侯正杰，孫慧中，白松，陳新月，曹春陽，程景勝

（教育部合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心，系統(tǒng)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300350）

脂肽是一類重要的由氨基酸衍生的低分子量生物表面活性劑和抗菌肽，主要通過非核糖體肽和聚酮雜合途徑生物合成［1］。其結(jié)構(gòu)中既含有親水性的氨基酸，又有疏水性脂肪酸鏈，其兩親性質(zhì)對(duì)其抗菌活性至關(guān)重要［2］。其中，氨基酸肽鏈連接成環(huán)或與部分脂肪酸鏈連接成環(huán)形成環(huán)脂肽。細(xì)菌環(huán)脂肽是由微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有表面活性劑性質(zhì)，并且針對(duì)不同細(xì)菌、真菌等病原體具有廣譜的抑菌活性［3］。環(huán)脂肽在生物防治、微生物采油、臨床治療、環(huán)境治理等方面具有多種應(yīng)用［4］。常見的環(huán)脂肽有表面活性素（surfactin）、豐原素（fengycin）、多黏菌素（polymyxin）、達(dá)托霉素（daptomycin）、伊枯草菌素（iturin）等。近年來，包括多黏菌素和達(dá)托霉素在內(nèi)的幾種環(huán)脂肽類抗生素已經(jīng)獲得FDA 批準(zhǔn)用于治療多重耐藥性超級(jí)細(xì)菌感染［5］。多黏菌素對(duì)許多耐藥細(xì)菌的治療具有有效性，多黏菌素B和E 被認(rèn)為是對(duì)抗耐藥細(xì)菌的“最后一道防線”，世界衛(wèi)生組織將多黏菌素重新列為“至關(guān)重要的藥物”用于臨床治療。但已有研究發(fā)現(xiàn)多黏菌素耐受基因，在全球引起高度關(guān)注［6-7］。同時(shí)，環(huán)脂肽類抗生素在生產(chǎn)和使用過程中面臨著一些問題：多種同系物存在導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)難控，多種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的類似物難預(yù)測(cè)、形成不同的生物活性，不同制造商和發(fā)酵過程的穩(wěn)定性差異性大［8］。而且環(huán)脂肽產(chǎn)物組分的不統(tǒng)一，對(duì)臨床使用造成困擾，影響藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)和毒性動(dòng)力學(xué)成效等［9-10］。新型環(huán)脂肽分子可能成為一類新的抗菌劑［11］。面對(duì)越來越多耐藥病菌的出現(xiàn)，急需尋找新的抗生素，更好地理解抗菌肽的合成、修飾和作用機(jī)制將重啟它的商業(yè)開發(fā)。

1 脂肽合成的微生物底盤

1.1 主要的細(xì)菌脂肽和來源

產(chǎn)脂肽的微生物分支，包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、沙雷菌屬（Serratia）和伯克菌屬（Burkholderia）等。很多脂肽不僅能降低表面張力，而且具有顯著的生物活性［12-13］，以玫瑰孢鏈霉菌（Streptomyces roseosporus）中的達(dá)托霉素和多黏芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）中的多黏菌素B 為代表［14-15］。脂肽一般由親水性的寡肽和疏水性的脂肪酸鏈組成，根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)又可細(xì)分為環(huán)狀陽離子脂肽、環(huán)狀非陽離子脂肽、線性陽離子脂肽。主要的細(xì)菌脂肽如圖1 所示。其中，環(huán)脂肽構(gòu)成了結(jié)構(gòu)多樣的天然產(chǎn)物家族，主要由鏈霉菌［16］、芽孢桿菌［17］和假單胞菌屬［18］細(xì)菌生物合成。環(huán)脂肽的大部分生物活性歸因于其兩親特性，可作為理想的生物表面活性劑。因此，許多環(huán)脂肽對(duì)于菌群運(yùn)動(dòng)和生物膜的形成至關(guān)重要［19］。其表面活性劑性質(zhì)被廣泛應(yīng)用于石油開采、環(huán)境治理等方面。在結(jié)構(gòu)上，環(huán)脂肽由一個(gè)寡肽和一個(gè)肽連接的N 末端脂肪酸組成。線性或分支的脂肪酰尾巴長(zhǎng)度（通常為C6～C18）和氧化程度可以不同［20］。寡肽（最多25 個(gè)氨基酸）的C 末端與寡肽側(cè)鏈或脂質(zhì)部分中存在的羥基、酚或氨基官能團(tuán)形成內(nèi)酯或內(nèi)酰胺，從而形成大小各異的肽環(huán)（通常為4～16 個(gè)氨基酸）［3］。通過非核糖體肽合成酶（NRPS）生物合成的環(huán)脂肽，寡肽中可以存在非蛋白質(zhì)（如D-構(gòu)型或β-氨基酸）和修飾的氨基酸（如4-氯蘇氨酸）［21］。除了具有生物表面活性劑的性質(zhì)，環(huán)脂肽還表現(xiàn)出有效和具有選擇性的抗細(xì)菌、真菌和細(xì)胞毒性的作用。由Cubist 公司開發(fā)的達(dá)托霉素是為數(shù)不多的新批準(zhǔn)用于治療革蘭氏陽性細(xì)菌感染的抗生素之一［12］。另外，某些芽孢桿菌菌株可以被用做作物保護(hù)中的生物防治劑，產(chǎn)生的環(huán)脂肽可以提高植物的整體適應(yīng)性［17］。

圖1 部分常見的脂肽類型Fig.1 Some common types of lipopeptide

近年來，海洋和沿海環(huán)境已成為發(fā)掘和獲得非核糖體肽的重要來源。Martínez-Nú?ez等［2］通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)海岸沉積物中高表達(dá)NRPS的生物菌群Proteobacteria和Firmicutes，并預(yù)測(cè)和鑒定了NRPS 結(jié)構(gòu)域基因序列。Zhang 等［22］通過同源建模、生物信息學(xué)分析和分子對(duì)接的方法確定了海洋Bacillus atrophaeusC89 非核糖體肽合成酶合成Bacillamide C過程中兩個(gè)腺苷酰化結(jié)構(gòu)域的底物特異性。天然產(chǎn)物生物合成的蛋白質(zhì)組學(xué)策略如次生代謝蛋白質(zhì)組學(xué)（PrISM）［23］、正交活性位點(diǎn)識(shí)別系統(tǒng)（OASIS）［24］等應(yīng)用，以及基于活性NRPS蛋白質(zhì)譜（ABPP）探針的開發(fā)，促進(jìn)了NRPS 基因簇的鑒定和結(jié)構(gòu)域的功能分析［25］。

1.2 天然產(chǎn)物底盤菌株開發(fā)現(xiàn)狀

天然產(chǎn)物底盤菌株構(gòu)建的常見方法包括基因組精簡(jiǎn)與優(yōu)化、各類調(diào)控因子的改造（轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，包括全局調(diào)控因子、途徑專一性調(diào)控因子等）和強(qiáng)化前體物供應(yīng)［26］。其中基因組精簡(jiǎn)和優(yōu)化是最主要和直接的方法。通過刪除同類非目標(biāo)天然產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)途徑中的長(zhǎng)基因簇，以及刪除基于脂肽合成模塊化代謝工程中無用的代謝途徑，可以有針對(duì)性地提高目標(biāo)脂肽的合成效率和質(zhì)量，提高底盤的生產(chǎn)性能。

