酶解玉米漿在谷氨酸發(fā)酵工藝中的應(yīng)用

陳曉妮,李學(xué)朋,伏廣好,周 敬,徐 娜

(1.內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)生物發(fā)酵節(jié)能環(huán)保技術(shù)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030)

玉米漿(Corn steep liquor,CSL)是生產(chǎn)玉米淀粉過程中的副產(chǎn)物,為玉米的亞硫酸浸泡液,經(jīng)真空濃縮后得到的黃褐色液體。玉米漿中含有豐富的可溶性蛋白、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)素及前體物質(zhì),約含40%～50%固體物質(zhì)[1],可作為微生物生長(zhǎng)繁殖所需有機(jī)氮源,也是谷氨酸發(fā)酵所需的重要營(yíng)養(yǎng)劑,同時(shí)也可用作水溶性植物蛋白和復(fù)合肥料添加劑等[2-3]。

酸水解蛋白液對(duì)環(huán)境污染較嚴(yán)重,且價(jià)格昂貴。玉米漿作為廉價(jià)有機(jī)氮源,其中部分氨基酸含量高于其他氮源,可替代或減少豆粕水解液等高價(jià)位氮源應(yīng)用于谷氨酸發(fā)酵中,能提高玉米漿的附加值、谷氨酸產(chǎn)酸及轉(zhuǎn)化率,降低谷氨酸生產(chǎn)成本[4-6]等。而玉米漿中的磷雖然以植酸鈣鎂形式存在,也會(huì)影響谷氨酸的發(fā)酵過程[7],但是玉米漿中的氨基酸及無機(jī)磷均以大分子形式存在,難以被谷氨酸菌種利用。劉康樂等[8]采用水解法對(duì)玉米漿進(jìn)行處理,將大分子蛋白分解為易被利用的小分子氨基酸,降低了生產(chǎn)成本;牛福華等[9]通過不同方法處理玉米漿,結(jié)果發(fā)現(xiàn)玉米漿在酶解后有效增加了氨基酸的含量;李海燕[10]將玉米漿中含有的植酸鈣通過植酸酶進(jìn)行酶解,可分解為無機(jī)磷和肌醇,提高了玉米漿的利用度。因此,通過雙酶解玉米漿得到氨基酸和無機(jī)磷,替代谷氨酸發(fā)酵配方中的磷酸氫二鉀及酸水解蛋白液,可以達(dá)到提高谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)指標(biāo)和產(chǎn)品質(zhì)量的目的,同時(shí)起到了保護(hù)環(huán)境的作用[11]。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

玉米漿,內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司淀粉車間提供;酸性蛋白酶、植酸酶和中性蛋白酶,北京伊塔生物科技有限公司;茚三酮、釩鉬酸銨、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸錳和復(fù)合氨基酸粉等,均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

S-433Dup氨基酸分析儀,德國(guó)Sykam公司;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用有限公司;K9840自動(dòng)凱氏定氮儀,海能未來技術(shù)集團(tuán)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玉米漿酶解條件單因素實(shí)驗(yàn)

分別選取中性蛋白酶和酸性蛋白酶復(fù)配、中性蛋白酶和植酸酶復(fù)配、酸性蛋白酶和植酸酶復(fù)配使用。在同等實(shí)驗(yàn)條件下,酸性蛋白酶和植酸酶復(fù)配使用效果最佳,酶解pH為玉米漿,原有pH為3.8。

1) 酶添加量

酸性蛋白酶添加量:將酸性蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%,0.15%,0.2%,0.25%,0.3%分別加入玉米漿中,50 ℃恒溫酶解18 h,測(cè)定蛋白質(zhì)水解度[12]。

植酸酶添加量:將植酸酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%,0.13%,0.15%,0.18%,0.2%分別加入玉米漿中,50 ℃恒溫酶解18 h,測(cè)定蛋白質(zhì)水解度。

2) 酶解溫度

將酸性蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%和植酸酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%在玉米漿中進(jìn)行充分混勻,于40,45,50,55,60 ℃不同溫度下恒溫酶解18 h,檢測(cè)其蛋白質(zhì)水解度。

3) 酶解時(shí)間

將酸性蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%和植酸酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%在玉米漿中進(jìn)行充分混勻,于50 ℃恒溫分別酶解10,12,14,16,18 h,測(cè)定蛋白質(zhì)水解度。

1.2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解條件

基于玉米漿酶解條件的單因素實(shí)驗(yàn),選擇酸性蛋白酶添加量A、植酸酶添加量B、酶解溫度C和酶解時(shí)間D這4種因素進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)如表1所示,確定最佳的玉米漿水解工藝及參數(shù)。

表1 酶解玉米漿正交實(shí)驗(yàn)因素水平

1.2.3 谷氨酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

玉米漿經(jīng)過酸性蛋白酶和植酸酶水解后,進(jìn)行小試實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其發(fā)酵效果。

設(shè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,將不同谷氨酸發(fā)酵配方于5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn),谷氨酸菌種的接種量為10%。

對(duì)照組:原有谷氨酸發(fā)酵配方與玉米漿進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵。

實(shí)驗(yàn)組:在原有谷氨酸發(fā)酵配方的基礎(chǔ)上,增加部分氯化鉀,將原發(fā)酵工藝中的磷酸氫二鉀和豆?jié)馊刻娲鸀殡p酶解后的玉米漿。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酸性蛋白酶添加量對(duì)水解度的影響

