從單酶催化到多酶級(jí)聯(lián)催化
——從王義翹教授在酶技術(shù)領(lǐng)域的貢獻(xiàn)說開去

吳淑可，周頤，王文，張巍，高鵬飛，李智

（1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2雀巢新加坡研發(fā)中心，新加坡 619625；3新加坡科技研究局（A*STAR）生物過程技術(shù)研究所，新加坡 138668；4葛蘭素史克中國投資有限公司，北京 100025；5新加坡國立大學(xué)化學(xué)與分子工程系，新加坡 117585）

麻省理工學(xué)院王義翹教授是國際生物工程和生物技術(shù)領(lǐng)域的奠基人和業(yè)界泰斗，開拓了現(xiàn)代生物化工和生物制藥領(lǐng)域新的疆界并引領(lǐng)了其發(fā)展。他的研究方向涵蓋了生化工程的各個(gè)子領(lǐng)域，包括：上游的基因與分子工程（例如酶技術(shù)和酶工程）、中游的生化過程工程與工藝（例如高密度培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞、生產(chǎn)重組抗體藥物、計(jì)算機(jī)控制生化反應(yīng)過程）、下游的生物分離純化技術(shù)（例如生物膜和色譜技術(shù)、糖基化蛋白的質(zhì)量控制、蛋白質(zhì)的純化和復(fù)性），以及貫穿上中下游的整合生物過程工程（例如微生物降解纖維素生產(chǎn)生物能源、微生物脫硫技術(shù)）等［1］。作為王義翹教授在酶技術(shù)領(lǐng)域的學(xué)生和合作者，我們非常榮幸能在此介紹王教授早期在酶技術(shù)領(lǐng)域的貢獻(xiàn)，簡(jiǎn)述我們?cè)谕踅淌诘暮献?、指?dǎo)和幫助下獲得的酶技術(shù)領(lǐng)域的成果，以及延伸討論多酶級(jí)聯(lián)催化領(lǐng)域的最新進(jìn)展，并對(duì)進(jìn)一步結(jié)合合成生物學(xué)的理念和思想［2］的可行性進(jìn)行展望。

1 王義翹教授早期在酶技術(shù)領(lǐng)域的貢獻(xiàn)

酶作為生物體內(nèi)具有催化功能的元件，在生命的誕生、生長(zhǎng)、延續(xù)、繁衍中起著不可替代的重要作用。從應(yīng)用角度來講，酶已經(jīng)滋養(yǎng)了人類飲食文化上千年，例如微生物釀酒、發(fā)酵食品等。伴隨著近代以來科技的迅猛發(fā)展，酶在社會(huì)生活中有著更為廣泛的應(yīng)用，例如食品、能源、化工、制藥業(yè)、輕工業(yè)、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域等［3-7］。王教授早期的獨(dú)立學(xué)術(shù)生涯始于MIT 的營養(yǎng)及食品科學(xué)系。早在20 世紀(jì)70 年代，他便利用蛋白酶（枯草芽孢桿菌來源）來消化魚蛋白固體濃縮物（fish protein concentrate），并研究了該非均相酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)［8］，以及對(duì)汞含量的影響［9］。基于當(dāng)時(shí)美國社會(huì)對(duì)利用化石燃料來源的碳一原料的興趣，王教授研究了源自多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）的甲醇氧化酶，優(yōu)化了酶提取的過程，開發(fā)了以二乙氨基乙基纖維素（DEAEcellulose）為載體的酶固定化方法，并且研究了該酶在分批反應(yīng)器和連續(xù)性反應(yīng)器中氧化甲醇生產(chǎn)甲醛的過程［10］。20 世紀(jì)70—80 年代也是抗生素發(fā)掘的黃金年代，當(dāng)時(shí)王教授就提出了利用純化的多個(gè)酶合成天然產(chǎn)物的方案，利用短芽孢桿菌（Bacillus brevisATCC 9999）中部分純化的非核糖體多肽合成酶（2 個(gè)組分），首次實(shí)現(xiàn)了無細(xì)胞多酶反應(yīng)制備級(jí)全合成約500 mg 的短桿菌肽S（gramicidin S）［11］，并且通過與Robert Langer 教授和George Whitesides教授等的合作，實(shí)現(xiàn)了該反應(yīng)中重要的輔因子ATP 的再生［12］。針對(duì)這個(gè)反應(yīng)，王教授還開發(fā)了短芽孢桿菌的高密度發(fā)酵工藝，用于生產(chǎn)非核糖體多肽合成酶［13］，并深入研究了該非核糖體多肽合成酶催化的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)［14］。在80 年代以后，王教授的研究重心逐漸轉(zhuǎn)向了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白藥物生產(chǎn)的方向，但仍繼續(xù)開展一些酶技術(shù)相關(guān)的科研工作，例如和當(dāng)時(shí)還是博士生的Andreas Bommarius 教授合作研究了黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase）在反膠束體系（reversed micellar systems）中的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，為氧化還原酶在非水相溶劑中的反應(yīng)提供了理論基礎(chǔ)［15］，并利用螢火蟲來源的熒光素酶（luciferase）開發(fā)了發(fā)酵過程中在線檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)量和胞內(nèi)ATP濃度的方法［16-17］。通過回顧王教授早期在酶技術(shù)領(lǐng)域的貢獻(xiàn)，我們可以發(fā)現(xiàn)雖然王教授沒有同F(xiàn)rances Arnold 教授［18］或者M(jìn)anfred Reetz 教授［19］那樣圍繞酶技術(shù)的一個(gè)重要方向（定向進(jìn)化）進(jìn)行全面深入的研究，他仍然在酶技術(shù)領(lǐng)域的幾個(gè)子方向上做出了重要貢獻(xiàn)。即使從幾十年后的今天來看，他所探尋的諸多方向仍是酶技術(shù)的研究熱點(diǎn)，例如食品的酶消化［20］、碳一原料的酶轉(zhuǎn)化［21-23］、無細(xì)胞多酶生物合成［24］等。更難能可貴的是，王教授在這些不同的酶技術(shù)項(xiàng)目中，都非常注重定量的工程化思想，對(duì)多種較為復(fù)雜的酶催化反應(yīng)進(jìn)行了催化動(dòng)力學(xué)和數(shù)學(xué)建模，這對(duì)于今天的酶技術(shù)領(lǐng)域的研究和發(fā)展都極具借鑒價(jià)值和指導(dǎo)意義。

