楊舒喬，王 迪，高彥祥*

（中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

交原蛋白或稱交原是一類重要的蛋白質，是細胞外基質的一種結構蛋白。目前已經發(fā)現有20余種不同類型的交原蛋白，包括I型、II型、III型、IV型和V型等[1]（表1）。其中，II型交原蛋白（collagen type II，CII）具有致密的纖維結構，是軟骨基質中最主要的有機成分，為軟骨組織的特征性蛋白質，與多糖緊密結合，使軟骨具有柔韌性，可以吸收沖擊和承受負載。研究表明，保持完整三螺旋結構的CII，即非變性CII（undenatured type II collagen，UC-II）具有良好的生物相容性和低抗原性，以適宜劑量的UC-II誘導人體免疫耐受，可預防或緩解骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎病癥[2]。本文主要闡述UC-II的分布、功能及結構特性，對UC-II的提取方法及應用現狀進行綜合論述，同時總結現有的UC-II表征方法，并對其應用前景做出展望。

表1 不同類型膠原蛋白的肽鏈組成及組織分布[1,3]Table 1 Peptide chain composition and distribution of different types of collagen in animal tissues[1,3]

1 UC-II的特點

UC-II主要分布于軟骨、眼玻璃體、髓核、角膜和胚胎的上皮細胞中，具備良好的生物相容性、生物可降解性、低免疫原性等交原蛋白基本生物學功能，還可以維持軟骨組織的完整性，刺激軟骨細胞生長和再分化[3]。UC-II由3 條α1肽鏈組成，即[α1(II)]3。每一條多肽鏈的氨基酸排列中，存在甘氨酸-X-Y（G-X-Y）這樣的三肽重復序列，可用（G-X-Y）n表示[4-6]。同時X位通常由脯氨酸殘基占據（20%～30%），甘氨酰-脯氨酰-Y這類三肽的數量約占三肽數量總和的1/3，其結構式如圖1所示。這種三肽重復序列對交原蛋白的結構具有重要作用。每條肽鏈有1 000 個左右氨基酸殘基，分子質量介于95 000～100 000 Da之間，所以每一個UC-II分子的分子質量約為300 kDa。

圖1 UC-II的甘氨酰-脯氨酰-Y結構[1]Fig.1 Gly-Pro-Y structure of undenatured type II collagen[1]

UC-II的二級結構是由3 條肽鏈組成的三股螺旋[7-9]，各個鏈中的氨基酸通過肽鍵結合，而3 條肽鏈則通過氫鍵、偶極-偶極鍵、離子鍵和范德華相互作用維持三螺旋結構。但UC-II的三螺旋結構極易受內因或外因的影響，如環(huán)境溫度升高可導致UC-II的三股肽鏈之間的氫鍵不斷減弱，肽鏈的螺旋度降低，逐漸伸直至解螺旋，整個蛋白的無序性增加，變性后的UC-II生物活性大大降低[10-13]，圖2為UC-II與變性CII的顯微結構圖。

圖2 UC-II（A）和變性CII（B）的電子顯微結構（×50 000）[14]Fig.2 Electron micrographs of undenatured (A) and denatured collagen II (B) (× 50 000)[14]

2 UC-II提取方法

對交原蛋白提取方法的研究大部分都集中在I型交原蛋白上，通常以雞、牛、羊、豬、魚等動物的皮、骨、肌腱等為原料，采用堿法、酸法或酶法進行提取[15-18]。堿法容易引起蛋白質變性，甚至會產生D-型、L-型氨基酸消旋混合物，且提取率較低，因此若想要提取完整結構的交原蛋白則很少采用此法。酸法雖然可以較大程度地保持交原蛋白的三螺旋結構，但是在濃酸條件下色氨酸、絲氨酸、酪氨酸等氨基酸會遭到一定程度的破壞，同時采用酸法提取需要準確控制酸度、溫度、時間等條件，因此酸法很少單獨使用，通常與酶法配合。CII的結構更為復雜，絲狀的交原蛋白纖維與彈性蛋白及多糖蛋白相互交織形成網狀結構，同時還要保證在提取過程中三螺旋結構不被破壞，提取難度較大。現有的提取方大多采用酶解法，選用特定的蛋白酶，切斷苯丙氨酸、亮氨酸或谷氨酸殘基側的肽鍵，去除CII末端的非螺旋區(qū)域，則螺旋區(qū)的交原蛋白可溶解在酸性溶液中，從而得到高純度的UC-II（圖3）。

