梁瑩瑩，謝運法，胡傳活*，陳志英，鄧祝新，馮顯鈐，許春榮，劉德玉，唐胤晟，李 銘

(1.廣西大學(xué)動物科技學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西畜禽品種改良站，廣西 南寧 530001；3.廣西畜牧研究所，廣西 南寧 530001)

【研究意義】金雀異黃酮來源于豆科植物，具有蛋白酪氨酸激酶抑制劑之稱，其分子式為C15H10O5，被歸類為植物雌激素，可穿透細胞抑制酪氨酸蛋白激酶活性及許多蛋白的酪氨酸磷酸化。已有研究證實，添加100.0 μmol/L金雀異黃酮能有效改善凍后豬精子表觀指標及精子的獲能狀態(tài)[1]，但尚未對其作用機理及作用部位進行深入研究。因此，探究金雀異黃酮對凍融豬精子蛋白酪氨酸磷酸化及獲能相關(guān)基因的影響，對開展蛋白酪氨酸激酶抑制劑對凍融豬精子獲能影響研究具有重要意義。【前人研究進展】低溫刺激可對精子造成不可逆損傷，致使精子提前獲能，且在這種低溫環(huán)境下誘導(dǎo)的精子獲能被認為是一種以多不飽和脂肪酸和膽固醇的損失為特征的膜重組現(xiàn)象，隨著Ca2+內(nèi)流的增加而引起pH升高，產(chǎn)生低水平的一氧化氮，并形成過氧亞硝酸鹽，然后被裂解形成羥基自由基和二氧化氮，尤其是pH和羥基自由基的升高會激活腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致精子內(nèi)cAMP和蛋白激酶A(PKA)活性發(fā)生變化[2-4]。Kumar和Atreja[4]研究認為，精子獲能是與卵子結(jié)合的必要條件，但過早獲能易導(dǎo)致精子生理特征發(fā)生改變，縮短精子在雌性生殖道的存活時間而影響受精過程。早在20世紀80年代，人們已在豬精漿蛋白中發(fā)現(xiàn)一組精子黏附蛋白(SP)家族，該家族包括5個蛋白(AQN1、AQN3、AWN、PSP-I和PSP-II及其糖基亞型)，射精時附著在精子表面，保護精子頂體防止精子提前獲能，精子獲能后多數(shù)SP脫離精子外膜，僅少數(shù)與精子膜磷脂相結(jié)合，參與精卵識別并與透明帶結(jié)合[5]。Ledesma等[6]研究發(fā)現(xiàn)，分別在羊的精液冷凍液中添加精漿蛋白和富含II型纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域的精漿重組蛋白均能有效改善羊冷凍精子的質(zhì)量，并抑制或逆轉(zhuǎn)冷凍過程中精子獲能。Fang等[7]研究顯示，在羊精子冷凍液中添加40%豬精漿可抑制羊精子冷凍獲能，改善正常的生理獲能過程，增加羊?qū)m頸內(nèi)人工授精的精子穿透率和妊娠率。高波等[8]研究表明，在羊精液冷凍液中精子運動抑制因子(SPMI)是哺乳動物精漿中的另一種蛋白，可調(diào)控精子的運動能力?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關(guān)于金雀異黃酮影響凍融豬精子獲能的具體作用機制尚無研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探討金雀異黃酮對凍融豬精子蛋白酪氨酸磷酸化水平、獲能信號通路PKA和蛋白激酶G(PKG)活性變化、SP家族基因及SPMI基因mRNA表達的影響，為豐富豬精子冷凍保存技術(shù)的理論基礎(chǔ)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年2—7月在廣西大學(xué)基礎(chǔ)獸醫(yī)實驗室進行。豬精液以手握法采自廣西科達畜禽改良有限責(zé)任公司18～24月齡、體重140～150 kg、體格健康、性欲旺盛的10頭杜洛克種公豬，檢測其精子活力不低于70.0%。主要試驗試劑：金雀異黃酮(碧云天)；Anti-rabbit HRP IgG、DyLight 488-抗鼠IgG、β-Actin pAb Rabbit(Bio-World)；Phospho-Tyrosine Mouse mAb、Anti-mouse IgG HRP-linked Antibody(CST)；RNA提取試劑盒、2×ChamQUniversalSYBRqPCR Master Mix酶(Vazyme)；2×TaqPCR Master Mix(TaKaRa)，均購自于廣西南寧楚杰生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。精液冷凍稀釋液(Ⅰ液和Ⅱ液)參照李丹丹等[11]的方法進行配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 分別設(shè)100.0 μmol/L金雀異黃酮冷凍處理組(冷凍精液中添加金雀異黃酮，G組)、對照組(冷凍對照組，CK組)和鮮精組(新鮮精液，F(xiàn)組)。