天然產(chǎn)物底盤菌株需要從生長(zhǎng)周期、轉(zhuǎn)化效率、菌株形態(tài)、遺傳穩(wěn)定性、次級(jí)代謝譜、能量和還原力、異源蛋白合成能力、次級(jí)代謝產(chǎn)物表達(dá)能力等方面進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估［27］。常見的脂肽合成底盤宿主包括鏈霉菌、伯克菌、芽孢桿菌等。這些菌株可以提供生物合成的前體分子，并且對(duì)各自的表面活性終產(chǎn)物表現(xiàn)出足夠的耐受性。而且，由于系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系，它們?cè)邙B嘌呤-胞嘧啶含量和密碼子使用方面具有一系列生產(chǎn)菌株的遺傳相容性［28-29］。隨著基因測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和各種基因發(fā)掘方法的建立和應(yīng)用，很多天然產(chǎn)物包括環(huán)脂肽類物質(zhì)合成基因簇被鑒定出來。但這些基因簇在天然宿主中絕大部分都是沉默的，無法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的最終合成，或者可合成的天然產(chǎn)物產(chǎn)量極低，提取困難，無法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。運(yùn)用合成生物學(xué)的方法建立高效合成脂肽類天然產(chǎn)物的底盤菌株，不但可以改善菌株的遺傳穩(wěn)定性，提高異源表達(dá)，而且可以通過應(yīng)用強(qiáng)度和功能已知且可控的啟動(dòng)子、終止子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控開關(guān)等各種元件對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的合成基因進(jìn)行調(diào)控。重構(gòu)天然產(chǎn)物的合成途徑和基于前體物合成的代謝網(wǎng)絡(luò)可以實(shí)現(xiàn)新型天然產(chǎn)物的開發(fā)。

鏈霉菌是最大的天然產(chǎn)物來源菌。Komatsu等［30］通過簡(jiǎn)化阿維鏈霉菌基因組，構(gòu)建了通用模式底盤菌株Streptomyces avermitilisSUKA17，對(duì)包括NPRS 類化合物Holomycin 在內(nèi)的20 種不同類型的次級(jí)代謝合成基因簇進(jìn)行了異源表達(dá)。Liu等［31］刪除了Streptomycessp.FR-008 三個(gè)內(nèi)源性聚酮合酶（PKS）基因簇，構(gòu)建出一個(gè)相對(duì)干凈的無聚酮合成競(jìng)爭(zhēng)的底盤宿主，為異源表達(dá)天然產(chǎn)物合成基因簇提供了平臺(tái)。Tan 等［32］通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控策略在Streptomycessp.SCSIO 02999 中原位激活了TPM A 的生物合成基因簇，敲除兩個(gè)負(fù)調(diào)控基因（totR3/totR5）和超表達(dá)一個(gè)正調(diào)控基因（totR1），實(shí)現(xiàn)了主產(chǎn)物TPM A 的合成和一個(gè)磺酸化的新產(chǎn)物TPM C 的分離鑒定。為提高工程菌的遺傳穩(wěn)定性，將TPM A 在模式菌株S.lividansTK64 中進(jìn)行異源表達(dá)，結(jié)合基因調(diào)控策略，TPM A 產(chǎn)量提高約6倍。此外，一些海洋生產(chǎn)菌株屬于放線菌進(jìn)化枝，鏈霉菌作為最有價(jià)值的代表，適用于作為一些海洋生物表面活性劑生產(chǎn)的宿主系統(tǒng)，尤其是對(duì)NRPS衍生的化合物［33-34］。

伯克菌是僅次于鏈霉菌的天然產(chǎn)物來源的第二大類細(xì)菌。Wang 等［35］建立了伯克菌DSM 7092 基因組無痕修飾的方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大片段基因簇的敲除，為改造伯克菌為通用底盤菌株提供了基礎(chǔ)。此外，Zhi等［36］通過基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌MT45擁有同類解淀粉芽孢桿菌中更小的基因組和顯著富集的表面活性素（Surfactin）合成途徑，包括中心碳代謝和脂肪酸生物合成。Wu等［37］通過強(qiáng)化Bacillus subtilis168細(xì)胞內(nèi)支鏈脂肪酸合成路徑提高前體物脂肪酸的供應(yīng)，使表面活性素產(chǎn)量提高了20.8 倍。Hühner 等［38］建立釀酒酵母NRPS基因表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行α-酮羧酸二聚體生物合成，為酵母底盤菌株的構(gòu)建提供了借鑒。

2 脂肽合成的模塊結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)

非核糖體肽與核糖體肽不同，復(fù)雜的蛋白結(jié)構(gòu)不受特異性氨基酸序列限制，具有大量潛在而且靈活的結(jié)構(gòu)多樣性。在非核糖體肽生物合成中，氨基酸通過腺苷?；ˋ）結(jié)構(gòu)域進(jìn)行腺苷?；摻Y(jié)構(gòu)域包含特異性識(shí)別元件以選擇正確的摻入基團(tuán)［39］，該基團(tuán)裝載到肽基載體蛋白（PCP）上，通過縮合（C）結(jié)構(gòu)域催化的酰胺化反應(yīng)進(jìn)入肽支架。其他步驟可通過差向異構(gòu)化（E）和甲基化（甲基化酶，MT）結(jié)構(gòu)域催化的PCP 結(jié)合中間體反應(yīng)來進(jìn)行。C 結(jié)構(gòu)域的一個(gè)常見變體是環(huán)化（Cy）結(jié)構(gòu)域，將半胱氨酸、絲氨酸或蘇氨酸等摻入中間體并將其環(huán)化為噻唑啉和唑啉。氧化（Ox）結(jié)構(gòu)域可將這些雜環(huán)分別轉(zhuǎn)化為噻唑和唑。在經(jīng)典NRPS中，遵循共線性規(guī)則，不同亞基選擇性地以非嚴(yán)格共價(jià)的方式相互作用形成最終完整的脂肽合成生產(chǎn)線（圖2）。NRPS亞基間的非共價(jià)相互作用是由專門的N 端和C 端對(duì)接結(jié)構(gòu)域（DD）介導(dǎo)的。研究證明DDs 中氨基酸交換不僅會(huì)導(dǎo)致體外蛋白質(zhì)親和力的變化，而且會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)不同肽的產(chǎn)生［40］。

圖2 用于脂肽合成的非核糖體肽合成酶（NRPS）催化合成脂肽的典型過程Fig.2 Typical processes catalyzed by non-ribosomal peptide synthetase(NRPS)used for lipopeptide synthesis