2 王義翹教授在新加坡-麻省理工聯(lián)盟項(xiàng)目的工作

從20 世紀(jì)90 年代起，王教授長(zhǎng)期推動(dòng)并制定了新加坡生物技術(shù)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的長(zhǎng)期發(fā)展規(guī)劃，擔(dān)任新加坡國立大學(xué)/MIT 淡馬錫教授多年，主持創(chuàng)建了新加坡 A*STAR Bioprocessing Technology Institute，并獲新加坡李光耀總理頒發(fā)的國家公共服務(wù)獎(jiǎng)?wù)?。?005 年到2015 年，年逾古稀的王教授通過新加坡-麻省理工聯(lián)盟（Singapore-MIT Alliance）的化學(xué)工程與制藥工程項(xiàng) 目（Chemical and Pharmaceutical Engineering）與新加坡國立大學(xué)的李智教授（本文作者）合作，聯(lián)合指導(dǎo)了幾名博士生（本文作者王文、張巍、高鵬飛、吳淑可），在酶技術(shù)領(lǐng)域的幾個(gè)子方向上繼續(xù)開展了重要的工作。尤其令我們感動(dòng)的是，在聯(lián)合指導(dǎo)的過程中，近80 歲高齡的王教授仍然不辭辛苦，多次從波士頓飛往亞太地區(qū)，親自蒞臨一線指導(dǎo)科研工作［圖1（a）］，并積極參與亞太地區(qū)的學(xué)術(shù)會(huì)議。在2013 年，他還作為大會(huì)榮譽(yù)主席出席了北京第18 屆國際生物化學(xué)和分子工程大會(huì)［圖1（b）］。聯(lián)合培養(yǎng)的博士生也有機(jī)會(huì)來到世界頂尖的MIT化工系，參與到王教授MIT實(shí)驗(yàn)室的最后幾項(xiàng)研究中［25］。這不僅讓我們能親自了解和領(lǐng)略到化工領(lǐng)域的最前沿進(jìn)展，還有更多的機(jī)會(huì)聆聽王教授的諄諄教誨，并從他獨(dú)立自主的人格魅力中受到鼓舞。這段在美國麻省劍橋城的時(shí)光也成為我們?nèi)松凶顚氋F的經(jīng)歷［圖1（c）～（e）］。以下部分將著重介紹我們?cè)谕踅淌谥笇?dǎo)下合作參與新加坡-麻省理工聯(lián)盟項(xiàng)目所開展的幾項(xiàng)酶技術(shù)領(lǐng)域的研究工作。

圖1 王義翹教授與本文部分作者在新加坡-麻省理工聯(lián)盟項(xiàng)目實(shí)施期間的合影Fig.1 Photos of Prof.Wang together with some of authors during the Singapore-MIT Alliance Program

酶的固定化是指通過物理或化學(xué)法將酶緊密地結(jié)合于非均相的載體上［26-27］，它可以增加酶的穩(wěn)定性，并通過重復(fù)使用降低酶的使用成本。固定于傳統(tǒng)載體（厘米或毫米級(jí)）上的酶常常受限于較低的非均相催化效率和傳質(zhì)（例如王教授早期固定化甲醇氧化酶的工作［10］），而納米級(jí)的載體有著更高的表面積/體積比，從而賦予固定化酶類似于均相催化的高效反應(yīng)速率，但更小的載體通常意味著更困難的反應(yīng)后分離。為了解決此矛盾，王教授啟發(fā)性地提出了是否可以利用額外的作用力幫助分離納米級(jí)的固定化酶?？紤]到當(dāng)時(shí)已經(jīng)開發(fā)了許多基于四氧化三鐵（Fe3O4）的磁性納米顆粒（iron oxide magnetic nanoparticles），但鮮少用于酶的固定化，于是我們決定借助磁力來分離納米級(jí)的固定化酶。王文合成了聚合物包埋鐵氧化物核心的磁性納米顆粒，并通過共價(jià)鍵將酶固定于其表面，從而開發(fā)了高活力可回收利用的納米生物催化劑［圖2（a）］［28］。以不對(duì)稱氧化苯硫基甲烷（thioanisole）作為模式反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)固定于磁性納米顆粒上的氯過氧化物酶（chloroperoxidase）和游離的氯過氧化物酶有著幾乎相同的催化活力和Km值，及同樣完美的手性選擇性。并且該磁性納米生物催化劑可以通過磁場(chǎng)分離從而回收利用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該納米催化劑在成功回收利用12 個(gè)循環(huán)后仍能保持原有活力。在后續(xù)課題中，王文構(gòu)建了表面含有次氮基三乙酸鎳（Ni-NTA）的磁性納米顆粒，并利用它直接從細(xì)胞裂解液中一步純化和固定含有組氨酸標(biāo)簽的重組酶［29］。在不對(duì)稱水解對(duì)氯苯基環(huán)氧乙烷［2-（4-chlorophenyl）-oxirane］的模式反應(yīng)中，相比于游離的環(huán)氧水解酶，固定在磁性納米顆粒上的環(huán)氧水解酶保留了大部分的活力（80%）和相同的手性選擇性，并可以通過磁場(chǎng)分離回收利用8 個(gè)循環(huán)（保持80%以上的產(chǎn)率）。基于這兩項(xiàng)開創(chuàng)性的工作，我們課題組進(jìn)一步開發(fā)了類似系統(tǒng)來固定化醇脫氫酶用于還原酮［30］、固定化脂肪酶用于生產(chǎn)生物柴油［31］、固定化乙酰高絲氨酸巰解酶（O-acetylserine sulfhydrylase）用于生產(chǎn)非天然氨基酸等［32］。這些成果的取得離不開項(xiàng)目最早期王教授開放型思維和交叉學(xué)科思想的啟迪，通過引進(jìn)先進(jìn)的納米技術(shù)應(yīng)用于酶技術(shù)領(lǐng)域，創(chuàng)建了更為高效且可回收利用的納米生物催化劑。