1.2.2 精液冷凍和解凍 參照李丹丹等[9]的方法進行豬精液冷凍和解凍。將鏡檢合格的豬精液于室溫下離心取沉淀；加入等體積的冷凍Ⅰ液(使金雀異黃酮終濃度分別為0和100.0 μmol/L)[1]，17.0 ℃下孵育1.0 h后加入等體積的冷凍Ⅱ液(即精液∶冷凍Ⅰ液∶冷凍Ⅱ液=1∶1∶1)；用250.0 μL塑料細管分裝，2.0 h內(nèi)緩慢降溫至4.0 ℃，并在該溫度下平衡2.0 h，于程序降溫儀中降溫至-140 ℃，程序結(jié)束后投入液氮中保存。解凍時，將裝有精子的塑料細管置于60 ℃水浴復(fù)溫解凍5 s(冷凍精子解凍后均稱凍融精子，下同)。

1.2.3 精子蛋白酪氨酸磷酸化水平檢測 參照王紅[10]、Saez等[11]的方法提取各組豬精子的總蛋白后，以紫外分光酶標儀檢測蛋白濃度，并進行Western blotting檢測。以80 V電壓分離各組蛋白，并將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至NC膜上，5.0%脫脂奶粉封閉1.5 h后漂洗，經(jīng)一抗(抗酪氨酸磷酸化抗體∶PBST =1∶2000，β-actin∶PBST =1∶20 000)4 ℃孵育過夜和二抗(鼠抗∶PBST =1∶20 000；兔抗∶PBST =1∶100 000)室溫孵育1.0 h后漂洗，加入發(fā)光液置于暗室曝光盒內(nèi)曝光后顯影、定影保存。

1.2.4 精子蛋白酪氨酸磷酸化位點檢測 參照張孝清等[12]的方法進行間接免疫熒光檢測。取各組豬精子置于3.7%多聚甲醛中37 ℃下固定20.0 min，PBS洗3次，制成100.0 μL精子懸液；取20.0 μL懸液涂片風(fēng)干，于3.0% BSA-PBS內(nèi)37 ℃下封閉1.0 h；一抗室溫下孵育1.0 h，PBST浸洗5.0 min(3次)；二抗37 ℃下避光孵育1.0 h，PBST浸洗5.0 min(3次)，水中避光浸洗5.0 min；抗熒光衰減劑封片(用指甲油將涂片封閉于避光盒內(nèi))；熒光顯微鏡下觀察200個以上精子。

1.2.5 PKA和PKG活性檢測 參照GenStar豬PKA酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明和豬PKG酶聯(lián)免疫分析試劑盒推薦方法進行標準曲線構(gòu)建和精子內(nèi)蛋白酶活性檢測。

1.2.6 RT-PCR鑒定 參照GenBank中公布的豬精子AQN1、AQN3、AWN、PSP-I、PSP-II和SPMI基因及內(nèi)參基因(GAPDH)，利用Clone manger 8.0分別設(shè)計擴增引物(表1)，委托華大基因股份有限公司合成。取各組精子按照RNA提取試劑盒說明提取精子RNA。以RNA為模板，根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA第一鏈。根據(jù)2×TaqPCR Master Mix使用說明及通過多次試驗驗證確定PCR反應(yīng)體系和最佳反應(yīng)條件。反應(yīng)體系26.0 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5μL、水12.5 μL。通過改變退火溫度和循環(huán)次數(shù)確定最佳RT-PCR擴增條件(表2)。參照劉運佳[13]的方法對豬精子黏附蛋白基因、SPMI基因和GAPDH基因進行SDS-PAGE鑒定。