脂肪酸鏈的裝配和氨基酸的延伸是非核糖體肽合成過程中的重要環(huán)節(jié)。非核糖體肽合成酶每個(gè)模塊激活并修飾一個(gè)特定的氨基酸（aa），然后通過下一個(gè)模塊激活并修飾的aa 對(duì)其進(jìn)行延長(zhǎng)，從而生成長(zhǎng)度取決于所用模塊數(shù)量的肽。典型的NRPS 延伸模塊由1 個(gè)用于激活特定氨基酸的腺苷化（A）結(jié)構(gòu)域，1 個(gè)用于形成肽鍵的縮合（C）結(jié)構(gòu)域和1 個(gè)巰基化（T）結(jié)構(gòu)域組成。脂肽合成在宿主菌中，通過輔助元件促進(jìn)氨基酸修飾、分子伴侶功能、產(chǎn)物輸出和宿主抗性［12］。7 種類型的結(jié)合元件按如下順序連接組裝：長(zhǎng)鏈脂肪酸到L-氨基酸，L-氨基酸到L-氨基酸，L-氨基酸到D-氨基酸，D-氨基酸到L-氨基酸，L-氨基酸到手性氨基酸（如甘氨酸、肌氨酸），手性氨基酸到L-氨基酸，手性氨基酸到D-氨基酸［41］。每一個(gè)氨基酸結(jié)合元件由兩個(gè)功能性模塊組成，每個(gè)模塊至少包括3 個(gè)酶結(jié)構(gòu)域，通過內(nèi)蛋白連接（-）或間蛋白連接肽（：）依次連接（比如CAT-CAT、CAT-CATE、CATE-CAT、CATE：CAT）。連接脂肪酸到氨基酸的元件由脂肪酰連接酶（AL）和?；d體蛋白（ACP）和一個(gè)NRPS 模塊組成（例如AL：ACP：CAT 或者AL-ACP：CAT）。自然界進(jìn)化出3 種類型的C 結(jié)構(gòu)域，分別連接脂肪酸到L-氨基酸、L-氨基酸到L-氨基酸、D-氨基酸到L-氨基酸；同時(shí)也進(jìn)化出3 種T 結(jié)構(gòu)域（或PCP肽基載體蛋白），與上游的AC 結(jié)構(gòu)域和下游的C結(jié)構(gòu)域、與下游的E 和C 結(jié)構(gòu)域、與下游的TE 結(jié)構(gòu)域相互作用［12］。A 結(jié)構(gòu)域類型有多種，決定何種氨基酸將要被綁定、激活和參與到氨基酸的偶聯(lián)過程中。

非核糖體肽合成酶的結(jié)構(gòu)多樣性和各結(jié)構(gòu)域的作用機(jī)制，決定了脂肽合成過程中多種同系物的產(chǎn)生。例如多黏菌素和鐮刀菌素，首先從多黏菌的菌株中分離出來［42］。其中的多黏菌素是由環(huán)狀七肽和被N 末端脂肪酸?；娜膫?cè)鏈組成的家族，包括多黏菌素A、B、D、E 和M［43］。研究表明，多黏菌素B1的藥代動(dòng)力學(xué)與商用購買的多黏菌素B混合物存在顯著差異，單一純組分的藥理學(xué)活性并不能推廣到商業(yè)使用的混合物［44］。不同品牌的多黏菌素雖有類似的組成，但抗菌活性存在差異［45］。藥代動(dòng)力學(xué)發(fā)現(xiàn)盡管脂肽中只有一個(gè)氨基酸差異，多黏菌素A和B與血漿結(jié)合能力低于多黏菌素B1、B2，體內(nèi)清除能力和在腎臟的積累差異明顯，因此對(duì)目前可用于臨床的脂肽商品的組成成分需要更嚴(yán)格的控制和標(biāo)準(zhǔn)化［46］。Roberts等［47］發(fā)現(xiàn)N 末端只有一個(gè)碳差異的多黏菌素B1和E1對(duì)細(xì)胞的體外凋亡作用有顯著差異，與商業(yè)多黏菌素產(chǎn)品相比，單獨(dú)的脂肽組分具有更多的體內(nèi)抗微生物活性。

NRPS 進(jìn)化過程主要包括4 個(gè)種類：復(fù)制和協(xié)同進(jìn)化；通過復(fù)制和重組產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)域N 末端添加；和其他生物合成基因簇（BGCs）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的交換；不同氨基酸特異性結(jié)合位點(diǎn)的快速突變以及多個(gè)過程的組合進(jìn)化［48］。天然產(chǎn)物生物合成的遺傳基礎(chǔ)揭示了遺傳改變引起化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性的重要作用?；贜RPS 進(jìn)化過程，對(duì)NRPS 生產(chǎn)線中的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行非理性改造，重構(gòu)生物合成途徑的遺傳成分可以有效改變脂肽的產(chǎn)品特性和同系物的組分，以及產(chǎn)生“非天然”的天然產(chǎn)物。天然產(chǎn)物類似物可以通過改變不同的合成階段產(chǎn)生，如前體物導(dǎo)向的生物合成、工程化改造合成過程中涉及的巨酶、模塊組裝后的修飾等。通過對(duì)達(dá)托霉素和A54145 NRPS 生產(chǎn)線的改造產(chǎn)生了超過120 種非天然衍生物［12］。通過重組來自不同菌株（Photorhabdus，XenorhabdusandBacillus）NRPS亞基產(chǎn)生了10多種新型脂肽［49］。

3 脂肽合成和調(diào)控研究進(jìn)展

傳統(tǒng)脂肽類似物化學(xué)合成的方法，嚴(yán)重限制了脂肽合成的整體效率，抗菌活性顯著降低，且脂肽結(jié)構(gòu)的多變性不適合化學(xué)合成。同時(shí)化學(xué)合成的過程存在產(chǎn)量少、污染大、成本高等問題［50-51］。脂肽合成結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)改變可以改變氨基酸的種類與數(shù)目，同時(shí)脂肪酸?；敢约翱s合結(jié)構(gòu)域?qū)χ闹舅岬奶禺愋跃哂姓{(diào)控作用（表1）。脂肽合成過程的順利完成會(huì)受到多個(gè)代謝途徑和代謝過程的影響和調(diào)控（圖3）。

圖3 脂肽合成的主要代謝途徑Fig.3 Main metabolic pathways for lipid peptide synthesis

表1 脂肽合成域改造調(diào)控相關(guān)研究Tab.1 Studies on regulation and modification of lipopeptide synthesis domain

3.1 脂肽合成的代謝工程改造

脂肽類天然產(chǎn)物是目前生物制劑研究的熱點(diǎn)［71］，但是長(zhǎng)期以來，成本高、產(chǎn)率低一直是制約脂肽類物質(zhì)微生物合成的難題［72］，利用基因工程技術(shù)和代謝工程方法構(gòu)建高效合成脂肽類物質(zhì)的工業(yè)菌株具有十分迫切的需求。不同于初級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，脂肽類天然產(chǎn)物作為一種重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其代謝網(wǎng)絡(luò)更為復(fù)雜，往往需要多種初級(jí)代謝產(chǎn)物如各種氨基酸、脂肪酸及其衍生物的參與，其合成受到多種途徑特異性因子和復(fù)雜的全局調(diào)控因子調(diào)控。而且大多數(shù)脂肽合成基因簇是沉默的或者表達(dá)效率低，無法高效啟動(dòng)制約著產(chǎn)物的合成。通過優(yōu)化前體代謝、提高脂肽合成基因簇表達(dá)、阻斷脂肽合成競(jìng)爭(zhēng)途徑、各類調(diào)控因子的改造可以有效提高脂肽產(chǎn)品的合成。