圖2 王義翹教授在新加坡-麻省理工聯(lián)盟項(xiàng)目里聯(lián)合指導(dǎo)本文作者的四項(xiàng)酶技術(shù)領(lǐng)域的工作Fig.2 Four enzyme technology projects co-supervised by Prof.Wang through the Singapore-MIT Alliance Program

在非水溶劑中的酶促反應(yīng)也一直是酶技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，王教授在20 世紀(jì)90 年代就已經(jīng)研究了反膠束體系中的酶促反應(yīng)［15］，除了傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑，近年來的研究熱點(diǎn)主要圍繞著更加綠色環(huán)保和生物相適性更好的離子液體（ionic liquid）［33］和低共熔溶劑（deep-eutectic solvents）［34］等。當(dāng)時(shí)我們項(xiàng)目的一個(gè)課題旨在利用來自鞘氨醇單胞菌（Sphingomonassp.HXN-200）的P450pyr 單加氧酶催化不對(duì)稱氧化苯基硫醚（thioanisole）合成手性苯基亞砜［Phenyl sulfoxide，圖2（b）］［35］。初步篩選實(shí)驗(yàn)室中不同的P450pyr 突變體后發(fā)現(xiàn)，在單一的水相（磷酸鹽緩沖液）條件下，手性選擇性最高的突變體生成幾個(gè)苯基亞砜的ee值也只有80%～88%。通常提高手性選擇性的思路是通過酶的定向進(jìn)化來實(shí)現(xiàn)的［36］，我們之前也已經(jīng)成功定向進(jìn)化了P450pyr 用于高選擇性的羥化反應(yīng)［37-39］，但對(duì)于亞砜化反應(yīng)，苦于沒有合適的高通量篩選方法而止步。王教授于是建議嘗試一些非水溶劑或雙液相反應(yīng)。鑒于很多氧化酶在非水溶劑中不穩(wěn)定，且通過改變反應(yīng)體系顯著提高氧化酶的手性選擇性還鮮有報(bào)道，剛開始我們并不愿嘗試。在其他方案無果的情況下，高鵬飛篩選了不同的離子液體作為雙液相的第二相，并驚喜地發(fā)現(xiàn)離子液體［P6，6，6，14］［NTf2］顯著提高了P450pyr 氧化反應(yīng)的手性選擇性，三個(gè)苯基亞砜產(chǎn)物的ee 值達(dá)96%～99%［35］。同時(shí)，該離子液體具有非常好的生物相適性，并且對(duì)苯基硫醚（底物）和苯基亞砜（產(chǎn)物）具有較高的溶解度，從而降低了底物和產(chǎn)物對(duì)P450pyr 酶的抑制作用。通過進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn)，該離子液體很有可能是通過降低水相中實(shí)際苯基硫醚的濃度，從而提高了P450pyr 的手性選擇性?；剡^頭來反思，王教授鼓勵(lì)大膽嘗試，打破常規(guī)性思維是該課題最終獲得成功的重要因素。

酶催化過程經(jīng)常消耗化學(xué)當(dāng)量的輔因子，因此輔因子再生是眾多酶催化過程中不可避免的一個(gè)重要環(huán)節(jié)［40］。作為行業(yè)先驅(qū)，王教授同早期的幾個(gè)合作者也開發(fā)了ATP 的再生技術(shù)［12］。對(duì)于輔酶NAD（P）+/NAD（P）H 的再生，通常的思路是在大腸桿菌中共表達(dá)相應(yīng)的輔酶再生的酶，或者利用分離純化的酶來實(shí)現(xiàn)的。但這種方法并不適用于基于野生菌中尚未解析出相應(yīng)功能的酶的情況，例如我們之前分離到一株短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）用于合成貝氟沙通（befloxatone）的手性中間體［41］，但其中基于NADPH 酮還原酶尚不明確。在王教授的聯(lián)合指導(dǎo)下，張巍開發(fā)了過表達(dá)葡萄糖脫氫酶（glucose dehydrogenase）的大腸桿菌作為通透的全細(xì)胞（permeabilized cells）用于再生NADPH［圖2（c）］［42］。將大腸桿菌和野生型短小芽孢桿菌組合，實(shí)現(xiàn)了高效的不對(duì)稱酮還原。利用這個(gè)通透的全細(xì)胞輔酶NADPH 再生系統(tǒng)，其NADPH 的總轉(zhuǎn)化數(shù)（total turnover number，TTN）達(dá)到了4200。并且這種通透的全細(xì)胞輔酶再生系統(tǒng)比利用純化的酶有更低的成本，可作為常用的輔因子再生策略的重要補(bǔ)充。

