馬愛玲，王漪檬，張偉，馬培志

(河南省人民醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003)

替考拉寧(teicoplanin)為游動(dòng)放線菌屬發(fā)酵產(chǎn)生的一種新型殺菌性糖肽類抗菌藥物，通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成來抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。替考拉寧是繼萬(wàn)古霉素之后的又一抗耐藥菌藥物，臨床可用于治療各種嚴(yán)重的革蘭陽(yáng)性菌感染，特別是對(duì)耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA)引起的感染有很好的療效，是目前臨床治療多重耐藥菌感染的重要抗生素[1]。近年來研究及臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，替考拉寧臨床應(yīng)用個(gè)體差異大，有效血藥濃度達(dá)標(biāo)率低，尤其是高齡老年、重癥患者等特殊人群，其病理生理的改變等因素導(dǎo)致藥物分布與清除發(fā)生變化，進(jìn)而影響血藥濃度及治療效果，監(jiān)測(cè)替考拉寧血藥濃度的必要性已被越來越多的研究所證實(shí)。因此，醫(yī)生在使用替考拉寧進(jìn)行治療時(shí)，需及時(shí)對(duì)替考拉寧的血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。替考拉寧由 10～11碳脂肪鏈組成，主要成分有5種，分別為TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5，其中以TA2-2為主，占總含量的40%以上，這些組分的極性和生物活性相似，為無定形粉末[2]。實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行替考拉寧血藥濃度監(jiān)測(cè)時(shí)，多以TA2-2為監(jiān)測(cè)目標(biāo)。文獻(xiàn)研究表明，患者的年齡、血漿蛋白水平及是否給予負(fù)荷劑量對(duì)替考拉寧血藥谷濃度影響較大，以上影響因素常單一或多個(gè)存在于患者個(gè)體中，使得按推薦的標(biāo)準(zhǔn)劑量給藥難以達(dá)到有效血藥濃度或超過不良反應(yīng)預(yù)警濃度，從而發(fā)生治療無效、誘發(fā)耐藥性或增加不良反應(yīng)的情況[3]。因此，推薦在臨床應(yīng)用中積極開展替考拉寧血藥濃度監(jiān)測(cè)，為醫(yī)生開具處方提供科學(xué)依據(jù)，也為患者的合理用藥提供有力保障。本研究采用全自動(dòng)二維液相色譜測(cè)定替考拉寧血藥濃度的方法，操作簡(jiǎn)便快速，結(jié)果準(zhǔn)確，自動(dòng)化程度高，適用于臨床工作中監(jiān)測(cè)替考拉寧的血藥濃度。

1 材料

1.1 儀器全自動(dòng)二維液相色譜(FLC-2701+LC-20A+SPD-20A)系統(tǒng)由全自動(dòng)二維液相色譜耦合儀FLC-2701(湖南德米特儀器有限公司)及島津液相色譜LC-20A部件構(gòu)成。SC-3610低速離心機(jī)(安徽中佳)；AUW120D電子天平(日本島津)；WH-866旋渦混合器。

1.2 藥品與試劑替考拉寧-1D移動(dòng)相；替考拉寧-2D移動(dòng)相；水為超純水；替考拉寧對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)130374-201002)；MPI-1(湖南德米特儀器有限公司)；空白馬血清(北京政博偉業(yè)生物科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件一維流動(dòng)相為替考拉寧-1D移動(dòng)相，二維流動(dòng)相為替考拉寧-2D移動(dòng)相，輔助試劑為超純水。流速：A泵為1.2 mL·min-1，B泵為2.0 mL·min-1，C泵為0.8 mL·min-1。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm和254 nm。柱溫40 ℃。進(jìn)樣量100 μL。時(shí)間程序0.01～4.00 min目標(biāo)物轉(zhuǎn)移至中間柱；4.01～6.00 min目標(biāo)物從中間柱轉(zhuǎn)移至二維色譜柱；6.01～13.50 min目標(biāo)物在第二維色譜中完成分離。

2.2 溶液的制備

2.2.1對(duì)照品貯備液的制備 精密稱取替考拉寧對(duì)照品24.00 mg于10 mL量筒中，用體積分?jǐn)?shù)10%的甲醇溶解并定容，制備成2.40 g·L-1的替考拉寧對(duì)照品貯備液，置于-30 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2質(zhì)控血清的制備 精密量取替考拉寧對(duì)照品貯備液適量，分別加入適量空白馬血清，制成10.00、40.00、80.00 mg·L-1的替考拉寧低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控血樣，置于-30 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 樣品處理及測(cè)定精密吸取1 000 μL MPI-1至1.5 mL離心管中，加入400 μL血樣，渦旋振蕩1.0 min；15 000 r·min-1高速離心8.0 min，取上清1 000 μL進(jìn)樣分析。

2.4 專屬性試驗(yàn)分別將空白馬血清、40 mg·L-1的替考拉寧中質(zhì)量濃度質(zhì)控品按2.3部分方法處理，按2.1部分色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，色譜圖見圖1。替考拉寧以11.50 min的色譜峰(替考拉寧TA2-2的色譜峰)計(jì)，血清內(nèi)源性物質(zhì)及其他雜質(zhì)均不干擾樣品的分離測(cè)定，結(jié)果表明該方法專屬性好。

