曾娜

【摘要】目的：分析益氣養(yǎng)陰活血法對(duì)自發(fā)性2型糖尿病心肌病變（Diabetic cardiomyopathy， DCM）大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。方法：選擇由本院自養(yǎng)新生純種大鼠60只。隨機(jī)分為模型組（對(duì)照組、觀察組）和正常組，使用鏈脲佐菌素（Streptozotocin， STZ）誘導(dǎo)建立模型，觀察組第4周齡使用益氣養(yǎng)陰活血復(fù)方治療，對(duì)照組無(wú)治療。對(duì)比不同大鼠一般情況，心肌細(xì)胞凋亡及增殖情況。結(jié)果：模型組大鼠均建模成功，血糖均≥16.67 mmol/L，在建模一周后出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象，體重減輕，無(wú)活動(dòng)，給藥觀察組上述情況均有所改善。對(duì)照組心肌對(duì)位結(jié)構(gòu)，肌原纖維，線粒體均異常改變；觀察組心肌肌節(jié)、肌源纖維、線粒體基本正常。心臟重量指數(shù)、血糖從高到底依次為對(duì)照組>觀察組>正常組，體重為正常組>觀察組>對(duì)照組（P<0.05），對(duì)照組大鼠Fas、FasL、Bax、凋亡細(xì)胞明顯高于正常組和觀察組，Bcl-2、Bcl-2/Bax值則低于其他組（P<0.05）；觀察組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于正常組與對(duì)照組，凋亡細(xì)胞情況高于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論：益氣養(yǎng)陰活血法可降低自發(fā)性2型DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況，增強(qiáng)其細(xì)胞增殖活性，并改善心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

【關(guān)鍵詞】益氣養(yǎng)陰活血法；自發(fā)性2型DCM大鼠；心肌細(xì)胞凋亡；影響

[中圖分類(lèi)號(hào)]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2096-5249（2021）05-0010-02

糖尿病心肌病變（Diabetic cardiomyopathy， DCM）則為糖尿病患者常見(jiàn)的并發(fā)癥之一[1]。最早在1983年時(shí)Tahini等人發(fā)現(xiàn)使用鏈脲佐菌素（Streptozotocin， STZ）誘導(dǎo)糖尿病大鼠后，其心肌功能在第6～14周出現(xiàn)改變，后在梁自文等實(shí)驗(yàn)中也在證明糖尿病與心肌病變之間存在直接聯(lián)系[2-3]。糖尿病可引起心臟微血管病變出現(xiàn)心肌代謝紊亂，最終導(dǎo)致心肌廣泛局灶性壞死，在早期?？梢?jiàn)患者心肌順應(yīng)性下降舒張期充盈受阻為主的舒張功能不全現(xiàn)象。本文使用STZ誘導(dǎo)建立DCM大鼠模型，旨在研究益氣養(yǎng)陰活血法對(duì)自發(fā)性2型DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，為臨床診治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇由本院自養(yǎng)新生純種大鼠60只。隨機(jī)將其分為模型組（對(duì)照組和觀察組）。模型建立：對(duì)照組20只，觀察組20只，另設(shè)置正常組20只。對(duì)照組和觀察組在出生后24 h內(nèi)使用腹腔注射由美國(guó)Sigma公司所提供的STZ（90 mg/kg），并在第6 d后再次注射STZ（45 mg/ kg）；正常組則注射相同劑量的枸櫞酸鈉緩沖液。所有大鼠均在注射后6周檢測(cè)大鼠糖耐量、血清胰島素情況。大鼠空腹血糖有輕度升高，在糖耐量檢測(cè)中1 h血糖超過(guò)16.65 mmol/L、血清胰島素表現(xiàn)為相對(duì)不足則表示成功建模。觀察組大鼠則在大鼠第4周齡使用益氣養(yǎng)陰活血復(fù)方（組成藥物人參、麥冬、五味子、丹參、檀香等藥物），用水煎呈1 mL藥液含2 g生藥的200 %濃度藥液，每100 g體重給予0.8 mg，每天進(jìn)行一次治療，對(duì)照組大鼠則不給予治療。在飼養(yǎng)到16周齡時(shí)處死。

