SCNN1B在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其調(diào)節(jié)肺癌對順鉑的敏感性*

丁家寶 高鯤 張倩 梁華剛 劉赫 李建

(秦皇島市第一醫(yī)院1.胸外科；2.風(fēng)濕免疫科，河北 秦皇島 066000)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌的主要病型，約占所有肺癌的80%左右，數(shù)據(jù)報道65%～70%的NSCLC患者在確診時已處于中晚期，失去手術(shù)機會，以化療為主的綜合治療是患者取得生存獲益的關(guān)鍵醫(yī)療措施[1-2]。順鉑聯(lián)合吉西他濱(Cisplatin Combined With Gemcitabine,GP)是當(dāng)前臨床治療晚期NSCLC的一線化療方案，臨床應(yīng)用廣泛，雖能獲得良好的療效，但有效率僅為20%～40%[3]。多數(shù)研究認(rèn)為腫瘤耐藥是影響化療有效率的重要影響因素之一，也是患者預(yù)后不良的獨立危險因素[4-5]。探尋與NSCLC臨床特征、化療耐藥相關(guān)的生物新標(biāo)志物，于NSCLC早期診療工作、預(yù)后評估、開發(fā)新的治療靶點及改善遠(yuǎn)期生存上均有積極意義。SCNN1B是新抑癌基因，往期研究已證實其在胃癌等惡性腫瘤疾病中存在異常低表達(dá)現(xiàn)象[6]。但少見SCNN1B表達(dá)與NSCLC患者化療藥物敏感性的研究。故本研究采集資料，分析SCNN1B在NSCLC中的表達(dá)，并進(jìn)一步探討其調(diào)節(jié)肺癌對順鉑敏感性的價值，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年12月～2019年12月在本院診治為NSCLC患者的病理標(biāo)本130例。其中男102例、女28例；年齡44～79歲，平均(60.18±8.42)歲；88例吸煙；中高分化88例，低分化62例；鱗癌68例，腺癌62例；國際肺癌研究學(xué)會(IASLC)NSCLC TNM分期Ⅲ期94例、Ⅳ期36例。A549細(xì)胞株、順鉑耐藥株A549/DDP細(xì)胞株購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>18周歲。②晚期NSCLC。③病理組織標(biāo)本采集前未接受過癌癥相關(guān)放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料缺失。②病理標(biāo)本采集前接受過NSCLC相關(guān)治療。

1.2 試劑與儀器 單克隆抗體(美國cell signaling Technology公司)；順鉑DDP(上海Selleck公司)；HRP標(biāo)記的抗鼠或抗兔二抗(武漢Proteintech公司)；CCK8及Annexin-V/PI凋亡試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；引物、siRNA-SCNN1B、siRNA陰性對照(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)；HiScript II One Step RT-PCR Kit (Dye Plus)試劑盒(Vazyme Biotech Co.,Ltd)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司)；LightCycler 96實時熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)；引物序列合成(上海Invitrogen公司)。

1.3 方法

1.3.1 NSCLC組織SCNN1B表達(dá) 取NSCLC患者病理標(biāo)本，含液氮的研缽中充分研磨，Trizol試劑盒說明書提取組織總RNA并檢測RNA濃度；參照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，應(yīng)用LightCycler 96實時熒光定量PCR儀檢測組織中SCNN1BmRNA表達(dá)；PCR反應(yīng)體系：Real Master 23 μL，上下游引物各0.4 μL，探針0.7 μL、Taq酶0.5μL，模板5 μL；總反映體系30 μL；反應(yīng)條件：94℃10 s變性，60℃30 s退火和延伸，循環(huán)數(shù)60個；以為β-action為內(nèi)參，2-△△Ct法計算SCNN1BmRNA相對表達(dá)量。