酶作為具有催化功能的元件，可以通過理性設(shè)計(jì)和組裝多個(gè)催化元件形成復(fù)合的催化系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)單一元件無法實(shí)現(xiàn)的化學(xué)轉(zhuǎn)化的功能。這種多酶級(jí)聯(lián)催化（enzyme cascade catalysis）可以實(shí)現(xiàn)一鍋多步反應(yīng)直接生產(chǎn)最終產(chǎn)物，避免了分離純化中間產(chǎn)物的步驟，節(jié)省了人力和物力投入的同時(shí)還減少了廢棄物的產(chǎn)生［43-49］。值得一提的是，在存在熱力學(xué)上平衡反應(yīng)的時(shí)候，級(jí)聯(lián)的多步反應(yīng)可以打破反應(yīng)平衡，提高最終產(chǎn)物的產(chǎn)率。具體實(shí)施上，級(jí)聯(lián)催化的多個(gè)酶可以首先通過分別表達(dá)純化（甚至固定化），進(jìn)而再混合在一起在容器中反應(yīng)（無細(xì)胞酶催化合成），或者將多個(gè)酶表達(dá)在一個(gè)或多個(gè)重組微生物中構(gòu)建獨(dú)立的人工反應(yīng)途徑（全細(xì)胞酶催化合成）。王教授在20世紀(jì)70年代就利用部分純化的非核糖體多肽合成酶（2 個(gè)組分），首次實(shí)現(xiàn)無細(xì)胞多酶制備級(jí)全合成短桿菌肽S［11］。這個(gè)早期的工作利用的是天然的生物合成途徑，而通過人工設(shè)計(jì)非天然的酶催化路線，利用不同來源的酶，可以創(chuàng)造出新的化學(xué)轉(zhuǎn)化。在王教授的聯(lián)合指導(dǎo)下，張巍結(jié)合單加氧酶催化的羥基化反應(yīng)和醇脫氫酶催化的醇氧化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了一鍋法轉(zhuǎn)化亞甲基氧化成酮［圖2（d）］［50］。第一個(gè)具體的反應(yīng)結(jié)合了一株含有單加氧酶的蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii）和商業(yè)化的醇脫氫酶LkADH（開菲爾乳桿菌來源），用以氧化四氫化萘（tetralin）生成1-四氫萘酮（1-tetralone，得率達(dá)88%）以及二氫茚（indan）生成1-二氫茚酮（1-indanone，得率達(dá)87%）。另一個(gè)反應(yīng)結(jié)合了表達(dá)P450pyr的大腸桿菌和純化的醇脫氫酶RDR，用以氧化N-芐基哌啶（N-benzyl-piperidine）生成N-芐基-4-哌啶酮（N-benzyl-4-piperidone，得率達(dá)86%）。在以上脫氫酶催化的醇氧化反應(yīng)中，所需的輔因子NAD+和NADP+是通過加入丙酮得以再生的（總轉(zhuǎn)化數(shù)達(dá)4000以上）。由于羥化酶具有極高的位置選擇性，在反應(yīng)中并未檢測(cè)到其他位置氧化的副產(chǎn)物的生成。

鑒于上述反應(yīng)較為簡(jiǎn)單且產(chǎn)物不具手性，接下來我們開發(fā)的另一個(gè)雙酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，環(huán)氧化-水解生產(chǎn)手性二醇［51］，被王教授尖銳地指出有機(jī)化學(xué)也可以實(shí)現(xiàn)同樣的反應(yīng)，且產(chǎn)物的復(fù)雜度遠(yuǎn)不如他早期開發(fā)的短桿菌肽S。在王教授的鞭策和激勵(lì)下，我們決定利用合成生物學(xué)的工程化和模塊化思想，由下至上地構(gòu)建獨(dú)立于細(xì)胞代謝的反應(yīng)途徑，實(shí)現(xiàn)更為復(fù)雜的、化學(xué)法無法企及的一鍋反應(yīng)，從末端烯烴一鍋法合成手性α-羥基酸、鄰氨醇和α-氨基酸（圖3）［52］。吳淑可首先利用合成生物學(xué)的模塊化思想，將兩個(gè)酶催化反應(yīng)（及其輔助反應(yīng)）組成一個(gè)模塊，根據(jù)總反應(yīng)歷程共設(shè)計(jì)了4 個(gè)酶催化模塊，相應(yīng)模塊的具體職能如下：模塊I，環(huán)氧化酶-環(huán)氧水解酶催化烯烴轉(zhuǎn)化成鄰二醇；模塊II，醇脫氫酶-醛脫氫酶催化鄰二醇氧化成α-羥基酸；模塊III，醇脫氫酶-ω-轉(zhuǎn)氨酶-丙氨酸脫氫酶催化鄰二醇轉(zhuǎn)化成鄰氨醇；模塊IV，羥基酸氧化酶-過氧化氫酶-α-轉(zhuǎn)氨酶-谷氨酸脫氫酶催化α-羥基酸轉(zhuǎn)化成α-氨基酸。這樣通過組合不同的模塊足以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)中所設(shè)計(jì)的三類烯烴轉(zhuǎn)化。以苯乙烯合成手性扁桃酸（mandelic acid）、苯乙氨醇（phenylethanolamine）、苯甘氨酸（phenylglycine）為模式反應(yīng)，我們從多種微生物中篩選并克隆了相應(yīng)的酶，并將每個(gè)模塊的基因分別構(gòu)建到4個(gè)兼容的質(zhì)粒上，組合后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，從而最終篩選出了3 株最優(yōu)的菌株來分別催化苯乙烯生產(chǎn)S-扁桃酸、S-苯乙氨醇和S-苯甘氨酸（轉(zhuǎn)化率為86%～95%，分離得率為60%～72%）。與此同時(shí)，該多酶級(jí)聯(lián)催化還可以轉(zhuǎn)化多個(gè)不同取代的苯乙烯生成相應(yīng)的取代產(chǎn)物。由于多個(gè)酶的高位置和手性選擇性，所有最終手性產(chǎn)物的ee 值達(dá)91%～99%。從簡(jiǎn)單易得的烯烴直接一鍋法制備高值的手性精細(xì)化學(xué)品，這3種多酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)全部在溫和的條件下進(jìn)行，并且只消耗便宜且環(huán)保的葡萄糖、氧氣和氨作為計(jì)量的反應(yīng)物，為綠色生物制造拓展了新的版圖。此外，這三條途徑涉及4～6 步線性反應(yīng)，需要4～8 個(gè)不同來源的酶參與，在大腸桿菌中構(gòu)建出了獨(dú)立于細(xì)胞代謝的人工途徑，證明了較多步驟的酶級(jí)聯(lián)催化的高效性?？偨Y(jié)成果之余，我們深刻地感受到該課題最終成功開發(fā)與王教授對(duì)本項(xiàng)目早期的指導(dǎo)和激勵(lì)是密不可分的。