A為空白馬血清；B為替考拉寧對(duì)照品；＊為替考拉寧TA2-2的色譜峰。

2.5 線性關(guān)系考察精密量取替考拉寧對(duì)照品貯備液適量，分別加入適量空白馬血清，制成3.75、7.50、15.00、30.00、60.00、120.00 mg·L-1的替考拉寧系列混合標(biāo)準(zhǔn)血樣，將制備好的系列混合標(biāo)準(zhǔn)血樣按2.3部分方法處理，按2.1部分色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積Y對(duì)質(zhì)量濃度X做線性回歸方程：

Y=3 149.67X-1 738.91。

式中：Y為峰面積，單位為mV·min；X為質(zhì)量濃度，單位為mg·L-1。

r=0.999 9，線性范圍為3.75～120.00 mg·L-1。結(jié)果表明替考拉寧在3.75～120.00 mg·L-1范圍內(nèi)，線性良好。

2.6 精密度試驗(yàn)精密量取替考拉寧對(duì)照品貯備液適量，分別加入適量空白馬血清，制成40.00 mg·L-1的替考拉寧中質(zhì)量濃度質(zhì)控血樣，按2.3部分方法處理，按2.1部分色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察儀器精密度。結(jié)果RSD為1.6%，表明該方法精密度良好。

2.7 回收率試驗(yàn)按2.2.2部分制備10.00、40.00、80.00 mg·L-1的替考拉寧低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控血樣，每個(gè)水平的質(zhì)控樣品平行制備3份樣品，按2.3部分方法處理后進(jìn)樣分析，考察方法回收率。結(jié)果低、中、高質(zhì)控的回收率分別為98.9%，98.2%，98.0%，表明該方法回收率良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)按2.2.2部分制備10.00、40.00、80.00 mg·L-1的替考拉寧低、中、高質(zhì)控血樣，每個(gè)水平的質(zhì)控制備6份樣品，分別考察室溫下24 h以及-30 ℃冰箱保存30 d的穩(wěn)定性，結(jié)果在兩個(gè)條件下保存后，質(zhì)控血樣中替考拉寧的含量變化均小于5%，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明替考拉寧在血清中穩(wěn)定性良好。

2.9 臨床應(yīng)用收集河南省人民醫(yī)院2020年1月至2020年3月在重癥監(jiān)護(hù)室住院患者的血樣，進(jìn)行替考拉寧血藥濃度監(jiān)測(cè)，共檢測(cè)11例。參考《治療藥物監(jiān)測(cè)臨床應(yīng)用手冊(cè)》[4]中推薦監(jiān)測(cè)替考拉寧穩(wěn)態(tài)谷濃度>10 mg·L-1，檢測(cè)結(jié)果中有5例樣本替考拉寧的血藥濃度高于10 mg·L-1，達(dá)到目標(biāo)血藥濃度的樣本量?jī)H占總樣本量的45.45%。以上結(jié)果分析顯示，達(dá)到臨床有效血藥濃度者不足一半，臨床上應(yīng)給予重視。在使用替考拉寧進(jìn)行治療時(shí)，醫(yī)生應(yīng)及時(shí)監(jiān)測(cè)替考拉寧血藥濃度，進(jìn)而促進(jìn)合理用藥。

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)開展替考拉寧治療藥物監(jiān)測(cè)的工作還處于起步階段，查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)臨床工作中測(cè)定替考拉寧血藥濃度的方法主要有高效液相色譜法[5-10]和液相色譜-質(zhì)譜法[11-15]，血樣的預(yù)處理方法多采用乙腈沉淀蛋白及二氯甲烷或三氯甲烷萃取，該處理方法操作繁瑣并且耗時(shí)較長(zhǎng)，不適于批量處理。并且這類方法在前處理時(shí)用到的乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷等有機(jī)試劑毒性較大，日常使用時(shí)會(huì)對(duì)工作人員造成一定傷害，所以該方法并不適合臨床大批量的檢測(cè)。有研究在血樣處理時(shí)采用了Centrifree超濾裝置，該裝置可以截留分子量>30 000的物質(zhì)，但是整個(gè)處理過程需要在37 ℃水浴中平衡30 min，然后在37 ℃，1 500×g下離心 30 min，樣品前處理耗時(shí)較長(zhǎng)，所以處理過程雖然相對(duì)沉淀蛋白的方法較安全，但是整個(gè)處理過程相對(duì)繁瑣[11]。本研究中，前處理方法用時(shí)約10 min，并且相對(duì)安全，操作簡(jiǎn)單、方便，適于批量處理。另外液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)實(shí)驗(yàn)室以及操作人員的專業(yè)要求較高，該方法不適于在基層醫(yī)院開展。

本研究建立的全自動(dòng)二維液相色譜測(cè)定替考拉寧血藥濃度的方法具有前處理簡(jiǎn)單、測(cè)定快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，能滿足臨床報(bào)告對(duì)及時(shí)性、準(zhǔn)確性和測(cè)定范圍的要求，可以作為臨床監(jiān)測(cè)血藥濃度的有效方法。