1.3.2 SCNN1B調(diào)節(jié)肺癌對順鉑敏感性檢測 ①SCNN1B轉(zhuǎn)染：A549、順鉑耐藥株A549/DDP細(xì)胞株常規(guī)應(yīng)用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，按3×104～4×104個/mL密度接種至96孔板；設(shè)A549細(xì)胞組、A549/DDP細(xì)胞組、siRNA-SCNN1B組、siRNA-NC組，每組設(shè)6個復(fù)孔；其中siRNA-SCNN1B組、siRNA-NC組待細(xì)胞生長至60%匯合時加入SCNN1B過表達(dá)質(zhì)粒及空載質(zhì)粒(陰性對照)，參照Lipofectamine 2000試劑盒說明書轉(zhuǎn)染siRNA-SCNN1B(5′-GGATCGGGAAAGTAAAGAAATT-3′)、siRNA-NC(5′-UUCUCCGAACGUGUGACGU TT-3′)，構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)siRNA基因的A549/DDP(siRNA-SCNN1B)細(xì)胞、siRNA-NC細(xì)胞；參照Trizol試劑盒說明書提取各組細(xì)胞RNA并檢測RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄呈cDNA后參照RT-PCR試劑盒說明書檢測SCNN1BmRNA表達(dá)(F：5′-GCCTTCTCTGCTATGTCTGAA-3′；R：5′-CTGATGAACACACACCAACTT-3′)；擴增條件：95℃5 min、95℃10 s、60℃30 s，40個循環(huán)；95℃15 s、60℃60 s、95℃15 s終止反應(yīng)；以β-actin(F：5′-CCACTGGCATCGTGATGGACTCC-3′；R：5′-GCCGTGGTGGTGAAGCTGTAGC-3′)為內(nèi)參，計算SCNN1BmRNA相對表達(dá)量，驗證SCNN1B轉(zhuǎn)染效果。②細(xì)胞藥物敏感性檢測：取A549細(xì)胞組、A549/DDP細(xì)胞組、siRNA-SCNN1B組、siRNA-NC組細(xì)胞，按3×105個/mL密度接種至96孔板，每組設(shè)6個平行孔，按濃度梯度(1、2、4、16、32、64、128、256 μg/mL)加入順鉑，培養(yǎng)72 h后使用Vi-cell細(xì)胞活力分析儀測定細(xì)胞活力，計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。③細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期檢測：取A549細(xì)胞組、A549/DDP細(xì)胞組、siRNA-SCNN1B組、siRNA-NC組細(xì)胞，按3×105個/mL密度接種至96孔板，每組設(shè)6個平行孔，按濃度梯度(5、10 μmol/mL)加入順鉑，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，不經(jīng)EDTA胰酶消化離心處理，預(yù)冷的PBS液沖洗2次，每管用500 μL標(biāo)記緩沖液重懸，避光，先加入5 μL Annexin V-FITC，上機前15 min加入5 μL PI進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，分析細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期。④耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)：采用Western blot法檢測Bcl-2、生存素(Survivin)、周期蛋白D1(CyclinD1)、表皮生長因子受體(EGFR)、多藥耐藥相關(guān)蛋白-1(MRP1)、肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)表達(dá)；取A549細(xì)胞組、A549/DDP細(xì)胞組、siRNA-SCNN1B組、siRNA-NC組細(xì)胞，按3×105個/mL密度接種至96孔板，24 h后收集細(xì)胞裂解液提取蛋白，BCA法測定細(xì)胞裂解物中蛋白含量，取等量蛋白質(zhì)，以10% SDS-PAGE法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜一抗孵育4℃過夜、洗去一抗，HRP連接的二抗在37℃條件下孵育2 h，洗滌，ECL顯色、曝光分析結(jié)果，以β-action為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0版進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用率(%)描述，組間比較采用2檢驗；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P<0.05為差異統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SCNN1B在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá) 130例NSCLC患者SCNN1BmRNA表達(dá)量為0.48(0.12，1.19)；以0.48為中位數(shù)，低表達(dá)(≤0.48)96例，高表達(dá)(>0.48)34例；低分化患者中SCNN1BmRNA低表達(dá)率明顯高于中高分化患者，TNM分期Ⅳ期患者中SCNN1BmRNA低表達(dá)率明顯高于Ⅲ期(P<0.05)，見表1。

表1 SCNN1B在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)[n(×10-2)]