圖3 原膠原蛋白分子結構[19]Fig.3 Molecular structure of pro-collagen[19]

2.1 UC-II提取方法的國外研究現狀

Trentham等[2]在早在1977年就通過關節(jié)炎模擬實驗研究UC-II的自身免疫現象，其在0.5 mol/L乙酸的酸性條件下用胃蛋白酶提取UC-II，但該方法酶解時間長達3 d，且并未對酶解產物的純度及結構進行表征。Ho等[20]首次采用豬軟骨作為原料，提高胃蛋白酶使用量同時降低酶解溫度，用質量分數2%胃蛋白酶在1 ℃下酶解16 h提取UC-II，該工藝縮短了實驗時長，提高了提取效率。為進一步優(yōu)化提取工藝，Meng Dawei等[21]發(fā)現在用鱘魚脊索提取UC-II時，對脊索進行堿性預處理不僅可以提高交原蛋白的提取速率，且不影響交原蛋白的熱穩(wěn)定性，使其仍保持三螺旋結構。Cremer等[22]指出，在提取前用低離子強度緩沖液（如磷酸鉀緩沖液）去除蛋白多糖，有利于CII的溶出，提高提取效率。Sturrock等[23]提出一種UC-II的制備方法，主要包括預處理階段使用胃蛋白酶部分消化和除去大部分含有I型交原蛋白的軟骨膜，以及用胰蛋白酶去除與CII交聯的蛋白多糖，從而獲得純度較高的UC-II。Maity等[24]在2019年提出了一種經濟有效的快速分離CII的方法，將山羊耳軟骨在37 ℃下采用0.04%胃蛋白酶消化72 h，用1.2 mol/L NaCl沉淀，可優(yōu)化CII的分離效果，提取率約為55%，并且在分離和純化過程中保留了天然分子間交聯，酰胺II帶（1 553 cm-1）的存在表明分離的蛋白質保留了三螺旋結構。

2.2 UC-II提取方法的國內研究現狀

國內對UC-II的研究起步較晚。王彥宏等[25]在2000年用含1 g/L胃蛋白酶的0.5 mol/L乙酸溶液酶解粉碎后的牛軟骨，并用離子交換色譜進行純化，得到牛軟骨UC-II，但并未進行定量測定。葉春婷等[26]在2001年對提取方法進行改進，選取豬透明軟骨作為原料，用二乙氨乙基纖維素（diethylaminoethyl cellulose，DAEA）柱對微量殘留的蛋白多糖進行吸附，再經胃蛋白酶酶解，整個提取、純化過程中多次采用了NaCl鹽析手段去除降解或變性的交原，得到了高純度的UC-II。陸雪琴[27]比較鹽析和鹽酸胍溶解2 種去雜質方法對UC-II得率和純度的影響，結果表明無論是提取率還是純度，鹽酸胍處理都優(yōu)于NaCl鹽析。此后，大多數研究都使用鹽酸胍對原料進行預處理。李賽娜等[28]將牛關節(jié)軟骨用NaCl和鹽酸胍進行預處理，在酸性條件下用胃蛋白酶降解雜蛋白，經鹽析、透析和冷凍干燥后獲得UC-II。劉媛[29]以羊軟骨為原料，用鹽酸胍抽提蛋白多糖，在酸性條件下用胃蛋白酶酶解，得到純度為93.12%的UC-II。曹慧[19]通過響應面方法得到UC-II提取的最優(yōu)酶解條件為胃蛋白酶質量濃度1 g/100 mL、酶解時間32 h、酶解溫度20 ℃，該條件下UC-II提取率43.49%。

除選用雞、牛、羊等陸地動物軟骨作為提取原料外，海洋動物軟骨也被逐漸利用。郭休玉等[30]在2016年采用魷魚軟骨作為原料，經0.2%胃蛋白酶在4 ℃下水解48 h后，得到魷魚軟骨UC-II。車帥等[31]在2018年用人工養(yǎng)殖中華鱘軟骨提取UC-II，采用二次提取法，在含有0.1 g/100 mL胃蛋白酶的0.5 mol/L冰醋酸中重復酶解2 次，每次48 h，在真空度20 Pa下冷凍干燥得到中華鱘軟骨UC-II，也為海洋生物的綜合利用提供新思路。