表1 豬精子黏附蛋白基因、SPMI基因和GAPDH基因的擴增引物

表2 豬精子黏附蛋白家族基因、SPMI基因和GAPDH基因的RT-PCR擴增條件

1.2.7 實時熒光定量PCR檢測 根據(jù)2×ChamQUniversalSYBRqPCR Master Mix酶使用說明及通過試驗驗證后確定實時熒光定量PCR反應(yīng)體系和最佳反應(yīng)條件。反應(yīng)體系20.0 μL：2×ChamQUniversalSYBRqPCR Master Mix酶10.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O補足20.0 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1.0 min，進行40個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，利用Image J進行灰度值掃描，并以Graphpad Prism 6.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 金雀異黃酮對凍融豬精子蛋白酪氨酸磷酸化的影響

采用Western blotting對G組、CK組和F組中酪氨酸磷酸化蛋白進行檢測，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，在凍融精子中檢測出5種不同分子量(32、37、40、58和69 kD)蛋白的酪氨酸磷酸化，而F組中僅檢測出3種不同分子量(37、40和58 kD)蛋白的酪氨酸磷酸化(圖1-A和圖1-C)；與CK組相比，G組中分子量為32和69 kD的蛋白酪氨酸磷酸化水平顯著降低(P<0.05，下同)(圖1-B)，分子量為37、40和58 kD蛋白的酪氨酸磷酸化水平差異不顯著(P>0.05，下同)(圖1-D)。說明金雀異黃酮在豬精子凍融過程中可能通過降低32和69 kD蛋白的酪氨酸磷酸化而抑制豬精子被動獲能。

2.2 金雀異黃酮對凍融豬精子不同部位蛋白酪氨酸磷酸化位點的影響

從圖2-A可看出，凍融組精子(G組和CK組)和F組中豬精子的頂體區(qū)、頂體后區(qū)和尾部均發(fā)生蛋白酪氨酸磷酸化；從圖2-B可看出，與CK組相比，F(xiàn)組蛋白酪氨酸磷酸化位點在頂體后區(qū)極顯著升高(P<0.01，下同)；頂體區(qū)和頂體+頂體后區(qū)磷酸化位點極顯著降低；G組中頂體+頂體后區(qū)磷酸化位點顯著降低。說明金雀異黃酮可能通過降低精子頂體+頂體后區(qū)處蛋白的酪氨酸磷酸化水平而抑制豬精子凍融過程中獲能。

2.3 金雀異黃酮對凍融豬精子PKA和PKG活性的影響

通過對標準品進行二倍梯度稀釋，構(gòu)建PKA和PKG活性標準曲線。從圖3可看出，構(gòu)建的標準曲線具有良好的線性關(guān)系(PKA：y=0.0156x-0.0127；PKG：y=0.0459x-0.0104)，且R2大于0.9900，說明標準曲線構(gòu)建成功。

以ELISA試劑盒檢測G組、CK組和F組中豬精子的PKA和PKG活性，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，G組中豬精子的PKA活性較CK組顯著降低，PKG活性與CK組差異不顯著。說明金雀異黃酮可能通過降低凍融豬精子cAMP/PKA獲能信號通路中的PKA活性而阻止精子獲能。

2.4 金雀異黃酮對凍融豬精子黏附蛋白家族與SPMI基因表達的影響

采用SDS-PAGE對豬精子黏附蛋白家族、SPMI和GAPDH基因進行檢測，結(jié)果(圖5-A和圖5-B)顯示，AQN1、AQN3、AWN、PSP-I、PSP-II、SPMI和GAPDH基因擴增產(chǎn)物長度分別為193、179、207、140、201、174和100 bp，與重組質(zhì)粒的測序結(jié)果一致。

