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      王不留行對(duì)脂多糖和H2 O2誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞炎性反應(yīng)和氧化反應(yīng)的影響

      2021-09-27 09:37:58袁德俊吳康郁黃曉冰
      中成藥 2021年7期
      關(guān)鍵詞:提物貨號(hào)培養(yǎng)箱

      袁德俊,吳康郁,黃曉冰

      (廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510378)

      王不留行為石竹科植物麥藍(lán)菜Vaccaria segetalis(Neck.)Garcke 的干燥成熟種子,別名奶米、王不留、麥藍(lán)子、剪金子、留行子,是我國(guó)傳統(tǒng)常用中藥,性味苦,平,歸肝、胃經(jīng)。具有活血通經(jīng),下乳消腫,利尿通淋功能,用于乳汁不下、經(jīng)閉、痛經(jīng)、乳癰腫痛等癥[1]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明王不留行具有廣泛的藥理學(xué)作用,包括抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抑制血管生成等藥理作用[2]。

      目前王不留行抗炎活性研究較少。因此開展中藥王不留行相關(guān)藥效活性研究,有助于王不留行的發(fā)展與利用。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激RAW264.7 巨噬細(xì)胞是經(jīng)典體外炎癥模型,常用于研究藥物抗炎活性;過(guò)氧化氫(H2O2)可以造成細(xì)胞氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)將以LPS 刺激RAW264.7 巨噬細(xì)胞作為研究載體,通過(guò)測(cè)定相關(guān)炎性因子,探討王不留行抗炎藥效活性;以H2O2造成RAW264.7 巨噬細(xì)胞氧化損傷,探討王不留行抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)將為王不留行抗炎抗氧化作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

      1 材料

      1.1 藥物和試劑 RPMI?1640 培養(yǎng)基(批號(hào)#8113920)、胎牛血清(批號(hào)#42A0378K)、青霉素(批號(hào)#J160035)均購(gòu)買于美國(guó) Gibco 公司;脂多糖(LPS,批號(hào)#019M4009V)、二甲基亞砜(DMSO,貨號(hào)D2650)為美國(guó)Sigma 公司;MTT(貨號(hào)G4000,美國(guó)Progema 公司);PBS(貨號(hào)ST447)、一氧化氮(NO,貨號(hào)S0021S)檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);小鼠TNF?α(貨號(hào)ml002095)、IL?1β(貨號(hào) ml063132)、IL?6(貨號(hào)ml002293)、PGE2(貨號(hào) ml037542)、COX?2(貨號(hào)ml057994)ELISA 試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司);SOD(貨號(hào)A001?3?2)、CAT(貨號(hào)A007?1?1)、GSH?PX(貨號(hào)A005?1?2)、MDA(貨號(hào)A003?4?1)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。王不留行來(lái)源于嶺南中藥飲片有限公司,經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院吳康郁副主任中藥師鑒定為石竹科植物麥藍(lán)菜Vaccaria segetalis(Neck.)Garcke 的干燥成熟種子。

      1.2 細(xì)胞 RAW 264.7 小鼠單核巨噬細(xì)胞,購(gòu)自American Type Culture Collection(ATCC,USA)細(xì)胞資源中心。

      1.3 儀器 SW?CJ?1FD 型超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);DYS?810 型顯微鏡(上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司);HH4Y 型恒溫水浴鍋(上海啟前電子科技有限公司);Neofuge 15R 型高速冷凍離心機(jī)(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司);DOI?50 型恒溫培養(yǎng)箱(上海三騰儀器有限公司);LDZX?40BI 型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);酶標(biāo)儀和PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó)Thermo Scientific 公司)。

      2 方法

      2.1 王不留行醇提物制備 取藥材王不留行于高速中藥粉碎機(jī)中打成藥材粉末,過(guò)3 號(hào)篩(60 目篩),按1 ∶10 料液比用石油醚回流脫脂2 h,加熱蒸發(fā)至沒(méi)有石油醚味,按料液比1 ∶10 加入80%乙醇,回流提取3 次,每次2 h,將所得濾液合并,減壓濃縮至沒(méi)有醇味,冷凍干燥,即得[3]。