通過上述研究可以發(fā)現，雖然軟骨來源不同，但提取方式基本相同。一般包括以下幾個步驟：原料的預處理、脫脂、去除雜蛋白、酶解、純化（表2）。大部分提取方法都存在處理量小、生產工藝繁瑣、耗時長、實驗試劑成本高等問題，適合實驗室制備樣品，并不利于規(guī)模化生產。

表2 UC-II提取方法Table 2 Extraction methods for undenatured type II collagen

3 UC-II定性和定量檢測方法

UC-II的定性和定量檢測既是UC-II研究的重點也是難點。通常采用Woessner比色法及反相高效液相色譜法對UC-II進行定量檢測，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝交電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、氨基酸測定、紫外吸收光譜、傅里葉變換紅外光譜、差示掃描量熱法、圓二色光譜分析、等電點測定、掃描電子顯微鏡等方法也逐漸被應用于UC-II的定性檢測[26-31]。近些年，已有研究將質譜法、酶聯免疫吸附法用于UC-II的檢測[33-35]，為其定量檢測提供新的方向。

3.1 UC-II的定量檢測

3.1.1 Woessner比色法[36]

比色法又稱分光光度法，是對物質進行定量分析的常用方法。羥脯氨酸是一種非必需氨基酸，也是交原蛋白的特征氨基酸。Woessner比色法的基本原理是：含羥脯氨酸的樣品經酸水解后，用氯胺T將羥脯氨酸氧化脫羧生成吡咯，再用對二甲氨基苯甲醛與吡咯反應生成紅色復合物，根據可見光下該復合物的吸光度判斷溶液中的羥脯氨酸含量。交原蛋白中的羥脯氨酸含量穩(wěn)定，因此羥脯氨酸含量即可表示交原蛋白含量。該實驗方法對實驗條件要求不高，但是操作步驟繁瑣，只能測定交原蛋白總量，并不能區(qū)分交原蛋白類型。

3.1.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法具有較高的靈敏性和精密度，已廣泛應用于物質的定量檢測。曹慧等[37]建立了高效液相色譜測定軟骨中CII的方法。采用ZORBAX 300SB C18色譜分離柱，流動相A為體積分數5%乙腈、0.05%三氟乙酸，流動相B為體積分數80%乙腈，線性梯度洗脫，檢測波長220 nm，柱溫35 ℃，通過精密度和回收率實驗證明了該方法的準確性。鄭婷等[38]采用分子排陰-高效液相色譜法測定UC-II含量，使用Sepax Nanofilm SEC-150色譜柱，流動相為0.15 mol/L磷酸鉀鹽緩沖液，檢測波長為210 nm，柱溫為25 ℃。結果表明，該方法線性關系、重復性、穩(wěn)定性良好。高效液相色譜法簡便、準確、樣品使用量小，且易于自動化，為UC-II的定量檢測提供了有效方法。

3.1.3 酶聯免疫吸附測定法

近20 年免疫學檢測法因快速、有效、靈敏度高等特點受到越來越多的重視[39]。目前市面上可以購買到的UC-II檢測試劑盒有兩種，一種是來自美國Chondrex公司生產的II型交原檢測試劑盒（#6018），另一種是中國江萊生物科技有限公司生產的UC-II ELISA檢測試劑盒。兩種試劑盒均采用酶聯免疫吸附法量化細胞或組織中的UC-II，可以準確測定微克級交原蛋白含量，但價格相對較高。

3.2 UC-II的定性檢測

3.2.1 SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析是鑒別UC-II純度最常用的方法[40]，由于UC-II是由3 條相同的α-鏈構成，所以在100～150 kDa附近有濃度較高的α1-鏈條帶，在200 kDa附近有一條濃度較低的β-鏈條帶，無其他雜蛋白帶，這是典型的UC-II SDS-PAGE圖譜。