研究最多也最為成熟的是表面活性素的合成。Wu 等［37］在模式菌株Bacillus subtilis168 中整合了完整的表面活性素合成酶基因簇sfp，實(shí)現(xiàn)表面活性素從無到有的積累；刪除與生物膜形成相關(guān)的基因和非核糖體多肽合成酶/多酮合成酶途徑來減少競(jìng)爭(zhēng)，表面活性素產(chǎn)量提高3.3 倍；過表達(dá)細(xì)菌自我抗性相關(guān)蛋白，表面活性素產(chǎn)量提高8.5 倍；強(qiáng)化前體支鏈脂肪酸的合成途徑，表面活性素產(chǎn)量提高20.3 倍；強(qiáng)化srfA表達(dá)，使乙酰輔酶A 節(jié)點(diǎn)處的代謝流從細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移到表面活性素生物合成，表面活性素產(chǎn)量進(jìn)一步得到提升。Wang 等［73］通過過表達(dá)B.subtilisTS1726 中生物素羧化酶Ⅱ基因yngH增強(qiáng)脂肪酸的供應(yīng)，表面活性素產(chǎn)量較對(duì)照提升43%，達(dá)到13.37 g/L。此外，Dang等［74］通過過表達(dá)多效性調(diào)節(jié)因子DegQ，使伊枯草菌素（iturin A）的產(chǎn)量提高11.8倍。Xu等［75］利用強(qiáng)啟動(dòng)子PbacA控制iturin A合成酶基因簇，iturin A產(chǎn)量提升132.15%，敲除iturin A合成酶操縱子負(fù)調(diào)節(jié)基因abrB，iturin A產(chǎn)量進(jìn)一步提升19.8%，結(jié)合培養(yǎng)條件優(yōu)化，產(chǎn)量最終達(dá)到（2013.43±32.86）mg/L。Huang 等［76］突變失活負(fù)調(diào)節(jié)基因wblA，達(dá)托霉素（daptomycin）產(chǎn)量提高51%。利用代謝工程策略有效提高了脂肽產(chǎn)品的產(chǎn)量。但是基于前體物導(dǎo)向和調(diào)控因子導(dǎo)向的改造方法，仍無法解決產(chǎn)物中多組分同系物共存或高價(jià)值組分比例低的問題，往往導(dǎo)致發(fā)酵過程和產(chǎn)品批次的不穩(wěn)定，制約著脂肽類化合物產(chǎn)品品質(zhì)的提升。因此，對(duì)脂肽多組分同系物的調(diào)控也格外重要。

3.2 肽鏈氨基酸對(duì)脂肽同系物組分調(diào)控

NRPS 調(diào)控產(chǎn)生新肽產(chǎn)物的研究涉及：①通過激活替代底物的A結(jié)構(gòu)域的替換；②A結(jié)構(gòu)域的底物結(jié)合口袋的改變；③CA 結(jié)構(gòu)域作為不可分割的整體替換（圖3）［77］。A 結(jié)構(gòu)域的取代可以改變NRPS 模塊對(duì)氨基酸底物的選擇性，可以成功提高所需結(jié)構(gòu)類似物的濃度。Uguru 等［78］對(duì)CDA 合成酶中的天冬氨酸A 結(jié)構(gòu)域定向突變導(dǎo)致產(chǎn)生含有天冬酰胺的十二氫萘的肽和一種特殊的線性六肽中間體。Schauwecker 等［52］通過將N-甲基纈氨酸活化結(jié)構(gòu)域取代纈氨酸活化結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致催化非甲基化和N-甲基化?；牡暮铣?。Kim 等［62］第1 次用基因工程的方法對(duì)多黏菌素合成酶進(jìn)行改造，通過在多黏菌素A 編碼基因的基礎(chǔ)上替換多肽鏈上的A 結(jié)構(gòu)域，合成了多黏菌素E、B、P。Kries等［60］通過替換A 結(jié)構(gòu)域的結(jié)合口袋部分，將編碼不同特異性的亞結(jié)構(gòu)域移植到對(duì)Phe特異性的GrsA 模塊中，得到了不同的蛋白。通過交換具有不同氨基酸特異性的外源A 結(jié)構(gòu)域可能導(dǎo)致生產(chǎn)不是后續(xù)生物合成步驟的中間體，另外，A結(jié)構(gòu)域操縱策略可能受到對(duì)受體底物顯示特異性的上游C 結(jié)構(gòu)域的限制［79］。Ackerley 等［80］在pvdD的第1 個(gè)模塊中的結(jié)構(gòu)域替換實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)還有可能的原因是取代結(jié)構(gòu)域的來源不同，或是結(jié)構(gòu)域的取代損壞了上下游的結(jié)構(gòu)，C結(jié)構(gòu)域也可能表現(xiàn)出一定程度的供體位點(diǎn)特異性。盡管對(duì)A 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行替換、突變、刪除、插入等基因操作可以有效改變脂肽中氨基酸的種類和數(shù)量，肽殘基數(shù)量的減少或增加是產(chǎn)生脂肽結(jié)構(gòu)多樣性的替代方法，但是這些操作可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物的產(chǎn)量減小和活性降低。

除了對(duì)氨基酸具有特異性的A結(jié)構(gòu)域外，有些脂肽NRPS模塊中還有特殊的結(jié)構(gòu)域影響脂肽的結(jié)構(gòu)。Duerfahrt 等［54］利用Cy 結(jié)構(gòu)域代替C 結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生新型雜環(huán)二肽。使用重組TE 結(jié)構(gòu)域來催化脂肽區(qū)域特異性環(huán)化是產(chǎn)生具有改進(jìn)性質(zhì)的新化合物的有力方法。de Ferra 等［81］通過將C 末端TE 結(jié)構(gòu)域移位到內(nèi)部結(jié)構(gòu)域來修飾SrfA，從而導(dǎo)致產(chǎn)生新的線性表面活性素類似物。Schwarzer等［69］發(fā)現(xiàn)異源NRPS 的TE 結(jié)構(gòu)域可以選擇性地控制肽鏈的環(huán)化與終止，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣性。

3.3 多結(jié)構(gòu)域?qū)χ耐滴锝M分調(diào)控

通過進(jìn)行多個(gè)結(jié)構(gòu)域的替換，或通過引入腺苷化（A）和硫醇化（PCP）結(jié)構(gòu)域的融合或者腺苷化（A），肽基載體蛋白（T）和縮合結(jié)構(gòu)域（C）的融合，可使多肽中氨基酸重新排列［63］。Mootz 等［70］將目標(biāo)模塊與tyrocidine 合成酶的前兩個(gè)模塊以及硫酯酶結(jié)構(gòu)域融合，獲得預(yù)測(cè)的新型三肽。Duerfahrt 等［82］通過融合包含腺苷化（A），肽基載體蛋白（T）和縮合結(jié)構(gòu)域（C）的Asp 和Phe 激活模塊，實(shí)現(xiàn)了6 種不同的Asp-Phe 合成酶的轉(zhuǎn)錄。因此，應(yīng)該優(yōu)選在PCP和C結(jié)構(gòu)域之間選擇NRPS 模塊的融合體，以使CA 連接完整。通過用分枝桿菌素和黏噻唑菌醇的MbtB 和MtaD 模塊取代支化環(huán)狀噻唑啉NRPSs 中BacA 的第2 個(gè)模塊［54］，將整個(gè)D-羥基苯基甘氨酸模塊插入模塊4和5 之間的巴林霉素中導(dǎo)致生成八肽產(chǎn)物［83］。這些研究主要集中在保持CA 或CAT結(jié)構(gòu)域完整的交換，同時(shí)僅在域間連接區(qū)域進(jìn)行域融合。通過使用基因缺失、基因交換、雙重和三維交換，整個(gè)模塊交換和多模塊交換的組合產(chǎn)生了足夠數(shù)量的新型脂肽抗生素。但是，在多數(shù)情況下僅表現(xiàn)出發(fā)酵過程中最豐富的脂肽成分，新型脂肽以及衍生物占比很低。為了實(shí)現(xiàn)商業(yè)規(guī)模的脂肽生產(chǎn)，運(yùn)用合成生物學(xué)策略，通過工程化生物合成途徑，有望快速提高單一組分脂肽產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量。

