周 力，李雪清,2，孫永剛，高占紅，桂林生*

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016)

【研究意義】作為線粒體內(nèi)膜中陰離子載體的一個(gè)亞組，解偶聯(lián)蛋白家族(uncoupling proteins, UCPs)主要通過轉(zhuǎn)運(yùn)線粒體外膜中的質(zhì)子，抑制Adenosine Triphosphate(ATP)和 Reactive oxygen(ROS)的產(chǎn)生，進(jìn)而參與機(jī)體的能量代謝進(jìn)程[1]。該家族包括7個(gè)成員，分別為UCP1，UCP2，UCP3，UCP4，BMCP1，StUCP和AtUCP。其中，UCP3主要定位于骨骼肌線粒體中，同時(shí)在脂肪及心臟的線粒體中也存在一定量的表達(dá)[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究證實(shí)，UCP3能夠轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸、脂質(zhì)過氧化物和丙酮酸等，調(diào)控脂肪酸儲(chǔ)存水平及細(xì)胞抗氧化能力。在小鼠骨骼肌中過表達(dá)UCP3后，能夠顯著提高小鼠的運(yùn)動(dòng)量及能量消耗，同時(shí)大幅減少氧化應(yīng)激[3]。相較于正常的小鼠，過表達(dá)UCP3的小鼠在飼喂高脂日糧后表現(xiàn)出更好的葡萄糖耐受性以及更少的睪脂沉積[4]。相反，特異性敲除肌肉組織中的UCP3基因，小鼠的體重升高同時(shí)其肝臟中糖原貯存能力增強(qiáng)[5]。轉(zhuǎn)錄因子Forkhead box O 1(FOXO1)定位于細(xì)胞核中，也被稱為FKHR，屬于叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族的FOXO亞家族，在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪代謝過程中扮演重要的角色。肥胖患者內(nèi)臟脂肪組織中FOXO1表達(dá)量顯著高于正常個(gè)體[6]。FOXO1能夠通過與HMGA1相互作用，調(diào)控與胰島素代謝密切相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而維持肝臟中葡萄糖代謝平衡[7]。作為傳統(tǒng)中藥成分，葛根芩連湯能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞中Silent Information Regulator 1(SIRT1)的表達(dá)，并下調(diào)FOXO1的表達(dá)水平，最終調(diào)控小鼠體內(nèi)甘油三酸酯，血糖及胰島素水平[8]。雌性動(dòng)物體內(nèi)的雌激素(Estrogen)可以通過激活ERα-PI3K-Akt信號(hào)通路來抑制FOXO1的表達(dá)水平，進(jìn)而降低小鼠體內(nèi)的葡萄糖異生作用[9]。此外，1,25二羥基維生素D3通過降低成骨細(xì)胞中FOXO1的表達(dá)，阻止FOXO1向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，抑制高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞的異常增殖和凋亡，最終改善成骨細(xì)胞的代謝[10]。類似的，白藜蘆醇能夠通過負(fù)調(diào)控sirt1/FOXO1通路，緩解高糖對(duì)成骨細(xì)胞分化的抑制作用[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鑒于UCP3和FOXO1與生物機(jī)體中糖脂代謝緊密關(guān)聯(lián)，筆者推測這些基因可能會(huì)直接或間接影響動(dòng)物的生長發(fā)育。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以UCP3和FOXO1為研究目標(biāo)，檢測其單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisins，SNPs)及合并基因型對(duì)早勝牛生長發(fā)育的影響，以期為早勝牛分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在同等飼養(yǎng)條件下，隨機(jī)選擇24～36月齡健康的早勝牛419頭，采樣地點(diǎn)為甘肅省慶陽，所有個(gè)體于清晨空腹采集頸靜脈樣本，置于抗凝采血管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｋ性囼?yàn)牛無親緣關(guān)系。為減少采樣次數(shù)及采樣季節(jié)等因素對(duì)結(jié)果造成的誤差，本試驗(yàn)樣品采集于2019年7月，一次性采集樣品。同時(shí)，記錄樣本個(gè)體的體重、體斜長、體高、胸圍等生長發(fā)育指標(biāo)。采用血液基因組DNA提取試劑盒(天根，北京)提取血液DNA，然后使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測DNA的濃度及純度，確保樣品DNA濃度大于50 ng/L，OD206/OD208處于1.8～2.0。

1.2 UCP3和FOXO1基因PCR擴(kuò)增

根據(jù) GenBank 公布的牛UCP3序列(AC-000172.1)和FOXO1的序列(AC-000169.1), 利用 Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司負(fù)責(zé)合成。引物信息詳見表1。

