的穩(wěn)定性為中等。此外，本研究利用UPLC-Q-TOF/MS檢測(cè)以及二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子信息分析，初步推測(cè)了3個(gè)代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)LSM-13在肝微粒體代謝酶的作用下主要發(fā)生了脫氫、O-脫芐基、水解反應(yīng)。

綜上所述，本研究建立了定量分析大鼠肝微粒體中LSM-13的HPLC法，并初步明確了LSM-13在大鼠肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性為中等;同時(shí)，利用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)，通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子信息初步推測(cè)了LSM-13在大鼠肝微粒體中的Ⅰ相代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，為L(zhǎng)SM-13后期的藥動(dòng)學(xué)研究及結(jié)構(gòu)改造提供了一定的參考依據(jù)。

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（收稿日期：2021-03-17 修回日期：2021-07-26）

（編輯：張?jiān)拢?/p>