3.4 脂肪酸側(cè)鏈對(duì)脂肽同系物組分調(diào)控

脂肪酸鏈以不同的方式整合進(jìn)入脂肽，包括?；o酶A 連接酶和ACP 編碼基因的存在，以及獨(dú)特的N 末端C 結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接到第1 個(gè)氨基酸的載體蛋白質(zhì)結(jié)合［84］。單獨(dú)的酰基轉(zhuǎn)移酶是脂肽的脂肪?；鶕饺胫乃匦璧?，但在一些脂肽基因簇以及基因簇附近未發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)將N 末端脂肪?；B接與脂肽酯化作用的脂肪酸連接酶［85–87］。脂肽基因簇的第1 個(gè)C 結(jié)構(gòu)域（starter C）可能介導(dǎo)脂肪酰基和第1個(gè)氨基酸的連接，在鈣依賴性抗生素（CDA）基因簇中starter C 結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出在其供體位點(diǎn)對(duì)酰基載體蛋白（ACP）的高特異性，在受體位點(diǎn)對(duì)CP 的松弛特異性，但是對(duì)附著的底物具有高選擇性［88］。達(dá)托霉素是一種環(huán)脂肽類抗生素，對(duì)革蘭氏陽性菌具有優(yōu)良抗菌活性。達(dá)托霉素和A54145 具有將長(zhǎng)鏈脂肪酸與第1 個(gè)氨基酸偶聯(lián)的特殊CAT 起始模塊，?；B接酶（AL）和酰基載體蛋白（ACP）參與A21978C 和A54145 生物合成過程中脂肪酸的活化和偶聯(lián)。在玫瑰孢鏈霉菌合成達(dá)托霉素的過程中，A21978C 基因簇中DptE和DptF涉及將長(zhǎng)鏈脂肪酸與氨基酸的偶聯(lián)進(jìn)而引發(fā)A21978C 的生物合成［89］。starter C 結(jié)構(gòu)域之間的異質(zhì)性，反映了不同脂肪酸的物理調(diào)節(jié)或與對(duì)接和轉(zhuǎn)移活化的?；虼?gòu)建脂肽的特定載體蛋白的相互作用［90］。所以，C 結(jié)構(gòu)域中的底物選擇性可能是脂肽合成酶控制和進(jìn)行有效工程化改造的另一個(gè)障礙。通過在脂肽合成途徑之間交換N 末端C 結(jié)構(gòu)域，或者將它們添加到不被?；漠a(chǎn)物NRPS 中，將使脂肪?；腘 末端改造成為可能。脂肪酸側(cè)鏈供給的調(diào)節(jié)是對(duì)脂肽同系物組分調(diào)控策略之一。

目前新型脂肽的合成包括了脂肪酸側(cè)鏈改變下形成的新型脂肽，如N-甲基化和脂肪酸偶聯(lián)合成的具有高效抗菌活性和高蛋白水解穩(wěn)定性的新型蜂毒抗菌肽anoplin 類似物［91］。突變lpdV基因改變了枯草芽孢桿菌對(duì)脂肪酸鏈的選擇性，更傾向于合成表面活性素C14［92］。突變起始縮合結(jié)構(gòu)域的活性位點(diǎn)改變了脂肪酸鏈的特異性，進(jìn)而合成A54145的同系物［93-94］。

3.5 外源添加對(duì)脂肽同系物組分調(diào)控的影響

脂肽的前體脂肪酸除了生物合成外還可以通過初級(jí)代謝來提供，所產(chǎn)生的代謝物的種類根據(jù)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件而變化，所涉及酶的底物特異性的變化導(dǎo)致最終產(chǎn)品性質(zhì)的改變［85］。脂肽側(cè)鏈的分布在一定程度上可以通過加入特定的脂肪酸或氨基酸來調(diào)節(jié)［95］。脂肽同系物的酰基可以通過脂肪酸補(bǔ)充來改變，在發(fā)酵過程中A54145 環(huán)脂肽可以產(chǎn)生大量的同系物，但它們的比例可以通過添加氨基酸（L-Val、L-Ile 或L-Glu）來調(diào)節(jié)，而加入各種中鏈脂肪酸（如己酸、辛酸或壬酸）會(huì)產(chǎn)生新的?；苌铮?6］。Ding 等［97］研究發(fā)現(xiàn)，添加肉豆蔻酸、十五烷酸、棕櫚酸、十七烷酸、十八酸和壬酸等外源烷酸可以促進(jìn)脂肽的產(chǎn)生，增強(qiáng)解淀粉芽孢桿菌Pc3 脂肽粗提物的抗真菌活性，利用奇數(shù)碳鏈長(zhǎng)的烷酸可進(jìn)一步提高解淀粉芽孢桿菌Pc3 中iturin A C15的合成量。外源添加調(diào)控脂肽合成相關(guān)研究見表2。

表2 外源添加調(diào)控脂肽合成相關(guān)研究Tab.2 Studies on regulation of lipopeptide synthesis by exogenous addition

外源添加氨基酸對(duì)脂肽的產(chǎn)量有直接影響。Zhou 等［98］研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加L-Leu 后表面活性素產(chǎn)量顯著增加，而添加D-Leu后表面活性素產(chǎn)量急劇下降，結(jié)果表明L-Leu作為前體或底物參與了表面活性素的合成，而D-Leu可能是競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑抑制了表面活性素的合成。添加L-Asn、L-Pro和L-Ser的復(fù)合氨基酸可提高iturin A 的產(chǎn)量，且外源添加的L-Ser 濃度與iturin A 產(chǎn)量呈正相關(guān)，說明L-Ser 是iturin A 生物合成途徑中的限速化合物［99］。L-Ile 的加入極大提高了多黏菌素B1 的比例，而L-Glu 和L-Gly 存在時(shí)多黏菌素D1和D2含量顯著增加［100］。通過補(bǔ)充氨基酸（L-Ala、L-Arg、L-His、L-Cys、L-Asn、L-Gln、L-Ser 和L-Thr）會(huì)以濃度依賴性方式刺激多黏菌素D1和D2的產(chǎn)生，而低濃度（0.5 mmol/L）的L-Lyr有利于多黏菌素D的合成，多種多黏菌素D 類似物顯著低于多黏菌素D1和D2［87］。這些研究表明，氨基酸添加對(duì)多黏菌素等環(huán)脂肽同系物組分的調(diào)控至關(guān)重要。