2.2 SCNN1B調(diào)控NSCLC對順鉑的敏感性

2.2.1 SCNN1B表達(dá)量 A549細(xì)胞組、A549/DDP細(xì)胞組、siRNA-SCNN1B組、siRNA-NC組SCNN1BmRNA水平分別為(1.22±0.21)、(0.72±0.10)、(0.97±0.12)、(0.70±0.09)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.765，均P<0.05)；其中A549/DDP細(xì)胞組SCNN1BmRNA水平顯著低于A549細(xì)胞組(t=6.508，P<0.05),與A549/DDP細(xì)胞組比較，siRNA-SCNN1B組SCNN1BmRNA水平明顯上升(t=3.379，P<0.05)。

2.2.2 細(xì)胞活力檢測 與siRNA-NC組細(xì)胞比較，順鉑作用24 h后，siRNA-SCNN1B組對順鉑的敏感性明顯增加，siRNA-SCNN1B組對順鉑的半數(shù)抑制濃度為(22.17±1.35)μmol/L，明顯低于siRNA-NC組的(48.58±3.14)μmol/L，逆轉(zhuǎn)系數(shù)下降(221.69±26.27)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.927，P<0.05)。

2.2.3 細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期檢測 與A549細(xì)胞組比較，A549/DDP細(xì)胞組細(xì)胞凋亡率明顯下降(t=24.476，P<0.05)，siRNA-SCNN1B組細(xì)胞凋亡率則較A549/DDP細(xì)胞組明顯上升(t=16.579，P<0.05)；在細(xì)胞周期上，與A549細(xì)胞組比較，A549/DDP細(xì)胞組細(xì)胞周期G0/G1期比例明顯上升(t=9.439，P<0.05))，siRNA-SCNN1B組的細(xì)胞周期G0/G1期比例則較A549/DDP細(xì)胞組明顯下降(t=5.595，P<0.05))。見表2。

表2 細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期檢測

2.2.4 Bcl-2、生存素、細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá) 與A549細(xì)胞組比較，A549/DDP細(xì)胞組Bcl-2、生存素、Cyclin D1水平明顯上升(t=12.359、38.140、27.923，均P<0.05)；siRNA-SCNN1B組Bcl-2、生存素、Cyclin D1水平則較A549/DDP細(xì)胞組明顯下降(t=3.237、2.674、3.943，均P<0.05)。見表3。

表3 Bcl-2、生存素、Cyclin D1表達(dá)

2.2.5 相關(guān)多藥耐藥蛋白表達(dá) 與A549細(xì)胞組比較，A549/DDP細(xì)胞組EGFR、MPR1、LRP水平明顯上升(t=7.467、9.859、10.844，均P<0.05)；siRNA-SCNN1B組EGFR、MPR1、LRP水平則較A549/DDP細(xì)胞組明顯下降(t=3.992、6.062、5.434，均P<0.05)。見表4。

表4 相關(guān)多藥耐藥蛋白表達(dá)

3 討論

肺癌是我國城市人口惡性腫瘤死因首位，NSCLC占肺癌的80%，其中75%的患者在確診時病情已為中晚期，是影響國人生命健康的重要疾病之一[7]。探究肺癌的發(fā)病機制、耐藥機制分子標(biāo)記物，為肺癌診治通過思路及理論依據(jù)于緩解我國甚至全球癌癥負(fù)擔(dān)有益。SCNN1B基因位于染色體16p12.2-p12.1，當(dāng)前關(guān)于SCNN1B的研究多集中在原發(fā)性高血壓、醛固酮增多癥上[8-10]。但有研究通過甲基化芯片掃描證實在人類胃癌中，SCNN1B基因啟動子CpG區(qū)域呈高甲基化表達(dá)，并在細(xì)胞試驗中證實人類胃癌細(xì)胞株中SCNN1B沉默表達(dá)，認(rèn)為與SCNN1B基因啟動子CpG區(qū)域甲基化有關(guān)，作為新抑癌基因，SCNN1B或可作為抑癌基因參與胃癌發(fā)生發(fā)展[11]。但SCNN1B與惡性腫瘤疾病的關(guān)系仍需大量循證醫(yī)學(xué)證據(jù)佐證。本研究結(jié)果與雷銳等[12]的研究結(jié)論相似，均提示SCNN1BmRNA與NSCLC患者組織分化程度、臨床分期具密切關(guān)聯(lián)。雷銳等通過基因探針富集分析(GSEA)證實SCNN1B可通過與細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、錯配修復(fù)等一系列信號通路發(fā)揮抑癌基因作用，且SCNN1B高表達(dá)的NSCLC患者具更長的總生存期及無復(fù)發(fā)生存期[HR(95%CI)：0.62(0.46～0.85)、0.44(0.26～0.95)]。