圖3 王義翹教授在新加坡-麻省理工聯(lián)盟項(xiàng)目里聯(lián)合指導(dǎo)本文作者吳淑可開發(fā)的模塊化多酶級(jí)聯(lián)催化轉(zhuǎn)化烯烴生成三類手性分子EP—環(huán)氧化酶；EH—環(huán)氧水解酶；ADH—醇脫氫酶；ALDH—醛脫氫酶；ω-TA—ω-轉(zhuǎn)氨酶；AlaDH—丙氨酸脫氫酶；HO—羥基酸氧化酶；α-TA—α-轉(zhuǎn)氨酶；CAT—過氧化氫酶；GluDH—谷氨酸脫氫酶Fig.3 Modular multi-enzyme cascade catalysis for the transformation of alkenes into three types of chiral molecules developed by Wu Shuke and co-supervised by Prof.Wang through the Singapore-MIT Alliance.EP—epoxidase;EH—epoxide hydrolase;ADH—alcohol dehydrogenase;ALDH—aldehyde dehydrogenase;ω-TA—ω-transaminase;AlaDH—alanine dehydrogenase;HO—hydroxy acid oxidase;α-TA—α-transaminase;CAT—catalase;GluDH—glutamate dehydrogenase

在此項(xiàng)目的基礎(chǔ)上我們和其他課題組還進(jìn)一步擴(kuò)展了烯烴的多酶級(jí)聯(lián)催化，用于生產(chǎn)更多不同種類的手性或大宗芳香族化學(xué)品，例如利用來自施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）的特別的D-轉(zhuǎn)氨酶生產(chǎn)重要的抗生素側(cè)鏈D-苯甘氨酸［53］；利用苯乙烯天然降解途徑中的氧化苯乙烯歧化酶（styrene oxide isomerase）生產(chǎn)苯乙酸、苯乙醇和苯乙胺［54-55］；利用扁桃酸天然降解途徑中的脫羧酶進(jìn)一步生產(chǎn)苯甲胺和苯甲酸［56-57］；利用來自枯草芽孢桿菌的丁二醇脫氫酶和不同的ω-轉(zhuǎn)氨酶生產(chǎn)R-苯甘氨醇或S-苯甘氨醇［58-59］等。考慮到烯烴大都是基于不可再生的化石燃料的，為了直接利用可再生的生物基原料，我們?cè)O(shè)計(jì)了另外一個(gè)酶催化模塊，包括擬南芥來源的氨基裂解酶（phenylalanine ammonia lyase）和黑曲霉來源的脫羧酶（phenylacrylic acid decarboxylase）來實(shí)現(xiàn)從生物基苯丙氨酸生產(chǎn)苯乙烯。將該酶模塊和上文已經(jīng)開發(fā)出的酶模塊有機(jī)結(jié)合之后，實(shí)現(xiàn)了從生物基苯丙氨酸出發(fā)的多酶級(jí)聯(lián)催化生產(chǎn)多種非天然手性化學(xué)品［60］。為了直接利用更為廉價(jià)的生物基原料，我們改造了一株大腸桿菌以葡萄糖或甘油發(fā)酵生產(chǎn)苯丙氨酸，并開發(fā)了“偶聯(lián)發(fā)酵-生物轉(zhuǎn)化技術(shù)”（coupled fermentationbiotransformation）原位轉(zhuǎn)化發(fā)酵液中的苯丙氨酸用以高效生產(chǎn)具有抑菌作用的大宗芳香族化學(xué)品苯甲酸（防腐劑）和苯乙醇（香料）［57，61］。以上這些工作展示了多酶級(jí)聯(lián)催化的許多優(yōu)點(diǎn)，例如節(jié)省了分離純化中間產(chǎn)物的步驟，不易受反應(yīng)中間體或最終產(chǎn)物的抑制等等。近年來，來自世界各地的研究者也開發(fā)了許多新型高效的多酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)用于生產(chǎn)大宗化學(xué)品、手性化學(xué)品、復(fù)雜的人工藥物和天然產(chǎn)物等［43-49］，我們將繼續(xù)重點(diǎn)介紹近年來所開發(fā)的生產(chǎn)手性和大宗化學(xué)品的多酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)。

