耐鹽桑黃菌株篩選及其馴化

李羚，郭立忠，李樹文

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109)

桑黃是一類硬質(zhì)多孔菌的總稱，在分類上屬于真菌界擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，傘菌綱(Agaricomycetes)，刺革菌目(Hymenochaetales)，刺革菌科(Hymenochaetaceae)，桑黃孔菌屬(Sanghuangporus)[1-2]，其藥用價(jià)值在秦漢時(shí)期《神農(nóng)本草經(jīng)》、唐代《藥性論》、宋代《大觀本草》、明朝《本草綱目》、清代《四庫(kù)全書》和當(dāng)代《中藥大辭典》等眾多的醫(yī)學(xué)著作中都有記載和說(shuō)明[3-4]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)桑黃子實(shí)體和菌絲體中含有多種化合物，包括多糖類、黃酮類、三萜類、吡喃酮類、多酚類、生物堿、香豆素類等成分，具有抗腫瘤、保肝、降血糖、抗血管生成、抗氧化、抗炎、增強(qiáng)免疫等藥理作用，廣泛用于藥品、保健品、食品和護(hù)膚品中[5-7]。為了獲得大量的子實(shí)體和菌絲體，已經(jīng)開展了桑黃的人工培養(yǎng)研究，包括桑黃原種固體培養(yǎng)、桑黃菌絲液體發(fā)酵和桑黃人工子實(shí)體栽培[8-10]，其中子實(shí)體栽培的原料有段木栽培和代料栽培。段木栽培方式為畦床埋土栽培[11-12]，代料栽培采用的方式包括直接出菇、埋土栽培和吊袋栽培，研究表明埋土栽培產(chǎn)量高且水分管理方便[13]。

我國(guó)鹽堿地資源量多且分布廣泛，其高效利用對(duì)我國(guó)耕地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)能力的提升、國(guó)家糧食安全的保障具有重要意義，并且其可持續(xù)利用技術(shù)研發(fā)及管理研究已受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視[14]。本文以實(shí)驗(yàn)室保存的能夠進(jìn)行人工栽培的桑黃菌株為研究對(duì)象，從海水鹽度和NaCl濃度兩個(gè)方面進(jìn)行耐鹽菌株的篩選研究，為未來(lái)鹽堿地埋土栽培產(chǎn)桑黃子實(shí)體以及海水發(fā)酵培養(yǎng)桑黃菌絲體產(chǎn)活性物質(zhì)的研究提供菌株資源和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 菌株

3株桑黃菌株采集自黑龍江、山東和云南，分別命名為桑黃HLJ、桑黃SYS、桑黃W，其中桑黃HLJ為暴馬桑黃(Sanghuangporusbaumii)，桑黃SYS和桑黃W為桑樹桑黃(Sanghuangporussanghuang)，保存于山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基，成分為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。滅菌條件：115 ℃，20 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同海水鹽度對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響

海水取自青島市即墨區(qū)鰲山衛(wèi)海域，手持式折射儀測(cè)量初始鹽度為3.2%，用蒸餾水稀釋鹽度分別為0.8%和1.6%的溶液，加入PDA粉末，配置鹽度分別為0%、0.8%、1.6%、3.2%的PDA培養(yǎng)基，倒平板后接種菌餅，28 ℃培養(yǎng)，直尺測(cè)量并記錄不同培養(yǎng)時(shí)間的菌落直徑(每個(gè)濃度做3次重復(fù)，以下同)。

1.3.2 不同NaCl濃度對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響

PDA培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量的NaCl，配制NaCl含量分別為0%、0.3%、0.6%、1%(w/v)的培養(yǎng)基，其他過(guò)程與1.3.1相同。

1.3.3 耐鹽菌株傳代馴化

菌株接種到0.8%海鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，8 mm打孔器打孔成菌餅，取菌餅接種到0.8%培養(yǎng)基中培養(yǎng)1代后，再轉(zhuǎn)接到1.6%培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，然后再轉(zhuǎn)接到1.6%培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，最后接種到3.2%培養(yǎng)基中培養(yǎng)測(cè)量，該過(guò)程經(jīng)過(guò)了海鹽含量分別為0.8%和1.6%的1次同鹽度的馴化培養(yǎng)后進(jìn)行轉(zhuǎn)接(記為1.6%～3.2%)；在1.6%同鹽度接種時(shí)，進(jìn)行鹽度0%的接種，培養(yǎng)后接種鹽度3.2%培養(yǎng)基(記為0%～3.2%)，作為傳代馴化的對(duì)照。具體過(guò)程如圖1所示，接種過(guò)程和測(cè)量過(guò)程與1.3.1 相同。

圖1 耐鹽菌株傳代馴化流程Fig.1 Continuous passage acclimatization of saline-tolerant strains

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

試驗(yàn)結(jié)果采用Mean±SD表示，重復(fù)3次。采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析；采用OriginPro 8.5進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海水鹽度對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，桑黃HLJ可在鹽度為0%、0.8%、1.6%和3.2%的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，平均生長(zhǎng)速率分別為0.56 cm/d、0.57 cm/d、0.58 cm/d和0.38 cm/d，鹽度為0.8%和1.6%時(shí)其菌絲生長(zhǎng)速率與無(wú)鹽度時(shí)相當(dāng)；鹽度3.2%時(shí)抑制了菌絲生長(zhǎng)，抑制率為12%，且與對(duì)照比較(如表1所示)具有顯著的抑制性(Fcrit