通過實時熒光定量PCR對豬精子黏附蛋白家族基因、SPMI基因和GAPDH基因進行檢測，其熔解曲線呈均一單峰，說明引物具有良好的特異性；以GAPDH基因為內(nèi)參基因分別對凍融精子黏附蛋白家族和SPMI基因mRNA表達量進行檢測，對所得不同分組精子黏附蛋白家族基因和SPMI基因表達量進行歸一化處理，繪制各基因不同分組相對表達量差異比對圖(圖6)。與CK組相比，G組中AWN基因相對表達量極顯著上升，PSP-I、PSP-II和SPMI基因相對表達量下降(其中，PSP-I基因顯著下降，PSP-II和SPMI基因極顯著下降)。說明金雀異黃酮可能通過提高凍融精子AWN基因表達量，抑制豬精子凍融過程中獲能；通過降低PSP-I、PSP-II和SPMI基因表達量，提高凍融精子活力。

3 討 論

Eddy等[14]、Urner和Sakkas[15]研究認為，精子的運動和獲能均受蛋白酪氨酸磷酸化過程調(diào)控，且與精子的結(jié)構(gòu)、生理特性及獲能過程中的超激活運動有關(guān)。本研究通過檢測豬精子中蛋白酪氨酸磷酸化水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)頂體+頂體后區(qū)酪氨酸磷酸化位點減少可能受精子中蛋白酪氨酸磷酸化調(diào)控；通過對cAMP/PKA和cGMP/PKG信號通路中PKA和PKG活性的檢測，發(fā)現(xiàn)金雀異黃酮對凍融過程中精子獲能的抑制(或使凍融精子去獲能)可能與cAMP/PKA信號通路中PKA活性降低有關(guān)。Orrego等[16]研究報道，凍融過程導(dǎo)致“獲能樣”精子中的蛋白酪氨酸磷酸化水平增加，并出現(xiàn)32 kD分子量的蛋白(p32)酪氨酸磷酸化。本研究中，凍融豬精子(CK組和G組)不僅出現(xiàn)p32蛋白，還出現(xiàn)p37、p40、p58和p69蛋白，其中p37和p58蛋白的表達量顯著高于F組，與王亮亮等[17]、González-Fernández等[18]的研究結(jié)果相似；凍融精子較新鮮精子新增2個酪氨酸磷酸化蛋白(p32和p69)，經(jīng)金雀異黃酮處理后表達量顯著降低，酪氨酸磷酸化蛋白p32的出現(xiàn)可能與凍融引起頂體內(nèi)容物融合有關(guān)[17]；但新鮮精子中未檢測到p69蛋白，與王亮亮[17]的研究結(jié)果存在差異，具體原因尚需進一步探究。

已有研究證實，冷凍處理的豬精子蛋白酪氨酸磷酸化主要分布于頂體后區(qū)的頸部，頂體和尾部僅有少許熒光[19]。本研究通過檢測凍融豬精子中蛋白酪氨酸磷酸化位點，發(fā)現(xiàn)100.0 μmol/L金雀異黃酮處理可減少頂體區(qū)和頂體+頂體后區(qū)蛋白酪氨酸磷酸化，與Lewis和Aitken[20]的研究結(jié)果不一致，可能與研究的物種不同有關(guān)；凍融精子的頂體+頂體后區(qū)蛋白酪氨酸磷酸化位點降低可能與p32和p69蛋白表達量降低有關(guān)；鮮精組中精子的頂體區(qū)酪氨酸磷酸化位點較高，與Urner等[19]的研究結(jié)果一致：而CK組有部分精子死亡，未發(fā)生酪氨酸磷酸化。