3 多酶級(jí)聯(lián)催化的最新進(jìn)展

手性胺是一類極為重要的手性合成中間體，被廣泛應(yīng)用在合成藥品、精細(xì)化學(xué)品、農(nóng)用化學(xué)品的生產(chǎn)和制備中［62］。相較于化學(xué)法，酶催化合成手性胺通常具有更高的選擇性，且反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)體系綠色無毒，其中最著名的范例是美國Codexis 公司定向進(jìn)化ω-轉(zhuǎn)氨酶合成西他列汀［63］。通常酶催化合成手性胺需要利用酮作為底物，而非手性或消旋的醇是更為廉價(jià)易得的底物，但尚且沒有單一的酶可以直接轉(zhuǎn)化醇變?yōu)榘贰Ｓ鼜厮固卮髮W(xué)的Turner教授開發(fā)了一個(gè)簡(jiǎn)單的“借氫”雙酶級(jí)聯(lián)催化，利用醇脫氫酶（ADH）和人工改造的胺脫氫酶（AmDH，系王義翹教授的學(xué)生Bommarius教授開發(fā)［64］），直接轉(zhuǎn)化一系列芳香族或脂肪族的二級(jí)醇生成相應(yīng)的手性胺，而無需消耗化學(xué)計(jì)量的氧化/還原劑［圖4（a）］［65］。該雙酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)只需要氨水作為化學(xué)計(jì)量的試劑，且大部分產(chǎn)物手性胺都達(dá)到了光學(xué)純。但醇脫氫酶的高手性選擇性亦是一把雙刃劍，例如短乳桿菌來源的脫氫酶只能氧化R型的芳香醇，當(dāng)需要利用廉價(jià)易得的消旋醇作為底物的時(shí)候，必須利用兩個(gè)手性選擇性互補(bǔ)的醇脫氫酶。幾乎同時(shí)，華東理工大學(xué)許建和課題組也報(bào)道了類似的雙酶級(jí)聯(lián)催化從脂肪族的醇合成手性胺［66］。他們利用一個(gè)天藍(lán)色鏈霉菌來源的羰基還原酶（ScCR）和改造后的胺脫氫酶，轉(zhuǎn)化了一系列脂肪族的二級(jí)醇和1-苯乙醇生成相應(yīng)的手性胺。最近他們還增加了一個(gè)P450 酶擴(kuò)展了該雙酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，直接從環(huán)己烷和乙苯分別生產(chǎn)環(huán)己胺和R型1-苯乙胺［67］。除了改造的胺脫氫酶，ω-轉(zhuǎn)氨酶也可以和醇脫氫酶組合用于轉(zhuǎn)化醇生成胺，但是需要額外的較為復(fù)雜的氨基供體及其再生系統(tǒng)（例如L-丙氨酸和丙氨酸脫氫酶），且最終手性胺的轉(zhuǎn)化率往往不高［68］。最近，我們課題組設(shè)計(jì)了一個(gè)簡(jiǎn)單的醇脫氫酶-ω-轉(zhuǎn)氨酶雙酶級(jí)聯(lián)催化體系，實(shí)現(xiàn)了消旋的二級(jí)醇到手性胺的高效轉(zhuǎn)化［圖4（b）］［69］。其關(guān)鍵點(diǎn)是對(duì)近平滑假絲酵母來源的S-選擇性的醇脫氫酶（CpSADH）進(jìn)行了定向進(jìn)化，使其對(duì)S型和R型的二級(jí)醇具備相近的活力，使得只需使用單個(gè)酶（CpSADH-W286A）就可以充分氧化一系列消旋的二級(jí)醇。該體系利用異丙胺作為轉(zhuǎn)氨酶的氨基供體，其副產(chǎn)物丙酮?jiǎng)偤每梢员淮济摎涿高€原以再生NAD+。這樣，該體系只需要兩個(gè)酶和消耗廉價(jià)的化學(xué)當(dāng)量異丙胺，就可以高效轉(zhuǎn)化消旋的二級(jí)醇生產(chǎn)手性胺。上述這些例子主要是生產(chǎn)手性一級(jí)胺，而二、三級(jí)胺無法利用ω-轉(zhuǎn)氨酶或一般的胺脫氫酶直接制備。最近Turner 課題組率先利用最新發(fā)現(xiàn)源于米曲霉的還原胺化酶（催化羰基和一級(jí)胺生成亞胺并且還原為二級(jí)胺）［70］，進(jìn)一步結(jié)合幾個(gè)不同的醇脫氫酶或醇氧化酶構(gòu)建了雙酶級(jí)聯(lián)催化體系，實(shí)現(xiàn)了從一系列不同的一、二級(jí)醇和一級(jí)胺直接合成相對(duì)應(yīng)的二級(jí)胺［71］。

圖4 多酶級(jí)聯(lián)催化轉(zhuǎn)化二級(jí)醇一鍋法生產(chǎn)手性胺Fig.4 Multi-enzyme cascades for converting secondary alco?hols into chiral amines

與手性胺極為相關(guān)的是手性氨基酸，不僅編碼蛋白的19 種天然氨基酸是手性的，許多手性的非蛋白氨基酸也是多種生物活性物質(zhì)的重要組成部分，例如內(nèi)酰胺類抗生素、非核糖體多肽類天然產(chǎn)物、人工合成的多肽類藥物等［72-73］。鑒于手性氨基酸的重要性，一系列多酶級(jí)聯(lián)催化過程已經(jīng)進(jìn)行了充分開發(fā)用于制備手性α-氨基酸，例如早期利用海因酶-氨甲酰水解酶-消旋酶（海因酶法）制備D-氨基酸［74］，以及最近通過類似于醇轉(zhuǎn)化成胺的級(jí)聯(lián)反應(yīng)利用雙酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)可以轉(zhuǎn)化α-羥基酸生成手性α-氨基酸等［75］。大部分早期開發(fā)的酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)只涉及簡(jiǎn)單的官能團(tuán)轉(zhuǎn)換，并沒有涉及更為復(fù)雜的“碳—碳”鍵的生成。最近江南大學(xué)劉立明課題組基于合成生物學(xué)模塊化的思想開發(fā)了一種多酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)，通過“引入-重置-再引入”手性基團(tuán)的策略，實(shí)現(xiàn)了一系列手性α-羥基酸和α-氨基酸的合成［圖5（a）］［76］。其中的模塊化元件涉及兩部分，第一部分是基礎(chǔ)模塊，利用一個(gè)來自銅綠假單胞菌的蘇氨酸醛縮酶（threonine aldolase）和來自棒桿菌的蘇氨酸脫氨酶（threonine deaminase）分別催化的醛縮反應(yīng)和非典型的脫氨反應(yīng)，轉(zhuǎn)化醛和甘氨酸生成α-酮酸。第二部分是擴(kuò)展模塊，利用羥基異己酸脫氫酶（hydroxyisocaproate dehydrogenase）或氨基酸脫氫酶（amino acid dehydrogenase）及其輔助酶重新引入手性羥基或氨基，將α-酮酸轉(zhuǎn)化為手性α-羥基酸或α-氨基酸。通過將相應(yīng)模塊的基因分別構(gòu)建到兼容的質(zhì)粒上，并組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌，從而篩選出最優(yōu)的菌株用于催化相對(duì)應(yīng)的整個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)從不同的醛和甘氨酸出發(fā)合成了高手性純度的S型和R型的α-羥基酸和α-氨基酸。盡管產(chǎn)物濃度（約1 g/L）尚待提高，該多酶級(jí)聯(lián)催化體系充分利用了合成生物學(xué)模塊化的思路，顯著地拓展了綠色合成手性α-羥基酸和α-氨基酸的方法。另一類重要的手性氨基酸是β-氨基酸。目前通過酶催化合成β-氨基酸的思路主要有兩條。一種是利用氨基裂解酶在α，β-不飽和羧酸上經(jīng)由高位置和手性選擇性地加上氨基，例如微生物所的吳邊課題組利用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)改造了天冬氨酸酶（aspartase）合成了一系列手性β-氨基酸［77］，江南大學(xué)劉立明課題組利用酪氨酸酚裂解酶（tyrosine phenol lyase）和酪氨酸氨基變位酶（tyrosine aminomutase）從苯酚和丙酮酸合成了R型β-酪氨酸［78］。另一種合成β-氨基酸的策略是利用轉(zhuǎn)氨酶或者脫氫酶轉(zhuǎn)化β-酮酸，但是由于β-酮酸不穩(wěn)定，通常需要外加一個(gè)酶用于生成β-酮酸并進(jìn)行原位轉(zhuǎn)化，從而通過雙酶級(jí)聯(lián)催化合成手性β-氨基酸。例如天津工業(yè)生物技術(shù)研究所朱敦明課題組結(jié)合β-氨基酸脫氫酶與脂肪酶或腈水解酶，從β-酮酸酯或β-酮腈一鍋法合成手性β-氨基酸［圖5（b）］［79］。