表1 引物序列信息

PCR反應(yīng)體系30.0 μL，包括Mix混合液(天根，北京)15.0 μL，ddH2O 11.8 μL，上游、下游引物各(10 pmol/μL)0.6 μL、DNA(50 ng/μL)2.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。

1.3 突變位點(diǎn)檢測

分別從每種PCR產(chǎn)物中隨機(jī)選取8個(gè)樣本進(jìn)行混合并構(gòu)建DNA池，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行對(duì)比分析，尋找突變位點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用在線軟件(http://www.msrcall.com/Gdicall.aspx)計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量(polymorphism information content, PIC)，并進(jìn)行Hard-Weinberg平衡適應(yīng)性檢驗(yàn)。使用SPSS(13.0 version)軟件中一般線性模型方法(General linear models)分別對(duì)UCP3和FOXO1的突變位點(diǎn)基因型與早勝牛生長發(fā)育指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，整個(gè)樣本群體的年齡劃分為4個(gè)階段，分別為24～27月齡，28～30月齡，31～33月齡和34～36月齡。計(jì)算模型中基因型及年齡設(shè)定為固定效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 UCP3和FOXO1基因型分析

牛UCP3位于第15號(hào)染色體上，基因全長10 520 bp，含6個(gè)外顯子，5個(gè)內(nèi)含子(圖2)。通過測序分析發(fā)現(xiàn)，UCP3存在3個(gè)SNP位點(diǎn)，分別是定位于第2內(nèi)含子上的g.4439G>A，第3外顯子上的g.4899G>A和第4內(nèi)含子上的g.5575G>A。其中，g.4439G>A位點(diǎn)僅存在GG和GA兩種基因型，可能與樣本的采集規(guī)模相關(guān)。牛FOXO1位于第12號(hào)染色體上，基因全長93 786 bp，含3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子(圖3)。該基因3’側(cè)翼區(qū)檢測到1個(gè)SNP，命名為g.92209C >T。

由于本試驗(yàn)中檢測到的4個(gè)突變位點(diǎn)均沒有合適的限制性內(nèi)切酶，故本試驗(yàn)采用DNA直接測序法進(jìn)行基因型分型。表2顯示了這4個(gè)突變位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量以及Hardy Weinberg 平衡狀態(tài)。結(jié)果顯示，UCP3的3個(gè)突變位點(diǎn)，GG均為優(yōu)勢基因型，且G是優(yōu)勢等位基因；FOXO1的g.92209C >T上，CC為優(yōu)勢基因型，T為優(yōu)勢基等位因?？ǚ綑z驗(yàn)表明，這兩個(gè)基因上的4個(gè)突變位點(diǎn)都處于Hardy Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。此外，g.4439G>A和g.4899G>A處于低度多態(tài)水平(PIC<0.25)，而g.5575G>A和g.92209C >T則處于高度多態(tài)水平(PIC> 0.25)。

表2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.2 UCP3和FOXO1不同基因型對(duì)早勝牛生長發(fā)育的影響

關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果(表3)顯示，UCP3上的g.5575G>A位點(diǎn)不同基因型顯著影響體重和胸圍，GG基因型的體重均值極顯著高于AA型(P<0.01)，GG基因型的胸圍均值顯著高于AA型(P<0.05)。FOXO1上的g.92209C>T位點(diǎn)上的CC基因型生長發(fā)育性狀表現(xiàn)最優(yōu)，體重方面，CC基因型極顯著高于TT基因型(P<0.01)；胸圍方面，CC基因型個(gè)體的胸圍顯著大于TT基因型(P<0.05)。

表3 UCP3和FOXO1不同基因型對(duì)早勝牛生長發(fā)育性狀的影響

2.3 UCP3和FOXO1基因合并基因型對(duì)早勝牛生長發(fā)育性狀的影響

2個(gè)基因中4個(gè)位點(diǎn)存在5種發(fā)生頻率高于5.00%合并基因型。表4顯示，GG-GG-GG-CC發(fā)生頻率最高，達(dá)到21.00%，其次為GG-GG-GG-CT和GG-GG-GA-CC，頻率分別為17.18%和9.54%。利用合并基因型方差分析模型分析不同合并基因型對(duì)早勝牛生長發(fā)育性狀的影響，表5結(jié)果顯示，合并基因型GG-GG-GG-CT個(gè)體的體重極顯著高于GG-GA-GA-CC個(gè)合并基因型(P<0.01)，但在體斜長、體高和胸圍方面，合并基因型各組之間差異不顯著(P>0.01)。因此，在本試驗(yàn)群體中，GG-GG-GG-CT在早勝牛體重方面可被視為一種最為優(yōu)秀的合并基因型。