Bartal 等［101］研究表明使用葡萄糖以外的碳源對(duì)表面活性素產(chǎn)量也會(huì)產(chǎn)生影響，而且在某些情況下表現(xiàn)出選擇性。添加麥芽糖、纖維二糖和蔗糖分別對(duì)1 個(gè)（C16）、2 個(gè)（C13、C16）和4 個(gè)（C13、C14、C17、C18）組有顯著的負(fù)面影響，甘露醇和乙醇的使用分別增加了C15和C15-C16組的相對(duì)量，但也使某些組的合成減少。此外，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同的金屬離子可以通過促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、影響氮利用和其他可能的未知機(jī)制來顯著影響脂肽的產(chǎn)量［102］。Lin 等［103］通過添加亞鐵離子提高了解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)iturin A 的能力。Cooper等［104］研究發(fā)現(xiàn)錳和鐵鹽的加入可以提高表面活性素的產(chǎn)量。Bartal 等［101］研究表明金屬離子的使用對(duì)表面活性素的影響較大，并且發(fā)現(xiàn)了第5 位含有AME5 的表面活性素同系物。其檢測(cè)結(jié)果還表明金屬離子促進(jìn)了更長(zhǎng)脂肪酸鏈的脂肽化合物產(chǎn)生，產(chǎn)物中有2/3 是C16、C17或C18的表面活性素同系物。

4 幾種常見環(huán)脂肽的合成調(diào)控

4.1 多黏菌素

多黏菌素（polymyxin）是由多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）產(chǎn)生的一組多肽類抗生素。對(duì)大多數(shù)革蘭氏陰性菌有抑制作用。多黏菌素的肽鏈由10 個(gè)氨基酸組成，結(jié)構(gòu)上為線性三肽連接環(huán)狀七肽，不同位點(diǎn)氨基酸種類和構(gòu)型的差異形成了不同的多黏菌素同系物。多黏菌素氨基酸序列為：L-Dab-L-Thr-3-L-Dab-L-Dab-6-7-LDab-L-Dab-L-Thr。其中前3 位的氨基酸呈線形連接，后7 位的氨基酸呈環(huán)形。第3、6、7 位氨基酸的不同決定了其同系物的種類（表3）。對(duì)多黏菌素NRPS 的部分結(jié)構(gòu)域進(jìn)行改造，可以達(dá)到改變產(chǎn)物中多黏菌素同系物比例的目的（圖4）。Yuan 等［109］通過替換P.polymyxaCJX518 中多黏菌素合成酶基因簇pmxA中的A 結(jié)構(gòu)域和pmxE中的C 結(jié)構(gòu)域，獲得了B1 組分提高，Ile-P-B1 和B3組分降低的重組菌株。Kim 等［62］通過將P.polymyxaE681 中第7 位L-Thr 特異性的A 結(jié)構(gòu)域替換為來自P.polymyxaATCC 21 830 中L-Leu 特異性的A 結(jié)構(gòu)域，第6 位D-Leu 特異性的A 結(jié)構(gòu)域替換為來自P.polymyxaF4 的D-Phe 特異性的A結(jié)構(gòu)域，在B.subtilisBSK4dA 中表達(dá)并成功合成了polymyxin B 和E。

圖4 多黏菌素合成的NRPS結(jié)構(gòu)域改造Fig.4 Modification of NRPS domain of polymyxin synthesis

表3 多黏菌素同系物化學(xué)結(jié)構(gòu)Tab.3 Chemical structure of polymyxin homologues

4.2 表面活性素

表面活性素的肽鏈包含7 個(gè)氨基酸，序列為L(zhǎng)-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Val-L-Asp-D-Leu-L-Leu，首位的L-Glu 和第7 位的L-Leu 連接形成七肽環(huán)［110］。表面活性素肽環(huán)的第2、3、4、6、7位氨基酸為疏水性氨基酸，第1、5 位為親水性氨基酸。與多黏菌素不同，表面活性素的肽環(huán)比較穩(wěn)定，由肽環(huán)氨基酸改變形成的表面活性素同系物較少。表面活性素肽環(huán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)見表4。Stachelhaus 等［65］通過同源重組靶向替換了B.subtilissrfA 操縱子中的氨基酸激活結(jié)構(gòu)域。Schneider 等［111］在B.subtilis中通過體內(nèi)重組的方式將亮氨酸激活模塊替換為鳥氨酸激活模塊，將鳥氨酸直接結(jié)合在肽環(huán)第2 位，形成了實(shí)質(zhì)性的肽環(huán)構(gòu)象變化。Eppelmann 等［67］通過比較和同源建模分析了NRPSs 的底物選擇性編碼序列，而后對(duì)表面活性素合成酶的srfA 序列進(jìn)行定點(diǎn)突變，合理地改變了NRPS 模塊的底物特異性。Jiang 等［112］敲除了B.subtilisBP2-L1 中 的SrfA-A-Leu、SrfA-B-Asp 和SrfA-B-Leu 模塊，其中敲除了第6 位Leu 的表面活性素變體表現(xiàn)出更顯著的抗真菌活性。

表4 表面活性素同系物化學(xué)結(jié)構(gòu)Tab.4 Chemical structure of surfactin homologues

4.3 豐原素

豐原素的肽環(huán)結(jié)構(gòu)類似于多黏菌素，由線性二肽連接環(huán)狀八肽而成。第3 位和第10 位氨基酸之間以內(nèi)酯鍵成環(huán)［113］。豐原素肽鏈氨基酸序列為L(zhǎng)-Glu-D-Orn-3-4-L-Glu-6-L-Pro-L-Gln-9-10。根據(jù)已有的報(bào)道，第3、4、6、9、10 位的氨基酸決定了豐原素的不同構(gòu)型。fengycin A 和fengycins B 是最常見的兩種亞型，它們的氨基酸序列為L(zhǎng)-Glu-D-Orn-D-Tyr-D-Thr-L-Glu-6-L-Pro-LGln-L-Thr-L-Ile。區(qū)別在于第6 位的氨基酸，fengycin A 是 D-Ala，fengycin B 是 D-Val。fengycin C 是fengycins 家族的一個(gè)新亞型，由一個(gè)七肽鏈和脂肪酸鏈相連而成。其氨基酸序列為：L-Glu-D-Orn-D-Tyr-D-Thr-L-Glu-D-Val-L-Pro-L-Gln-D-Thr-L-Ile。fengycin C 在第9 位的氨基酸與fengycin B 不同，在第6 位和第9 位的氨基酸與fengycin A 不 同［114］。fengycin S 分離自B.amyloliquefaciens，與fengycin B 相比，該亞型在第4 位 是D-Ser，而不是D-allo-Thr［115］。豐原素同系物見表5。

表5 豐原素同系物化學(xué)結(jié)構(gòu)Tab.5 Chemical structure of fengycin homologues

plipastain 是fengycin 的一類重要同系物，其氨基酸序列為L(zhǎng)-Glu-D-Orn-L-Tyr-D-allo-Thr-L-Glu-D-Ala/Val-L-Pro-L-Gln-D-Tyr-L-Ile［116］。plipastain 同樣包含幾種不同的同構(gòu)型，plipastain A 和plipastain B 在第6 位氨基酸分別為 D-Ala 和 D-Val［117］。Ma 等［118］從B.amyloliquefaciensSH-B74 的發(fā)酵液中分離鑒定出plipastain A1，其氨基酸序列為L(zhǎng)-Glu-D-Orn-L-Tyr-L-Glu-D-Ala-L-Pro-L-Gln-D-Tyr-L-Ile。Gao 等［116］通過單個(gè)結(jié)構(gòu)域缺失策略來設(shè)計(jì)plipastain 的生物合成途徑，生成了新型的線性五肽、六肽的plipastain 衍生物。將plipastain 合成酶的TE 結(jié)構(gòu)域前移到上一個(gè)模塊的T 域位置，從而合成預(yù)測(cè)的線性肽鏈plipastain 衍生同系物，同時(shí)揭示了plipastain TE 結(jié)構(gòu)域在NRPS 合成酶系中的區(qū)域選擇性［119］。