3.2.2 氨基酸分析

目前普遍使用氨基酸分析儀來測定蛋白質水解液中的氨基酸組成。UC-II氨基酸組成具有一定的特點[41-42]，其中甘氨酸含量最高，約占總氨基酸殘基數的1/3，脯氨酸和羥脯氨酸約占1/4，此外還含有較多的丙氨酸，少量的酪氨酸和組氨酸，不含色氨酸，這是典型的動物CII的氨基酸組成（表3）。

表3 美國Sigma公司CII標準品的氨基酸組成[19]Table 3 Amino acid composition of type II collagen standard produced by Sigma Chemical Company, USA[19]

3.2.3 紫外吸收光譜分析

UC-II鏈中-CO-、-COOH、-NH-都是生色基團，在200～240 nm波長處的短波紫外吸收光區(qū)有特征吸收，此吸收峰與多肽鏈的氨基酸組成及螺旋程度有關，具有交原三螺旋結構的典型紫外吸收圖譜特點。研究表明，雞胸軟骨UC-II在220 nm波長處出現最大吸收峰，魷魚軟骨UC-II在224.5 nm波長處出現最大吸收峰[30]，中華鱘軟骨UC-II在229 nm波長處出現最大吸收峰[31]，藍鯊軟骨UC-II在226 nm波長處出現最大吸收峰[43]。

3.2.4 傅里葉變換紅外光譜分析

酰胺I、酰胺II與酰胺III帶和交原蛋白的分子序列及三螺旋結構有關。根據Muyonga等[44]的報道，N-H伸縮振動吸收峰出現在3 400～3 450 cm-1處，表明其N-H伸縮參與了分子中氫鍵的形成。1 651.3 cm-1附近為酰胺I帶的C＝O伸縮振動峰，吸收峰最強，是蛋白質二級結構變化的敏感區(qū)域。1 557.29 cm-1處為酰胺II帶的吸收峰，由N-H彎曲振動和C-N伸縮振動產生，為β-折疊和無規(guī)卷曲疊加產生的吸收帶。1 200～1 400 cm-1的特征吸收帶是由N-H伸縮振動和-COO-的對稱伸縮振動引起的，這是其他蛋白質所沒有的紅外光譜特征，這與交原蛋白中甘氨酸和特征氨基酸羥脯氨酸、脯氨酸含量高且形成獨特的（Gly-Pro-Hyp）n序列有關。1 200～1 360 cm-1譜帶歸屬酰胺III帶，由C-N伸縮和N-H彎曲引起。通過傅里葉變換紅外光譜可對UC-II進行定性分析。

3.2.5 熱穩(wěn)定溫度分析

差示掃描量熱法是測定蛋白質熱穩(wěn)定性常用的實驗方法[45]。UC-II的變性溫度近似等于放熱曲線峰值所對應的溫度[46]。研究表明，雞軟骨UC-II的變性溫度為44 ℃[19]，羊軟骨UC-II的變性溫度為39 ℃[26]，藍鯊UC-II的變性溫度為41 ℃[43]，中華鱘UC-II變性溫度為31.5 ℃[31]。

3.2.6 圓二色光譜分析

圓二色光譜是測定蛋白質二級結構的常見方法，廣泛應用于UC-II的結構測定中。在198 nm波長處附近出現的負吸收譜帶是UC-II分子構象中無規(guī)卷曲結構的典型特征；在220 nm波長處附近出現的正吸收譜帶是左旋聚脯氨酸（P-II）構型肽鏈圓二色光譜的典型特征，213 nm波長處出現正負交叉點，這是交原蛋白三螺旋結構的典型特征[47]。該方法可快速鑒定UC-II的三螺旋結構是否被破壞，當UC-II的三螺旋結構被完全破壞時，正吸收峰完全消失，負吸收峰明顯紅移[48]。