表4 早勝牛UCP3和FOXO1合并基因型分布情況

表5 UCP3-FOXO1合并基因型對(duì)早勝牛生長發(fā)育性狀的影響

3 討 論

作為世界上黃牛品種數(shù)最多的國家，中國現(xiàn)有黃牛品種53個(gè)，其中以秦川牛、南陽牛、魯西牛、晉南牛和延邊牛5大品種最具代表[12]。早勝牛主要分布于甘肅省，是甘肅省主要的黃牛種質(zhì)資源，具有耐粗飼，抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，同時(shí)也存在中國黃牛品種普遍具有的缺點(diǎn)，如生長發(fā)育緩慢，后驅(qū)欠發(fā)達(dá)。目前，針對(duì)早勝牛的分子輔助標(biāo)記選育的研究比較少。因此，本研究選擇兩個(gè)與糖脂代謝緊密關(guān)聯(lián)的候選基因，首次探究這些基因的多態(tài)性與早勝牛生長發(fā)育相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)性。盡管目前在其它黃牛品種中已有相關(guān)研究，但SNP突變的發(fā)生及其發(fā)生頻率受到諸多因素的影響，如品種、年齡、飲食和環(huán)境均可能引起基因發(fā)生堿基突變，這意味著同一品種黃牛生活環(huán)境或者飼喂管理的不同都可能造成其基因堿基突變差異化。在前人的研究基礎(chǔ)之上，本研究選擇年齡和飼喂管理相似的早勝牛，檢測在甘肅省早勝牛特定生活環(huán)境下，與其生長發(fā)育性狀緊密關(guān)聯(lián)的UCP3和FOXO1 SNP位點(diǎn)。

UCP3廣泛存在于哺乳動(dòng)物的各個(gè)組織器官中，在基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及翻譯后修飾等多個(gè)水平上維持機(jī)體能量平衡[13]。在小鼠和人上研究證實(shí)，禁食、低碳水化合物飲食、高飲食以及急性運(yùn)動(dòng)均能夠誘導(dǎo)骨骼肌中的UCP3表達(dá)水平提高，同時(shí)伴隨血漿脂肪酸水平顯著升高，說明UCP3在滿足機(jī)體對(duì)脂肪酸氧化需求方面發(fā)揮重要的作用[14-16]。目前，UCP3在畜禽方面的功能研究較少，通過軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)關(guān)嶺牛UCP3啟動(dòng)子區(qū)域呈現(xiàn)高度保守性，可能MZF1、GATA以及C/EBP等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合[17]。飼喂白藜蘆醇后發(fā)現(xiàn)，杜長大豬脂肪中UCP3表達(dá)水平顯著升高，證實(shí)UCP3能夠促進(jìn)脂肪酸氧化，進(jìn)而減少脂肪沉積[18]。前期試驗(yàn)證實(shí)，在秦川牛UCP3的第3外顯子上檢測到2個(gè)突變位點(diǎn)，分別命名為g.4877G>A和g.4902C>T，其中g(shù).4902C>T能夠顯著影響秦川牛的體高和胸圍[19]。通過PCR-SSCP分型法發(fā)現(xiàn)，g.5465G>A和g.8162T>C的不同基因型與中國寧夏地區(qū)西門塔爾雜交牛的體重、體斜長、胸圍等生長發(fā)育指標(biāo)緊密相關(guān)[20]。本研究在419頭早勝牛群體中檢測發(fā)現(xiàn)，UCP3存在3個(gè)突變位點(diǎn)，分別為g.4439G>A，g.4899G>A和g.5575G>A，關(guān)聯(lián)性結(jié)果顯示，外顯子突變g.4899G>A的GG基因型個(gè)體體重和胸圍顯著高于AA基因型個(gè)體，而其余2個(gè)突變位點(diǎn)不同基因型個(gè)體之間的生長發(fā)育性狀差異不顯著，可能是因?yàn)檫@2個(gè)突變位點(diǎn)均定位于UCP3的內(nèi)含子上，并不能改變氨基酸結(jié)構(gòu)。