4.4 達(dá)托霉素

達(dá)托霉素是鈣依賴性環(huán)狀脂肽類抗生素A21978C 組分中的一種，最初從玫瑰孢鏈霉菌（S.roseosporus）的發(fā)酵液中分離出來，對(duì)多種革蘭氏陽性菌均顯示出優(yōu)異的活性，但對(duì)革蘭氏陰性菌則無活性。達(dá)托霉素和脂肽A21978C 組的所有其他成分是通過相同的模塊化非核糖體合成酶系統(tǒng)合成的，并包含相同的肽部分。它們之間唯一不同的結(jié)構(gòu)部分是N 末端連接的脂肪?；鶜埢?。常見肽段包含13 個(gè)氨基酸，其中6 個(gè)非蛋白質(zhì)氨基酸：D-Asn2，鳥氨酸（Orn6），D-Ala8，D-Ser11，（2S，3R）-谷氨酸甲酯（MeGlu12）和犬尿氨酸（Kyn13）。C 末端的10 個(gè)氨基酸形成一個(gè)大環(huán)核心，該核心在Thr4的側(cè)鏈與C 末端Kyn13的α-COOH 之間包含一個(gè)閉環(huán)酯鍵。N 末端三肽從環(huán)突出，并帶有可變的脂肪?；鶜埢摎埢cTrp1相連［120］。脂肪?；鶜埢男再|(zhì)會(huì)影響抗菌活性和毒性，其衍生物的挖掘也主要通過改變不同的脂肪酸側(cè)鏈來進(jìn)行，而氨基酸的改變往往導(dǎo)致活性和產(chǎn)量的下降［121］。發(fā)酵過程中通過外源添加不同的脂肪酸或脂肪酸酯可以被反異構(gòu)十一烷酰、反式十二烷酰、反異構(gòu)十三烷酰等基團(tuán)替代，得到新的達(dá)托霉素型衍生物［122］。達(dá)托霉素同系物見表6。

表6 達(dá)托霉素及其同系物Tab.6 Schematic diagram of daptomycin and its homologues

4.5 伊枯草菌素

伊枯草菌素是一種主要由芽孢桿菌產(chǎn)生的抗生素環(huán)脂肽，具有溶血和抗真菌的特性。伊枯草菌素的肽鏈包含7 個(gè)氨基酸，經(jīng)典的氨基酸序列為 L-Asn-D-Tyr-D-Asn-L-Gln-L-Pro-D-Asn-L-Ser，其中第5 位和第7 位氨基酸可變性較強(qiáng)［123］。伊枯草菌素包含眾多的同系物，包括iturin A、iturin C、iturin D、bacillomycin D、bacillomycin F、mycosubtilin。目前雖然對(duì)伊枯草菌素模塊與結(jié)構(gòu)域間的作用已經(jīng)研究清楚，但對(duì)于修飾改造其肽鏈氨基酸生成新型同系物的研究還比較少，因此在未來的研究中可嘗試針對(duì)性的研究。伊枯草菌素同系物見表7。

表7 伊枯草素同系物化學(xué)結(jié)構(gòu)Tab.7 Chemical structure of iturin homologues

脂肽家族成員眾多，除了上述5 種環(huán)脂肽外，對(duì)其他脂肽結(jié)構(gòu)域的改造也有許多研究，既包括常見的結(jié)構(gòu)域替換、刪除，也有對(duì)其進(jìn)行點(diǎn)突變和模塊融合的研究。通過對(duì)氨基酸激活模塊以及脂肪酸整合模塊進(jìn)行修飾和再造，可以得到一些活性或產(chǎn)量提高的產(chǎn)物、有用組分增大的同系混合物以及新型脂肽等。

5 混菌對(duì)脂肽生物合成的影響

目前，人工混菌研究已從混菌組成的生態(tài)關(guān)系向提升混菌合成功能產(chǎn)品的效率方向發(fā)展。針對(duì)脂肽生物活性物同系物組分多、功能可控性差、產(chǎn)量低問題，進(jìn)行人工微生物混菌系統(tǒng)的構(gòu)建，可以解決前體物質(zhì)水平與脂肽同系物復(fù)雜性之間的關(guān)系，同時(shí)可能提高多細(xì)胞體系的代謝功能和效率，實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng)微生物無法完成的任務(wù)。在群體效應(yīng)等細(xì)菌群體行為調(diào)控機(jī)制中，鏈霉菌可接受其他細(xì)菌產(chǎn)生的小分子信號(hào)物質(zhì)，以及在環(huán)境脅迫等多重壓力下可自發(fā)激活次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇的表達(dá)［124］。Steptomyces endusS-522 和Tsukamurella pulmonisTP-B0596的共培養(yǎng)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生新的抗生素alchivemycin A［125］。將環(huán)境中產(chǎn)生表面活性素的地衣芽孢桿菌和假單胞菌菌種與生物膜形成菌株（銅綠假單胞菌和無病李斯特菌）混合發(fā)酵可以促進(jìn)表面活性素產(chǎn)量的提升［126］。Wo?niak?Karczewska 等［127］發(fā)現(xiàn)不同菌群間的群體效應(yīng)和混菌培養(yǎng)影響生物表面活性素同系物的形成?；炀w系的豐富性也賦予其更強(qiáng)的生物防治、石油降解等能力。B.amyloliquefaciensACCC11060和T.asperellumGDFS1009 共培養(yǎng)，使抗菌脂肽對(duì)真菌B.cinerea抑制能力的顯著提升［128］。B.subtilisSPB1 和A.radioresistens RI7 菌株混合培養(yǎng)時(shí)，可將柴油降解率提高到55.4%［129］。人工構(gòu)建脂肽合成的生態(tài)系統(tǒng)（多細(xì)胞體系）將擴(kuò)大脂肽類物質(zhì)的生產(chǎn)和應(yīng)用潛能。

6 合成生物學(xué)用于脂肽合成的研究

合成生物學(xué)是一門綜合的學(xué)科，以傳統(tǒng)生物學(xué)獲得的知識(shí)和材料為基礎(chǔ)，利用系統(tǒng)生物學(xué)的手段對(duì)其加以定量的解析，在工程學(xué)和計(jì)算機(jī)的指導(dǎo)下設(shè)計(jì)新的生物系統(tǒng)或?qū)υ猩锵到y(tǒng)進(jìn)行深度改造。由于NRPSs 多模塊多酶的復(fù)雜性，導(dǎo)致來自非核糖體肽合成酶的新次生代謝產(chǎn)物的組合生物合成一直處于緩慢發(fā)展。環(huán)脂肽類天然產(chǎn)物含有多種組分，其組成和結(jié)構(gòu)影響整體生物活性［130］。運(yùn)用合成生物學(xué)策略對(duì)非核糖體肽合成酶異源表達(dá)實(shí)現(xiàn)環(huán)二肽的生物合成［131］，由3 個(gè)非核糖體肽合成酶（OctA、OctB、OctC）合成的脂肽（octapeptin，八肽菌素）能有效抗革蘭氏陰性耐藥菌［9］。對(duì)NRPS合成操縱子的生物信息學(xué)分析可以較為直觀地分析不同脂肽同系物合成序列的差異，將組合生物合成技術(shù)與序列比對(duì)、同源建模等方法結(jié)合起來，定向地對(duì)NRPS 合成酶進(jìn)行改造，從而達(dá)到精準(zhǔn)合成預(yù)測(cè)產(chǎn)物的目的。