      2.2 RPMI?1640 完全培養(yǎng)基配制 RPMI?1640 培養(yǎng)基中添加10%滅活FBS 和1%青霉素,即得。

      2.3 LPS 溶液配制 稱取5 mg LPS 至量瓶中,加入PBS定容至10 mL,制成500 mg/L LPS 溶液,-20 ℃避光保存。取適量LPS 溶液,RPMI?1640 完全培養(yǎng)基稀釋至500 ng/mL后,0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾,即得。

      2.4 王不留行醇提物配制 稱取100 mg 王不留行醇提物溶于1.0 mL DMSO,制得100 mg/mL 母液,0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾,分別用RPMI?1640 完全培養(yǎng)基制成孔內(nèi)終質(zhì)量濃度為80、40、20、10 μg/mL,即得。

      2.5 MTT 法測(cè)定王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞細(xì)胞活力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 巨噬細(xì)胞,按照4.0×104/孔的細(xì)胞濃度接種在96 孔板中,之后放置在5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。第2 天棄去原培養(yǎng)基,進(jìn)行分組處理,正常組加入含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基,不同濃度給藥組分別加入80、40、20、10 μg/mL含完全培養(yǎng)基藥液培養(yǎng)24 h,每組6 個(gè)復(fù)孔。次日,每孔加入20 μL MTT 溶液,置于恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸棄培養(yǎng)液,并加入150 μL/孔DMSO 溶解,水平振蕩器搖動(dòng)10 min后收集DMSO 溶液,測(cè)定490 nm 波長(zhǎng)下的OD。

      2.6 MTT 法測(cè)定H2O2對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 巨噬細(xì)胞,按照4.0×104/孔的細(xì)胞濃度接種在96 孔板中,之后放置在5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。第2 天棄去原培養(yǎng)基,進(jìn)行分組處理,正常組加入含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基,其余各組分別加入不同濃度的H2O2溶液,每組6 個(gè)復(fù)孔。次日,每孔加入20 μL 的MTT 溶液,置于恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h 后吸棄培養(yǎng)液,并加入150 μL/孔的DMSO 溶解,水平振蕩器搖動(dòng)10 min 后收集DMSO 溶液,測(cè)定490 nm 波長(zhǎng)下的吸光度[4]。

      2.7 Griess 法測(cè)定王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 的NO 水平影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 巨噬細(xì)胞,按照4.0×104/孔的細(xì)胞濃度接種在96 孔板中,5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)基,進(jìn)行分組處理,正常組和模型組加入含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基,不同濃度給藥組分別加入40、20、10 μg/mL 含完全培養(yǎng)基藥液培養(yǎng)2 h,每組6 個(gè)復(fù)孔,2 h 后除了正常組,其余均加入500 ng/mL LPS 造模并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。次日,收集各孔培養(yǎng)基100 μL,并依照一氧化氮檢測(cè)試劑盒說(shuō)明,測(cè)定540 nm波長(zhǎng)下OD,計(jì)算各組NO 水平。

      2.8 王不留 行醇提物對(duì)TNF?α、IL?1β、IL?6 和iNOS mRNA 表達(dá)影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 巨噬細(xì)胞,按照4.0×104/孔的細(xì)胞濃度接種在96 孔板中,5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)基,進(jìn)行分組處理,正常組和模型組加入含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基,不同濃度給藥組分別加入40、20、10 μg/mL 含完全培養(yǎng)基藥液培養(yǎng)2 h,除了正常組其余各組均加入500 ng/mL LPS造模并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照Total RNA 提取試劑盒,反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,測(cè)定各樣品的TNF?α、IL?1β、IL?6、iNOSmRNA 表達(dá)。RT?PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用CFX 96TM Real?Time PCR Detection System 擴(kuò)增儀對(duì)cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增,條件為95 ℃、10 min;95 ℃、15 s,40 個(gè)循環(huán);60 ℃、60 s,40 個(gè)循環(huán),引物序列如表1 所示。以β?actin為內(nèi)參基因,計(jì)算相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt:ΔCt(對(duì)照組)=Ct(對(duì)照組目的基因)-Ct(對(duì)照組β?actin),ΔCt(正常組)=Ct(正常組目的基因)-Ct(正常組β?actin),ΔΔCt=ΔCt(對(duì)照組)-ΔCt(正常組),相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