轉(zhuǎn)錄因子FOXO1是FoxO家族中發(fā)現(xiàn)最早的成員，在細(xì)胞分化信號(hào)通路與轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[21]。在人和小鼠上，關(guān)于FOXO1的研究主要集中在癌癥發(fā)生、胰島素抗性及肥胖治療等[22-23]。畜牧方面，以研究FOXO1對(duì)肉質(zhì)的調(diào)控機(jī)制為主。在羊、豬和牛等動(dòng)物上均證實(shí)FOXO1能夠通過去磷酸化作用，能夠抑制脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞的增殖及分化，進(jìn)而影響肉品質(zhì)[24-25]。牛的FOXO1主要在肝臟、肺臟以及脾臟中表達(dá)，肌肉中的FOXO1在犢牛期的時(shí)候表達(dá)量最高，成年牛時(shí)明顯下降[26]。目前，關(guān)于牛FOXO1多態(tài)性研究不多，只有在秦川牛上有相關(guān)報(bào)道。前期，秦川牛FOXO1上檢測到5個(gè)突變位點(diǎn)，4個(gè)定位于外顯子，1個(gè)定位于3’側(cè)翼區(qū)，關(guān)聯(lián)性分析揭示了3’側(cè)翼區(qū)的突變位點(diǎn)與體斜長、胸圍和胸深等方面密切關(guān)聯(lián)[27]。本試驗(yàn)同樣在FOXO1的3’ 側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)1個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(g.92209C>T)，發(fā)現(xiàn)這個(gè)突變位點(diǎn)均對(duì)早勝牛生長發(fā)育性狀有一定的影響，CC基因型為優(yōu)勢基因型，能夠顯著提高早勝牛的體重和胸圍。盡管該突變位點(diǎn)定位于3’側(cè)翼區(qū)，不能改變氨基酸結(jié)構(gòu)，但研究證實(shí)，3’側(cè)翼區(qū)能夠與miRNA結(jié)合，發(fā)生突變可能會(huì)影響到miRNA的結(jié)合效率，導(dǎo)致基因的表達(dá)受到調(diào)控[28]。后期，我們計(jì)劃對(duì)該突變位點(diǎn)的功能進(jìn)行相關(guān)研究。

基因聚合分析是分子育種中一個(gè)重要的途徑，目前該方法在植物分子育種中應(yīng)用廣泛，由于動(dòng)物繁殖周期過長、成本過大等因素制約，基因聚合育種在動(dòng)物方面，尤其是反芻動(dòng)物上進(jìn)展緩慢[29]。李國輝等[31]在白耳雞上發(fā)現(xiàn)，GH、POU1F1以及PRL3個(gè)基因的聚合基因型對(duì)產(chǎn)蛋性能具有顯著的影響，遺傳效應(yīng)高于單個(gè)基因的基因型[30]。在中國美利奴羊上，MC4R和PROP1的合并基因型顯著影響生長發(fā)育性狀。An 等[32]在山羊GNRH1和GDF9上檢測到3個(gè)突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)合并基因型A1G1G2G2A3A顯著與不同胎次母羊繁殖力緊密關(guān)聯(lián)。以上研究均證實(shí)，基因聚合育種在動(dòng)物上應(yīng)用并推廣是切實(shí)可行的，更有利于畜禽的遺傳改良。

本研究通過合并UCP3和FOXO1發(fā)現(xiàn)，合并基因型各組之間的體重和胸圍之間差異明顯(P<0.05或P<0.01)，合并基因型GG-GG-GG-CT個(gè)體的生長發(fā)育，尤其是體重和胸圍均值表現(xiàn)最佳。通過比較發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)基因的聯(lián)合效應(yīng)要大于單基因?qū)υ鐒倥ＩL發(fā)育的效應(yīng)。盡管UCP3和FOXO1定位于不同的染色體，但研究發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞中的FOXO1可以與轉(zhuǎn)錄因子Tfeb結(jié)合，通過自噬作用，進(jìn)而調(diào)控UCP基因家族的表達(dá)水平[33]。這一研究從側(cè)邊印證本研究的結(jié)果，UCP3和FOXO1的聚合基因型遺傳效果顯著高于單個(gè)基因的基因型的遺傳效果。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，突變位點(diǎn)g.4899G>A(UCP3)和g.92209C>T(FOXO1)與早勝牛體重和胸圍顯著關(guān)聯(lián)。UCP3和FOXO1基因的優(yōu)勢合并基因型為GG-GG-GG-CT，其個(gè)體的體重和胸圍顯著或顯著高于其它合并基因型，可以嘗試將UCP3和FOXO1作為影響早勝牛生長性狀的候選基因用于標(biāo)記輔助選擇，為其選育工作提供科學(xué)依據(jù)。