1.2方法 ①大鼠一般情況觀察：在實(shí)驗(yàn)期間需要觀察大鼠飲水、排尿、精神、活動(dòng)等一般情況，在處死前禁食后12 h稱量大鼠體重以及空腹血糖情況。②大鼠心肌細(xì)胞情況觀察：將大鼠處死，采血后取出心臟，使用冰生理鹽水將包膜、血管清洗干凈，稱重大鼠心臟重量，與大鼠體重的比值為其心臟腫重量指數(shù)。隨后后取大鼠左心室前壁的心臟組織經(jīng)處理后使用透射電鏡觀察。并組化染色檢測(cè)心肌細(xì)胞中死亡因子（FasL）、死亡因子受體（Fas）、Bax蛋白、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）、增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen， PCNA）蛋白表達(dá)情況。Fas、FasL、Bax、Bcl-2細(xì)胞漿內(nèi)為棕黃色（或是棕褐色）的片狀表達(dá)，病理圖像分析使用MIPS系統(tǒng)分析。在高倍鏡（×400）下測(cè)定細(xì)胞陽(yáng)性的平均灰度值；PCNA在細(xì)胞核中為棕褐色表達(dá)，隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)并選取平均值。

心肌細(xì)胞凋亡原位標(biāo)記檢測(cè)，在標(biāo)本制片，使用水和多聚甲醛（4%）進(jìn)行浸泡，實(shí)踐為15 min，再使用蛋白酶K進(jìn)行消化，時(shí)間為12 min，隨后使用多聚甲醛（5 min）、平衡緩沖液10 min，標(biāo)記液2 h使用3 %的過(guò)氧化氫浸泡4 min，最后鏈霉親和素浸泡，時(shí)間為20 min。使用顯微鏡觀察，在隨機(jī)5個(gè)高倍鏡視野下技術(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)并取其平均值。細(xì)胞凋亡：DAB著色細(xì)胞核表現(xiàn)為棕黃色則代表凋亡細(xì)胞。

1.3觀察指標(biāo) 對(duì)比不同大鼠的一般情況（心臟重量指數(shù)、體重、血糖、心肌超微結(jié)構(gòu)改變情況等）心肌細(xì)胞凋亡及增殖情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件包進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（_ x±s）表示，多組間比較使用方差檢驗(yàn)，事后兩兩比較采用SNK-q；計(jì)數(shù)資料采用率或百分百進(jìn)行描述，進(jìn)行c2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1三組大鼠一般情況比較 正常組大鼠一般情況正常；模型組大鼠均建模成功，側(cè)血糖均≥16.67 mmol/L，均存活至16周，在建模一周后大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象，體重減輕，活動(dòng)能力下降，皮膚有破損或出血現(xiàn)象，給藥觀察組則上述情況均有所改善。

心肌超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠心肌情況基本正常；模型組：①對(duì)照組大鼠心肌結(jié)構(gòu)改變，對(duì)位錯(cuò)亂，出現(xiàn)有過(guò)度收縮，肌原纖維部分溶解，線粒體可見(jiàn)腫脹明顯，可嵴斷裂溶解和小空泡；②觀察組大鼠心肌肌節(jié)對(duì)有少部分出現(xiàn)錯(cuò)位，其他情況基本正常。

心臟重量指數(shù)、血糖從高到底依次為對(duì)照組>觀察組>正常組，體重從高到底依次為正常組>觀察組>對(duì)照組，三組之間比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見(jiàn)表1。

2.2模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡與增殖情況比較 對(duì)照組大鼠Fas、FasL、Bax、凋亡細(xì)胞明顯高于正常組和觀察組，Bcl-2、Bcl-2/Bax值則低于正常組和觀察組（P<0.05）；觀察組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于正常組與對(duì)照組，凋亡細(xì)胞情況明顯低于對(duì)照組（P<0.05），詳見(jiàn)表2。

3 討論

DCM發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，中醫(yī)治療藥物以整體性、辯證論治為特色，對(duì)于糖尿病以及其并發(fā)癥防治中有著較為明顯的優(yōu)勢(shì)。DCM在中醫(yī)中屬于“心悸”、“消竭”、“胸痹”、“心痛”、“胸痛”等范疇，血瘀、氣虛為其主要病機(jī)。以往有文獻(xiàn)研究證明使用益氣養(yǎng)陰活血法對(duì)于DCM治療有較好的臨床使用效果，可通過(guò)多通路、多靶點(diǎn)減輕心肌纖維化情況，從而達(dá)到延緩高血糖大鼠出現(xiàn)DCM[4]。在本文研究中使用益氣養(yǎng)陰活血法方劑中包括人參、麥冬、五味子、丹參、檀香等藥物中，人參藥理研究中發(fā)現(xiàn)，其可調(diào)節(jié)血脂、控制血壓、減輕患者體重改善患者凝血功能從而達(dá)到調(diào)整糖尿病患者機(jī)體代謝紊亂裝狀況。藥單體有抑制TGF-β1分泌，減少心肌細(xì)胞凋亡延緩心肌細(xì)胞纖維化作用。麥冬中皂苷、多糖、黃酮等有效成分，可起到降血糖、抗氧化等作用從而產(chǎn)生對(duì)心肌的保護(hù)。五味子藥理學(xué)研究證明可降血糖、血壓同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體免疫力。丹參則有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、養(yǎng)血安神等過(guò)作用，檀香具有消腫、止血、定痛的作用研究表明，檀香與丹參相配可增加丹參的吸收入血，使其作用持久。