      表1 目標(biāo)基因引物序列

      2.9 王不留 行醇提物對(duì)TNF?α、IL?1β、IL?6、PGE2、COX?2 表達(dá)影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 巨噬細(xì)胞,按4.0×104/孔接種在96 孔板中,5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)基,進(jìn)行分組處理,正常組和模型組加入含0.1%DMSO 的完全培養(yǎng)基,不同濃度給藥組分別加入40、20、10 μg/mL 含完全培養(yǎng)基藥液培養(yǎng)2 h,每組6 個(gè)復(fù)孔,2 h 后除了正常組,其余各組均加入500 ng/mL LPS 培養(yǎng)24 h。次日,收集各孔培養(yǎng)基,依照ELISA 試劑盒說(shuō)明測(cè)定TNF?α、IL?1β、IL?6、PGE2、COX?2 水平。

      2.10 王不留行醇提物對(duì)CAT、SOD、GSH?PX、MDA 水平的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 巨噬細(xì)胞,按4.0×104/孔接種在96 孔板中,5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)基,進(jìn)行分組處理,正常組和模型組加入含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基,不同濃度給藥組分別加入40、20、10 μg/mL 含完全培養(yǎng)基藥液培養(yǎng)24 h,每組6 個(gè)復(fù)孔,24 h 后除了正常組,其余各組均加入600 μmol/L H2O2培養(yǎng)4 h。4 h 后收集各孔培養(yǎng)基,依照試劑盒說(shuō)明測(cè)定CAT、SOD、GSH?PX、MDA 水平。

      2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 分別采用Graphpad Prism 6、SPSS 23.0軟件進(jìn)行制圖、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以()表示。多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較滿足方差齊性則用LSD 分析,不滿足方差齊性則用Dunnett T3 分析。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      3 結(jié)果

      3.1 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力影響 如圖1 所示,10、20、40 μg/mL 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的細(xì)胞活力具有較好的維持作用,分別達(dá)到95.73%、96.89%、92.77%;80 μg/mL 王不留行醇提物給藥組細(xì)胞活力為89.14%,但相比其余3 個(gè)較弱,因此本實(shí)驗(yàn)選擇給藥劑量為10、20、40 μg/mL。結(jié)果表明,10~80 μg/mL 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞沒(méi)有毒性。

      圖1 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞活力影響(n=6)

      3.2 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞TNF?α、IL?1β、IL?6 表達(dá)的影響 如圖2 所示,與正常組比較,RAW264.7細(xì)胞受到LPS 刺激后,TNF?α、IL?1β、IL?6 蛋白和mRNA表達(dá)均提高(P<0.01);給予王不留行醇提物干預(yù)后,TNF?α、IL?1β、IL?6 蛋白和mRNA 表達(dá)下調(diào)(P<0.05,P<0.01),其中40 μg/mL 王不留行醇提物給藥組下調(diào)效果最為突出,TNF?α mRNA 相對(duì)表達(dá)下降至42.46 倍,蛋白表達(dá)下降至505.00 pg/mL。

      3.3 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞iNOS 和COX?2 信號(hào)通路表達(dá)影響 如圖3 所示,與正常組相比,模型組iNOSmRNA 表達(dá)及NO、COX?2、PGE2水平增 加(P<0.01);給予20、40 μg/mL 王不留行醇提物干預(yù)后,iNOSmRNA 表達(dá)和NO 分泌水平受到抑制(P<0.05,P<0.01),10、20、40 μg/mL 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 可抑制COX?2、PGE2表達(dá)(P<0.01)。

      圖3 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞iNOS 和COX?2 表達(dá)的影響(n=6)