圖5 多酶級(jí)聯(lián)催化生產(chǎn)手性α-氨基酸和β-氨基酸Fig.5 Multi-enzyme cascades for the production of chiral α-amino acids and β-amino acids

除了高附加值的手性化學(xué)品，多酶級(jí)聯(lián)催化也可以應(yīng)用于合成各種大宗化學(xué)品，特別是廣泛應(yīng)用的聚合物的單體等［80］。浙江大學(xué)葉麗丹等［81］報(bào)道了由P450 酶、醇脫氫酶、ω-轉(zhuǎn)氨酶組成的多酶級(jí)聯(lián)催化轉(zhuǎn)化月桂酸（十二碳酸）生成尼龍12 單體（ω-氨基十二烷酸）。值得一提的是，他們不僅表達(dá)了幾個(gè)輔助酶用于輔酶和氨基供體再生，而且還根據(jù)代謝工程的思路敲除了宿主細(xì)胞里降解的β-氧化途徑中的相關(guān)酶以及過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白用于輔助底物轉(zhuǎn)運(yùn)。對(duì)于更廣泛應(yīng)用的中鏈二元酸，湖北大學(xué)李愛濤團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一個(gè)6步的多酶級(jí)聯(lián)催化體系一鍋轉(zhuǎn)化環(huán)烷烴（C5～C8）生產(chǎn)中鏈二元酸（C5～C8），其中相應(yīng)的催化職能依次包括P450 催化羥化、醇脫氫酶氧化醇、拜爾維利格單加氧酶（Baeyer-Villiger monooxygenase）氧化酮、內(nèi)酯酶（lactonase）水解、醇脫氫酶氧化羥基酸、醛脫氫酶氧化醛酸［圖6（a）］［82］。該系統(tǒng)同樣采用了合成生物學(xué)模塊化的思路，且每個(gè)模塊包含輔助酶用于輔酶再生，但與之前不同的是，他們將每個(gè)模塊單獨(dú)構(gòu)建在一株大腸桿菌中，利用重組大腸桿菌菌群（consortia）的催化策略實(shí)現(xiàn)一鍋合成。這種菌群催化的策略比利用單一重組菌更容易調(diào)控優(yōu)化，在最優(yōu)的條件下，重組菌群可以從環(huán)己烷或環(huán)己醇一鍋法合成約5～8 g/L的己二酸。利用相同的策略，改用羧酸還原酶和酮還原酶，他們還開發(fā)了另一個(gè)相似的多酶級(jí)聯(lián)催化合成1，6-己二醇［83］。另一個(gè)最新的工作是來自韓國建國大學(xué)的Yun教授課題組，他們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)從環(huán)烷胺（C4～C6）合成尼龍單體內(nèi)酰胺（C4～C6），其獨(dú)特之處在于其中的ω-轉(zhuǎn)氨酶可以利用環(huán)烷胺中的氨基合成ω-氨基酸，從而無需額外的氨基供體［圖6（b）］［84］。在以上大部分的工作中，最終產(chǎn)物的濃度尚比較低（＜10 g/L），而為了在工業(yè)上與現(xiàn)有的化學(xué)法合成形成競(jìng)爭(zhēng)力，大宗化學(xué)品的酶催化合成需要極高的效率（時(shí)空產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率）?，F(xiàn)如今，酶的大規(guī)模挖掘［85］、理性設(shè)計(jì)、定向進(jìn)化手段［86］和基于合成生物學(xué)的微生物調(diào)控手段［87］可以極大地提升（微生物體內(nèi)）多酶級(jí)聯(lián)催化的效率。例如凱賽生物基于微生物內(nèi)的多酶級(jí)聯(lián)氧化長(zhǎng)鏈烷烴，大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸，已成為多酶級(jí)聯(lián)催化生產(chǎn)大宗化學(xué)品的典范。

圖6 多酶級(jí)聯(lián)催化生產(chǎn)大宗化學(xué)品Fig.6 Multi-enzyme cascades for the production of bulk chemicals