在本文研究中發(fā)現(xiàn)在16周后DCM大鼠模有典型的糖尿病心肌病變，大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況也明顯高于其他兩組，與以往文獻(xiàn)研究結(jié)果相符[5]。而在使用益氣養(yǎng)陰活血復(fù)方治療的觀察組大鼠中，心肌肌節(jié)對(duì)位基本正常，有少部分出現(xiàn)錯(cuò)位，肌源纖維、線粒體基本正常。心臟重量指數(shù)、血糖從低于對(duì)照組，體重從高于對(duì)照組（P<0.05），與以往文獻(xiàn)研究結(jié)果相符[6]，提示使用益氣養(yǎng)陰活血復(fù)方可改善CDM大鼠體重、血糖、心肌細(xì)胞情況。以往文獻(xiàn)研究中均表明，F(xiàn)as、FasL和 Bax、Bcl-2、Bcl-2/Bax比值是細(xì)胞凋亡的重要影響因素[7]。在本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，使用益氣養(yǎng)陰活血復(fù)方治療后，降低了心肌細(xì)胞中促凋亡因子Fas、FasL和 Bax表達(dá)，Bcl-2/Bax比值則增加，且凋亡細(xì)胞明顯減少，提示益氣養(yǎng)陰活血復(fù)方可減少氧自由基生成，保護(hù)了抗氧自由基酶系統(tǒng)活性，起到調(diào)控凋亡因子的變化減少心肌細(xì)胞凋亡。PCNA直接參與了DNA復(fù)制，是細(xì)胞增殖活性的重要指標(biāo)。在本研究中對(duì)照組與正常組PCNA陽(yáng)性數(shù)比較并無(wú)明顯差異可能與本研究大鼠未出現(xiàn)心肌細(xì)胞異常增殖有關(guān)。而觀察組大鼠心肌PCNA陽(yáng)性比例明顯高于其他兩組提示此藥方可有啟動(dòng)心肌細(xì)胞的增殖作用，達(dá)到防治DCM的目的。

綜上所述，益氣養(yǎng)陰活血法可降低自發(fā)性2型DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況，增強(qiáng)其細(xì)胞增殖活性，并改善心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

參考文獻(xiàn)

[1] 李中南， 周媛媛， 邢宇婷， 等. 益氣養(yǎng)陰活血法對(duì)糖尿病大鼠腎臟Nrf2基因表達(dá)的影響[J]. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2018， 20（6）： P. 13-16.

[2] 張小紅， 鐘淙， 王芳， 等. α-硫辛酸聯(lián)合益氣養(yǎng)陰活血法對(duì)2型糖尿病周?chē)窠?jīng)病變患者相關(guān)因子的影響[J]. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2018， 24（21）： 36-40.

[3] 秦琦， 董波， 楊鶯. 益氣養(yǎng)陰通絡(luò)法通過(guò)JAK/STAT通路對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響[J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志， 2019， 17（11）： 1635-1637.

[4] 柴松波， 王振濤， 張淑娟， 等. 丹參酮ⅡA對(duì)擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌細(xì)胞凋亡及PI3K/Akt通路的影響[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志， 2019， 29（6）： 57-64.

[5] 秦琦， 李文杰， 王有雪， 等. 益氣養(yǎng)陰通絡(luò)法對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡Bax、Bcl-2、Caspase3表達(dá)的影響[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊， 2019， 37（6）： 1392-1395.

[6] 秦琦， 李文杰， 楊鶯， 等. 中藥對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡影響的Meta分析[J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志， 2018， 16（19）： 2766-2773.

[7] 劉穎， 張軍， 王順意， 等. 益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)2型糖尿病大鼠骨骼肌miR-24表達(dá)的影響[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥， 2018， 11（10）： 30-34.