      3.4 H2O2對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力影響 如圖4所示,不同濃度H2O2對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力造成不同影響,且隨著H2O2濃度增大,其對(duì)細(xì)胞的損傷越大。當(dāng)H2O2濃度低于600 μmol/L 對(duì)細(xì)胞造成的損傷不顯著,濃度超過(guò)600 μmol/L 則對(duì)細(xì)胞造成過(guò)度死亡。因此本次實(shí)驗(yàn)選擇600 μmol/L H2O2作為誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞體外氧化損傷模型的濃度藥物。

      圖4 不同濃度H2O2 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力影響(n=6)

      3.5 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞CAT,SOD 和GSH?PX活性和MDA 水平影響 如圖5 所示,H2O2刺激RAW264.7 巨噬細(xì)胞后,細(xì)胞CAT、SOD、GSH?PX 水平均下調(diào),MDA 水平升高(P<0.01);給予王不留行醇提物干預(yù)后,細(xì)胞CAT、SOD、GSH?PX、MDA 水平降低(P<0.05,P<0.01),其中40 μg/mL王不留行醇提物給藥組藥效最好,CAT 水平由6.38 U/mL漲 至17.15 U/mL,SOD 水平由1.50 U/mL 漲 至17.15 U/mL,GSH?PX 水平由11.98 漲至44.52 U/L,MDA 水平由21.10 nmol/mL 降至12.00 nmol/mL。

      圖5 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞CAT、SOD、GSH?PX、MDA 水平的影響(n=6)

      4 討論

      采用小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)載體,探討藥物是否對(duì)細(xì)胞活性具有干擾作用。結(jié)果說(shuō)明10~80 μg/mL王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性。接著采用LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 巨噬細(xì)胞作為體外炎癥模型,采用H2O2誘導(dǎo)RAW264.7 巨噬細(xì)胞作為體外氧化損傷模型,探討王不留行醇提物抗炎抗氧化活性。

      腫瘤壞死因子(TNF?α)是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最重要的因子之一,能誘發(fā)白介素1β(IL?1β),白介素6(IL?6)等炎性因子的分泌并參與組織、器官以及機(jī)體的損傷等重要的炎癥反應(yīng)過(guò)程[5?6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,給予王不留行醇提物干預(yù)后,TNF?α、IL?1β 及IL?6 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)顯著下調(diào),表明了王不留行具有抗炎活性。進(jìn)一步探討研究發(fā)現(xiàn)王不留行醇提物抗炎活性與其調(diào)控調(diào)控誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)和環(huán)氧化酶2(COX?2)信號(hào)通路蛋白表達(dá)有關(guān)。iNOS 和COX?2 在體內(nèi)分別誘導(dǎo)一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)生成。過(guò)高含量NO 和PGE2引起氧化反應(yīng)并損傷細(xì)胞,造成多種炎癥疾病[7?8]。因此,調(diào)控iNOS 和COX?2 表達(dá),抑制NO 和PGE2的過(guò)度生成,可以抑制炎性反應(yīng)的進(jìn)程[9?11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,給予王不留行醇提物干預(yù)后,iNOS mRNA 水平和COX?2 表達(dá)顯著下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明王不留行醇提物能夠調(diào)控iNOS 和COX?2 信號(hào)通路蛋白表達(dá),抑制下游的TNF?α,IL?1β 及IL?6 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá),發(fā)揮抗炎活性。

      過(guò)氧化氫酶(CAT),超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH?PX)是機(jī)體內(nèi)調(diào)控氧化應(yīng)激的重要相關(guān)酶,對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化的平衡起著至關(guān)重要的作用[12?14]。丙二醛(MDA)為不飽和脂肪酸脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物,其在體內(nèi)的堆積會(huì)造成細(xì)胞和組織損傷。本研究結(jié)果顯示,在給予王不留行醇提物后,細(xì)胞中CAT,SOD 和GSH?PX 活性明顯提高,同時(shí)MDA 含量顯著降低,說(shuō)明王不留行醇提物具有促進(jìn)抗氧化酶活性,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的藥物活性。

      綜上所述,本研究證明了王不留行通過(guò)抑制iNOS 和COX?2 信號(hào)通路發(fā)揮抗炎活性,以及通過(guò)促進(jìn)抗氧化酶活性,恢復(fù)體內(nèi)氧化與抗氧化平衡,發(fā)揮抗氧化活性。

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