此外，近年來在合成復(fù)雜的天然產(chǎn)物和人工藥物等領(lǐng)域，多酶級(jí)聯(lián)催化策略也被越來越廣泛地采用［24，88］，例如美國默克公司利用一鍋9 酶3步法合成新型抗艾滋病藥物Islatravir［89］，相關(guān)進(jìn)展也于近期被很好地總結(jié)評(píng)述［24］，這里就不再贅述。

4 多酶級(jí)聯(lián)催化的發(fā)展方向以及王義翹教授工作的啟示

類似于合成生物學(xué)的發(fā)展［2］，創(chuàng)造性地結(jié)合其他學(xué)科也是多酶級(jí)聯(lián)催化發(fā)展的重要方向。在與化學(xué)學(xué)科的交叉方面，進(jìn)一步結(jié)合各種小分子催化、金屬催化、光催化、電催化劑組成化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)催化體系可以進(jìn)一步擴(kuò)展一鍋合成體系，實(shí)現(xiàn)單獨(dú)化學(xué)催化劑或者生物催化劑無法實(shí)現(xiàn)的功能［90-91］。例如美國伊利諾伊大學(xué)趙惠民組與加州大學(xué)伯克利分校Hartwig 組結(jié)合光催化的烯烴順反異構(gòu)和烯酮還原酶實(shí)現(xiàn)的不對(duì)稱還原反應(yīng)［92］，瑞士巴塞爾大學(xué)Ward 組結(jié)合多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)和金屬催化的烯烴復(fù)分解實(shí)現(xiàn)從生物基的油酸合成大宗化學(xué)品環(huán)烯烴［93］，荷蘭代夫特理工Hollmann 組與韓國Park 組利用油酸水合酶與光活化的脫羧酶從不飽和脂肪酸合成手性脂肪醇等［94］。此外，許多天然的多酶催化體系也給人工多酶體系的發(fā)展提供了靈感，例如多個(gè)酶在空間上有序地組織可以進(jìn)一步提高級(jí)聯(lián)催化的效率［95］，武漢大學(xué)劉天罡組與香港中文大學(xué)夏江組，利用一對(duì)多肽標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)了兩種酶的有效組裝，提高了在體外或細(xì)胞內(nèi)的級(jí)聯(lián)催化效率［96］。除了在空間上的優(yōu)化，利用不同溫度也可以極大地優(yōu)化多酶催化體系，例如上海交通大學(xué)許平組利用嗜熱菌來源的多種酶，開發(fā)了熱穩(wěn)定的雙酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)從阿魏酸合成香草醛，避免了產(chǎn)物的降解和副產(chǎn)物的生成［97-98］。

以上涵蓋了多酶級(jí)聯(lián)催化未來的重要發(fā)展方向，而當(dāng)我們?cè)俅位仡櫷趿x翹教授早期在酶技術(shù)領(lǐng)域的工作，相關(guān)的工程學(xué)研究思路和跳出瓶頸的思維魄力，仍對(duì)本領(lǐng)域現(xiàn)今以及未來的發(fā)展有著重要的啟示和指引。王教授早在40 多年前就開始研究酶催化轉(zhuǎn)化甲醇，如今利用碳一底物（例如二氧化碳、甲烷、甲醇等）依舊是酶催化與微生物煉制的研究熱點(diǎn)［21-23］。例如德國馬普所Erb 組設(shè)計(jì)并開發(fā)了一條全新的固定二氧化碳的17 個(gè)酶的級(jí)聯(lián)催化循環(huán)途徑，在體外優(yōu)化的條件下比天然的卡爾文循環(huán)固碳效率要高［99］；天津工業(yè)生物技術(shù)研究所的江會(huì)鋒組結(jié)合乙醇醛合酶、乙酰磷酸合酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶構(gòu)建了一條全新的從甲醛合成乙酰輔酶A 的途徑［100］。由于越來越多轉(zhuǎn)化碳一底物的酶被發(fā)現(xiàn)、開發(fā)和人工進(jìn)化，我們可以預(yù)期許多轉(zhuǎn)化碳一底物的多酶級(jí)聯(lián)催化將會(huì)被陸續(xù)開發(fā)出來，勢(shì)必將極大地?cái)U(kuò)展體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)化碳一原料的生物合成系統(tǒng)。而在另外一個(gè)方向上，本文作者和王教授也一起開發(fā)了高活力、高穩(wěn)定性、可回收利用的磁性納米生物催化劑，大大降低了單個(gè)酶催化的成本。如果將多個(gè)酶高效有序地固定在納米級(jí)的載體上，不僅能提高多酶級(jí)聯(lián)催化的效率，還能通過多次回收利用降低多酶級(jí)聯(lián)催化的成本。最后一點(diǎn)，也是非常重要的一點(diǎn)，定量思想和工程化思想常常貫穿在王教授多個(gè)早期的酶技術(shù)項(xiàng)目，相關(guān)的研究并不滿足于淺嘗輒止，而是更深入地研究了酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)并建立了對(duì)應(yīng)的數(shù)學(xué)模型等。然而近年來，縱觀多酶級(jí)聯(lián)催化的進(jìn)展，往往偏重于優(yōu)化反應(yīng)體系和最終產(chǎn)物的合成制備，而忽視了對(duì)多酶催化過程的定量分析和動(dòng)力學(xué)刻畫。我們應(yīng)該看到，對(duì)體外或細(xì)胞內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)催化過程的數(shù)學(xué)建模和定量分析描述，將為進(jìn)一步提高多酶反應(yīng)的效率提供理論基礎(chǔ)和優(yōu)化指導(dǎo)，從而幫助提高多酶級(jí)聯(lián)催化的效率接近或達(dá)到工業(yè)化應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)。這也是將這種基于自下而上的思路所構(gòu)建的多酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)，真正地提高到合成生物學(xué)的理論高度所必須踐行的標(biāo)準(zhǔn)。