隨著基因組裝技術(shù)的發(fā)展，更加靈活和精準(zhǔn)的方法應(yīng)用于脂肽合成中模塊結(jié)構(gòu)域的改造，距離人工設(shè)計(jì)脂肽肽鏈構(gòu)型生物精準(zhǔn)合成的目標(biāo)也日益趨近。Yan 等［49］基于type IIS 限制性內(nèi)切酶酶切克隆的方法創(chuàng)造了通過質(zhì)粒高效組裝NRPS 生產(chǎn)線的方法，可以輕松實(shí)現(xiàn)對(duì)各功能結(jié)構(gòu)域的替換，促進(jìn)了新型生物合成基因簇的開發(fā)和藥物發(fā)掘。因此，運(yùn)用合成生物學(xué)策略合成NRPSs的標(biāo)準(zhǔn)化元件和模塊生產(chǎn)新結(jié)構(gòu)脂肽，結(jié)合微生物基因組挖掘?qū)U(kuò)大NRPS源天然產(chǎn)物藥物范圍和提升新藥的發(fā)現(xiàn)速度，利用合成生物學(xué)在工程化的釀酒酵母中設(shè)計(jì)完成多細(xì)胞真菌復(fù)雜的生物合成，將加快非核糖體肽抗生素理性工程化合成。此外，利用合成生物學(xué)思想設(shè)計(jì)與構(gòu)建基于前體物導(dǎo)向和脂肽合成模塊的不同功能分工的人工細(xì)胞，通過群體機(jī)制反饋指導(dǎo)不同分工細(xì)胞內(nèi)模塊的集成原則，提高菌群協(xié)作和性能也將促進(jìn)生物合成脂肽類活性物質(zhì)的開發(fā)。

7 總結(jié)與展望

環(huán)脂肽作為抗生素、生物表面活性劑等，在生物防治、藥物開發(fā)、環(huán)境修復(fù)和疾病治療等方面廣泛應(yīng)用，具有迫切的市場(chǎng)需求和廣闊的發(fā)展前景。特別是脂肽類抗生素因其臨床耐藥菌株的出現(xiàn)概率極低、可生物降解、多生物活性（抗菌、抗腫瘤、抗病毒等）、無交叉耐藥性等特點(diǎn)，在抑菌藥物中引起廣泛關(guān)注，預(yù)計(jì)未來10 年批準(zhǔn)用于臨床的脂肽類抗生素的數(shù)量將會(huì)不斷增加［20］。同時(shí)，脂肽的生物合成還存在產(chǎn)量低、多種同系物共存以及產(chǎn)品和菌株特性造成的發(fā)酵過程難控等問題，限制脂肽類抗生素的工業(yè)化和商品化生產(chǎn)。本文綜述了環(huán)脂肽生物合成的研究進(jìn)展，為進(jìn)一步研究和開發(fā)脂肽類的應(yīng)用提供依據(jù)。

目前，利用微生物生產(chǎn)脂肽類天然產(chǎn)物還存在一些困難，其中包括：①很多生產(chǎn)菌不能被培養(yǎng)，或是不能進(jìn)行基因改造；②具有功能的潛在的生物合成基因簇（BGCs）需要進(jìn)行克隆，或是通過合適的外源宿主進(jìn)行表達(dá)和基因工程改造；③由于復(fù)雜的細(xì)菌以及分子量龐大的BGCs基因，進(jìn)行克隆、途徑改造和構(gòu)建重組文庫時(shí)存在困難；④在外源宿主中產(chǎn)量低，可能是由于轉(zhuǎn)錄效率低、蛋白質(zhì)不正確折疊等原因。通過對(duì)野生菌株的實(shí)驗(yàn)室馴化，利用和開發(fā)先進(jìn)的基因編輯工具，構(gòu)建合適的外源宿主等方法可以加快脂肽類天然產(chǎn)物的開發(fā)，強(qiáng)化其生物合成過程，解決基因表達(dá)和產(chǎn)物合成中的一些難點(diǎn)問題。DNA測(cè)序技術(shù)的迭代發(fā)展為菌株基因組的解析和基因簇蛋白功能的分析創(chuàng)造了有利的條件，以合成生物學(xué)中“設(shè)計(jì)”“構(gòu)建”“系統(tǒng)”“標(biāo)準(zhǔn)化”的工程化思想為指導(dǎo)構(gòu)建脂肽合成的人工細(xì)胞是今后研究脂肽物質(zhì)生物合成的重要方向。

環(huán)脂肽多組分同系物嚴(yán)重限制它們的應(yīng)用，特別是在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。就脂肽同系物組分人工調(diào)控而言，無論是不同功能結(jié)構(gòu)域與同系物組分的相關(guān)性，還是前體供給與脂肽同系物組分和功能間的關(guān)系，有關(guān)獲取脂肽單一組分的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，特別是人工微生物混菌系統(tǒng)來調(diào)控脂肽同系物組分的研究尚未見報(bào)道，因此，進(jìn)行底盤優(yōu)越的人工合成體系的研究勢(shì)在必行。建立脂肽多組分同系物生物合成的人工調(diào)控策略，獲得可控的單一組分脂肽，提高其抗菌活性、降低脂肽同系物組分的生物毒性，具有重要理論意義和實(shí)際價(jià)值。因此，在今后的研究工作中，有必要開展脂肽同系物單一組分生物合成人工調(diào)控的分子機(jī)制研究，為尋求脂肽同系物單一組分可控、高效合成的人工混菌系統(tǒng)工程改造和構(gòu)建提供理論依據(jù)。為擴(kuò)大環(huán)脂肽的應(yīng)用領(lǐng)域，利用合成生物學(xué)技術(shù)開展原料高效利用、復(fù)雜底物響應(yīng)機(jī)制和代謝途徑優(yōu)化研究，尋找廉價(jià)底物用于環(huán)脂肽的合成，將是降低環(huán)脂肽生產(chǎn)成本的重要途徑之一。此外，脂肽類物質(zhì)在反應(yīng)器放大培養(yǎng)過程中還存在泡沫多、發(fā)酵過程穩(wěn)定性差等問題，對(duì)發(fā)酵設(shè)備、發(fā)酵工藝和過程調(diào)控都具有較高的要求，通過設(shè)計(jì)和運(yùn)用新型消泡生物反應(yīng)器可以有效強(qiáng)化脂肽產(chǎn)品的發(fā)酵過程和提高過程的穩(wěn)定性。隨著合成生物技術(shù)的迅速發(fā)展和運(yùn)用，結(jié)合傳統(tǒng)的代謝工程和發(fā)酵工程手段的延伸，應(yīng)用于脂肽類天然產(chǎn)物的微生物合成也有望實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品“質(zhì)”和“量”的提升。

致謝：謹(jǐn)以此文致敬Daniel I.C.Wang 教授在基因工程及生化工程等領(lǐng)域的開創(chuàng)性貢獻(xiàn)。