精子黏附蛋白主要由精囊腺產(chǎn)生，是附著在精子表面的多功能蛋白，能與多種配體(碳水化合物、硫酸糖胺聚糖、磷脂和蛋白酶抑制劑等)相結(jié)合，參與不同受精過程。Sanz等[21]研究顯示，精子通過附睪時，AQN3和AWN蛋白通過與雙層膜磷脂相互作用與精子表面緊密結(jié)合，射精前與部分受體相結(jié)合，在子宮通道中起著穩(wěn)定透明帶結(jié)合位點的作用；射精時，精子黏附蛋白在精子頭部敏感的頂體區(qū)域形成一層保護層，防止過早頂體反應(yīng)；在體外獲能過程中，除磷脂結(jié)合的精子蛋白外，其他精子黏附蛋白均脫離精子表面，AWN和AQN3蛋白可能是卵母細胞透明帶的主要受體，因此有助于精子和卵子間的初始結(jié)合和識別。Sanz等[22]通過對AQN1蛋白的分離，運用飛行時間等離子體—解吸質(zhì)譜法測定其為12 kD分子量蛋白，并運用蛋白質(zhì)譜法測定其氨基酸序列和二硫鍵位置，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)和功能與AQN3和AWN蛋白具有廣泛的相似性。胡安琪等[23]研究表明，AQN1、AQN3和AWN蛋白在精子獲能時具有穩(wěn)定頂體質(zhì)膜及調(diào)節(jié)精卵結(jié)合作用。本研究發(fā)現(xiàn)，凍融豬精子黏附蛋白基因AQN1、AQN3和AWN的表達量降低，與胡安琪等[23]的研究結(jié)果一致，且加速了精子的“獲能樣”變化，而G組中AWN基因的相對表達量顯著升高。Sanz等[24]研究認為，AWN1蛋白是AWN蛋白的一個亞型，可調(diào)節(jié)機體碳水化合物，識別并黏附于卵子透明帶，而黏附蛋白丟失使精子失去保護，從而發(fā)生假獲能或提前獲能，影響其繁殖力。以上研究結(jié)果表明，AWN蛋白基因在精子冷凍和獲能過程中發(fā)揮著積極作用，可為后續(xù)開展精子冷凍和獲能研究提供參考。

Kang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，PSP-I和PSP-II蛋白在低產(chǎn)仔公豬精子中的表達量顯著高于高產(chǎn)仔公豬，也有研究報道公豬精漿中PSP-1蛋白表達與生育能力和精子運動呈負相關(guān)[26-27]，PSP-1蛋白表達主要損害精子尾部。本研究發(fā)現(xiàn)，凍融豬精子PSP-I和PSP-II蛋白基因相對表達量升高，可能與凍融精子活力降低有關(guān)，而經(jīng)金雀異黃酮處理后，凍融豬精子PSP-I和PSP-II基因相對表達量明顯降低，與梁瑩瑩等[1]的研究結(jié)果一致，進一步證實公豬精漿中PSP-I基因的表達與精子運動受抑制有關(guān)。

動物射精后，SPMI蛋白以前體(52 kD)形式存在，隨后精漿內(nèi)蛋白酶將其降解為17～21 kD小肽，對精子運動的抑制能力也減弱[28]。Iwamoto等[29]研究表明，豬精子SPMI蛋白在精囊腺中特異性高表達，參與精子的運動抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，凍融豬精子中SPMI基因相對表達量升高，可能是凍融精子活力降低的原因之一，而經(jīng)金雀異黃酮處理后，凍融精子SPMI基因相對表達量明顯降低，與梁瑩瑩等[1]研究認為“金雀異黃酮可提高凍融精子活力”的結(jié)果相似，但精子活力的提高還可能是SPMI蛋白與黏附蛋白(PSP-I和PSP-II)共同作用的結(jié)果。

4 結(jié) 論

金雀異黃酮既能降低凍融豬精子頂體+頂體后區(qū)蛋白酪氨酸磷酸化水平，且PKA蛋白活性降低可能與32和69 kD分子量蛋白酪氨酸磷酸化水平降低有關(guān)，又可有效提高凍融豬精子中AWN基因及降低PSP-I、PSP-II和SPMI基因的表達量，在一定程度上提高凍融豬精子質(zhì)量。