圖2 海水鹽度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.2 The effect of salinity of sea water on mycelial growth

表1 3.2%鹽度和對(duì)照對(duì)HLJ菌絲生長(zhǎng)影響的方差分析Table 1 Anova analysis of mycelial growth of strain HLJ cultured with salinity of 3.2% and 0%

2.2 NaCl濃度對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖3所示，桑黃HLJ能夠在NaCl濃度為0%、0.3%、0.6%、1%的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，平均生長(zhǎng)速率分別為0.56 cm/d、0.47 cm/d、0.50 cm/d和0.36 cm/d，與對(duì)照0%生長(zhǎng)速度比較，0.3%、0.6%、1%的NaCl濃度抑制菌絲的生長(zhǎng)，抑制率分別為16%、11%和36%，其中鹽度為0.6%時(shí)抑制率低于0.3%。通過(guò)方差分析可知(表2)，F(xiàn)crit>F，二者差異不明顯，不能說(shuō)明0.6% NaCl的抑制程度低于0.3%，出現(xiàn)上述結(jié)果為試驗(yàn)誤差導(dǎo)致的。0.3%、0.6%和1% NaCl濃度抑制桑黃SYS和桑黃W的菌絲生長(zhǎng)，7 d內(nèi)平均生長(zhǎng)速率為0 cm/d。可見，與桑黃SYS和桑黃W比較，桑黃HLJ對(duì)NaCl鹽度的抗性較強(qiáng)。綜上所述，下一步以桑黃HLJ進(jìn)行耐鹽馴化試驗(yàn)，以提高其耐鹽性。

圖3 NaCl濃度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.3 The effect of NaCl concentration on mycelial growth

表2 0.3%和0.6%鹽度對(duì)HLJ菌絲生長(zhǎng)影響的方差分析Table 2 Anova analysis of mycelial growth of strain HLJ cultured with salinity of 0.3% and 0.6%

2.3 桑黃HLJ耐鹽馴化

由圖4所示，傳代馴化后即1.6%～3.2%桑黃HLJ在3.2%鹽度培養(yǎng)基生長(zhǎng)速度為0.48 cm/d，只傳代沒有馴化直接接種3.2%鹽度培養(yǎng)基即0%～3.2%桑黃HLJ生長(zhǎng)速度為0.42 cm/d，對(duì)照不含鹽的培養(yǎng)基即0%～0%桑黃HLJ傳代后的生長(zhǎng)速度為0.56 cm/d?？梢姡c對(duì)照比較，1.6%～3.2%傳代馴化后的菌株的生長(zhǎng)速度受到明顯的抑制作用(Fcrit

圖4 桑黃HLJ菌株馴化結(jié)果Fig.4 The acclimatization of strain HLJ

表3 0%～0%和1.6%～3.2%鹽度對(duì)HLJ菌絲生長(zhǎng)影響的方差分析Table 3 Anova analysis of mycelial growth of strain HLJ cultured with salinity range of 0%～0% and 1.6～3.2%

表4 0%～3.2%和1.6%～3.2%鹽度對(duì)HLJ菌絲生長(zhǎng)影響的方差分析Table 4 Anova analysis of mycelial growth of strain HLJ cultured with salinity range of 0%～3.2% and 1.6～3.2%

3 討論

桑黃子實(shí)體栽培已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了畦床埋土栽培出黃的工藝，本研究篩選的耐鹽菌株桑黃HLJ具有較強(qiáng)的抗鹽能力，存在著在鹽堿地畦床埋土栽培出黃的可能性。鹽度0.5%以上鹽堿地基本上處于荒蕪狀態(tài)，不適合農(nóng)作物種植，如果將桑黃菌株與中度、重度鹽堿地相結(jié)合，可開發(fā)耐鹽堿藥用菌，提高鹽堿地資源利用率，為鹽堿地高值化開發(fā)利用提供優(yōu)質(zhì)菌種和可行性[15]，其鹽堿地栽培出黃技術(shù)需要進(jìn)一步研究。

鹽度會(huì)影響菌絲體的生化組成[16]。目前以海水為溶液，以食用菌、藥用菌為研究對(duì)象，從事食藥用菌海水發(fā)酵的報(bào)道較少[17]。本研究獲得桑黃HLJ菌株在鹽度為3.2%海水中雖然受到抑制，但能夠生長(zhǎng)，依據(jù)其抗鹽特性進(jìn)而可探索其在高鹽條件下活性物質(zhì)的種類、產(chǎn)量以及可能的新型活性物質(zhì)等，從而利用海水，節(jié)約淡水資源。

因此，抗鹽食用菌菌株的篩選為鹽堿地的開發(fā)利用、海水發(fā)酵活性物質(zhì)的產(chǎn)生提供了菌株資源。

4 結(jié)論

桑黃HLJ、桑黃SYS、桑黃W對(duì)海水鹽度和NaCl抗性不同，其中桑黃HLJ抗鹽能力強(qiáng)于桑黃SYS和桑黃W。

桑黃HLJ經(jīng)過(guò)海水鹽度傳代馴化培養(yǎng)后，其生長(zhǎng)速度比沒有經(jīng)過(guò)馴化菌株略有提高，但是二者差異不顯著，且與對(duì)照比較，仍然受到顯著性的抑制作用，生長(zhǎng)抑制率為15%。