4 UC-II的應用現狀

UC-II是關節(jié)軟骨中不可或缺的交原蛋白成分，并且在軟骨細胞的發(fā)育和成熟過程中發(fā)揮至關重要的作用。同時在類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎的病理研究方面以及口服治療類風濕關節(jié)炎方面已有臨床實驗報道[49-56]。Gupta等[57]研究證明UC-II通過干擾局部免疫作用于關節(jié)炎癥，口服少量UC-II（10 mg）可抑制針對關節(jié)軟骨中CII的免疫反應，這種機制被稱為口服耐受。UC-II的作用機理是口服后到達小腸Peyer’s淋巴結，經腸道內抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells，APC）在細胞內將外源性抗原UC-II進行加工、處理，并形成主要組織相容性復合體-抗原肽復合體，然后激活調節(jié)性T細胞產生抗炎癥因子轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白細胞介素（interleukin，IL）4、IL-10，下調T細胞攻擊關節(jié)內交原活性，從而減輕疼痛和炎癥[58]（圖4）。UC-II的作用在不同的動物模型實驗中均已得到證實。研究表明，UC-II可顯著減輕犬類在骨關節(jié)炎期間的炎癥反應和疼痛程度[59-62]。Gupta等[63]以馬為實驗對象評估UC-II對關節(jié)炎的作用，相比對照組，每天接受80、120、160 mL UC-II的馬各項指標均表明關節(jié)炎得到了明顯改善。雖然貓對非甾體抗炎藥的敏感性與狗相比是有限的，但Blair等[64]的研究表明，一種包含10 mg UC-II的新型補充劑可以通過口服耐受減輕貓骨關節(jié)炎相關的癥狀。同時關于UC-II的安全性也備受關注，Marone等[65]通過長達90 d的家兔急性經口毒性、急性皮膚毒性、原發(fā)性皮膚刺激性和原發(fā)性眼部刺激性毒性等多種毒理學實驗評估UC-II的廣譜安全性，尸檢后未觀察到體質量變化或不良反應。葉春婷等[66]通過小鼠急性毒性實驗、新西蘭白兔刺激性實驗、豚鼠過敏性實驗及白兔溶血性實驗等再次證實UC-II無毒副作用，并具有良好的細胞相容性，對細胞的增殖有促進作用。

圖4 UC-II在骨關節(jié)中作用機制的模擬示意圖[14]Fig.4 Schematic diagram of the proposed mode of action of type II collagen (UC-II) in joints[14]

美國Interhealth公司生產的UC-II經過美國食品藥物管理局售前通知的批準，獲得GRAS（Generally Recognized as Safe）認證[67]，并且在鈣爾奇、Move Free等產品中（如鈣爾奇UC2速效骨交原、Move Free舒鈣骨交原）得到應用。在日本，UC-II作為具有關節(jié)支撐作用的功能性食品已得到了批準[68]，日本Bell Corporation公司推出UC-II+交囊，包含UC-II、甲基硫?；淄?、氨基葡萄糖等多種成分，成為解決腰痛、關節(jié)痛的速效配方。在中國，2016年國家衛(wèi)計委批準UC-II（又更名為含UC-II軟骨粉）可作為普通食品生產經營。該產品質量指標按照企業(yè)標準執(zhí)行，衛(wèi)生安全指標按照GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》、GB 29921—2013《食品安全國家標準 食品中致病菌限量》執(zhí)行。國內市售的CII肽一般三股螺旋分子結構已被破壞。2017年北京盛美諾生物技術有限公司獲得生產許可，已能夠規(guī)模化生產含UC-II軟骨粉[69]。

5 結 語

UC-II因其特定的致密纖維結構而不易提取，研究進展緩慢，目前大多數研究僅適用于實驗室小規(guī)模的制備，存在處理量小、生產工藝繁瑣、耗時長、實驗試劑成本高等問題，因此開發(fā)適合工廠大量生產、純度高、綠色環(huán)保且成本低廉的提取工藝，在不破壞交原蛋白三螺旋結構的基礎上，將天然組織轉化為純度較高的商品是UC-II研發(fā)的創(chuàng)新方向。UC-II在國外已有較大的市場，但在國內對其認知還不夠深入，國內市場基本處于起步階段，雖然已有一些預防和治療關節(jié)疾病的UC-II保健品，配方基本是UC-II、氨糖和硫酸軟骨素等，但普遍因口感不好而制作成交囊或片劑吞服食用，其他類型食品鮮見報道；因此，拓寬UC-II在食品領域的應用范圍也是未來的一個發(fā)展方向。UC-II作為治療關節(jié)炎的重要食品性原料，必將有廣闊的發(fā)展前景。