化療治療是挽救中晚期肺癌患者主要手段。順鉑是肺癌的基礎(chǔ)治療性藥物，可與腫瘤細(xì)胞的DNA形成順鉑加合物來激發(fā)腫瘤細(xì)胞循環(huán)停止、凋亡過程，但易產(chǎn)生腫瘤耐藥[13-14]。因此本研究開展細(xì)胞試驗明確SCNN1B對順鉑敏感性的影響。研究顯示，A549/DDP細(xì)胞組SCNN1BmRNA水平顯著低于A549細(xì)胞組；與A549/DDP細(xì)胞組比較，siRNA-SCNN1B組SCNN1BmRNA水平明顯上升；與siRNA-NC組比較，順鉑作用24h后，siRNA-SCNN1B組細(xì)胞對順鉑的敏感性明顯增加，siRNA-SCNN1B組對順鉑的半數(shù)抑制濃度明顯低于siRNA-NC組。同時本研究還顯示與A549細(xì)胞組比較，A549/DDP細(xì)胞組細(xì)胞凋亡率明顯下降，siRNA-SCNN1B組細(xì)胞凋亡率則較A549/DDP細(xì)胞組明顯上升；在細(xì)胞周期上，與A549細(xì)胞組比較，A549/DDP細(xì)胞組細(xì)胞周期G0/G1期比例明顯上升，siRNA-SCNN1B組細(xì)胞周期G0/G1期比例則較A549/DDP細(xì)胞組明顯下降。由此可見，與A549細(xì)胞比較，在順鉑耐藥的A549細(xì)胞株中SCNN1B明顯低表達(dá)，靶向上調(diào)SCNN1B后半數(shù)抑制濃度上調(diào)，細(xì)胞凋亡率上升，細(xì)胞周期G0/G1期比例下降；提示SCNN1B與肺癌對順鉑的敏感性有密切關(guān)聯(lián)。

為進(jìn)一步探究其耐藥機制，本研究分析了SCNN1B對Bcl-2、生存素、Cyclin D1的影響。Bcl-2是反映細(xì)胞凋亡的重要蛋白，其可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，且其高表達(dá)與腫瘤耐藥存在密切關(guān)聯(lián)[15-16]。生存素是凋亡抑制蛋白家族成員，具典型的腫瘤特異性，在抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及血管新生上扮演重要角色[17-18]。而Cyclin D1則屬細(xì)胞周期基因，可通過調(diào)控細(xì)胞周期G1期參與腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，在多種腫瘤疾病中均呈異常高表達(dá)現(xiàn)象，且其水平與腫瘤惡性程度、惡化程度、預(yù)后顯著相關(guān)[19-20]。而本研究顯示與A549細(xì)胞比較，原發(fā)A549/DDP細(xì)胞中Bcl-2、生存素、Cyclin D1水平明顯上升，SCNN1B轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞的Bcl-2、生存素、Cyclin D1水平則較原發(fā)A549/DDP細(xì)胞明顯下降。提示靶向上調(diào)SCNN1B可促進(jìn)肺癌順鉑耐藥細(xì)胞凋亡。Qian等[21]也報道，SCNN1B可降解GRP78抑制胃癌生長及轉(zhuǎn)移，這與本研究結(jié)論相似。EGFR、MPR1、LRP均是耐藥相關(guān)蛋白[23-25]，本研究顯示，靶向上調(diào)SCNN1B可抑制EGFR、MPR1、LRP等耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)，從而改善甚至逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥。

4 結(jié)論

NSCLC患者SCNN1B與肺癌組織分化程度、腫瘤分期存在密切關(guān)聯(lián)，肺癌耐藥細(xì)胞存在Bcl-2、生存素、Cyclin D1、EGFR、MPR1、LRP等凋亡相關(guān)蛋白及耐藥蛋白表達(dá)異常，靶向上調(diào)SCNN1B可抑制上述凋亡相關(guān)蛋白及耐藥蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并阻滯細(xì)胞周期。