于玉米漿中加入不同量的酸性蛋白酶,與植酸酶添加量0.2%進(jìn)行混勻后55 ℃水解16 h。酸性蛋白酶添加量與玉米漿水解度關(guān)系如圖1所示。

圖1 酸性蛋白酶添加量對(duì)玉米漿水解度的影響Fig.1 The effect of the amount of acid protease on the degree of hydrolysis of CSL

由圖1可知:當(dāng)酸性蛋白酶添加量較低時(shí),與底物相結(jié)合,反應(yīng)速度隨著酶添加量的升高而增加。隨著酸性蛋白酶添加量升高,水解度也隨著酶與底物比的增大而緩慢上升直至達(dá)到平衡。

2.1.2 植酸酶添加量對(duì)水解度的影響

添加不同量的植酸酶于玉米漿中,與酸性蛋白酶添加量0.3%進(jìn)行混勻后55 ℃水解16 h。植酸酶添加量與玉米漿水解度關(guān)系如圖2所示。

圖2 植酸酶添加量對(duì)玉米漿水解度的影響Fig.2 The effect of the amount of phytase on the degree of hydrolysis of CSL

由圖2可知:當(dāng)植酸酶添加量較低時(shí),與底物相結(jié)合,反應(yīng)速度隨著酶添加量的升高而增加。隨著酸性蛋白酶添加量升高,水解度也隨著酶與底物比的增大而緩慢上升直至達(dá)到平衡。當(dāng)植酸酶添加量超過0.15%后,水解度增長(zhǎng)趨勢(shì)較為平緩。

2.1.3 酶解溫度對(duì)水解度的影響

在玉米漿中添加酸性蛋白酶添加量0.3%和植酸酶添加量0.2%進(jìn)行混勻,通過不同溫度對(duì)玉米漿進(jìn)行酶解16 h。溫度與玉米漿水解度關(guān)系如圖3所示。

圖3 酶解溫度對(duì)玉米漿水解度的影響Fig.3 The effect of enzymolysis temperature on the degree of hydrolysis of CSL

由圖3可知:隨著溫度逐漸升高,水解度隨之升高,當(dāng)溫度大于50 ℃時(shí),水解度開始降低。玉米漿水解度在50 ℃時(shí)達(dá)到最高值,然后隨著溫度升高而逐漸降低,酶活力最高的溫度時(shí)水解效率最高,大于或小于這個(gè)溫度就會(huì)使酶的活性降低。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

將酸性蛋白酶添加量0.3%和植酸酶添加量0.2%于玉米漿中進(jìn)行充分混勻,于50 ℃下,對(duì)玉米漿酶解時(shí)間進(jìn)行不同改變。時(shí)間與玉米漿水解度關(guān)系如圖4所示。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)玉米漿水解度的影響Fig.4 The effect of enzymolysis time on the degree of hydrolysis of CSL

由圖4可知:隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng),水解度隨之升高,當(dāng)酶解時(shí)間超過16 h后,水解度趨于平緩。玉米漿水解度16 h前一直在增加,之后水解度增幅微乎其微,16 h后玉米漿蛋白幾乎被完全水解,因此水解度不再增加。

2.2 酶解條件正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)表1進(jìn)行玉米漿酶解條件的正交實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表2所示。

表2 酶解玉米漿正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知:根據(jù)R值,影響玉米漿水解度因素的順序?yàn)锽>A>C>D,影響最大的是植酸酶添加量,其次為酸性蛋白酶添加量,然后是酶解溫度,最小的是酶解時(shí)間;根據(jù)K值,玉米漿酶解的最佳組合為A3B1C1D2,即酸性蛋白酶添加量為0.3%,植酸酶添加量為0.15%,酶解溫度為50 ℃,酶解時(shí)間為16 h時(shí),水解度最高。

2.3 谷氨酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將最佳酶解組合的酶解玉米漿應(yīng)用于谷氨酸發(fā)酵。通過20 h短周期谷氨酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn),對(duì)比玉米漿對(duì)照組和酶解玉米漿實(shí)驗(yàn)組的發(fā)酵指標(biāo),結(jié)果如表3所示。實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)均有增長(zhǎng),其中產(chǎn)酸增長(zhǎng)0.6%,理論酸增長(zhǎng)10.09 g,轉(zhuǎn)化率增長(zhǎng)0.5%。

表3 20 h短周期發(fā)酵結(jié)果對(duì)比

通過24 h長(zhǎng)周期谷氨酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn),對(duì)比玉米漿對(duì)照組和酶解玉米漿實(shí)驗(yàn)組的發(fā)酵指標(biāo),結(jié)果如表4所示。實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)均有增長(zhǎng),其中產(chǎn)酸增長(zhǎng)0.8%,理論酸增長(zhǎng)15.79 g,轉(zhuǎn)化率增長(zhǎng)0.8%。酶解玉米漿可有效降低染菌風(fēng)險(xiǎn),酶解液中無機(jī)磷含量較高,微生物生物利用度提高,且在谷氨酸發(fā)酵中,有利于不飽和脂肪酸快速積累,從而提高產(chǎn)酸量。

表4 24 h長(zhǎng)周期發(fā)酵結(jié)果對(duì)比

由表4可知:在谷氨酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中,加入酶解玉米漿的新發(fā)酵工藝較原有發(fā)酵工藝,其發(fā)酵產(chǎn)酸和轉(zhuǎn)化率均有明顯提升。此工藝不僅可以大幅度提高玉米加工企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益,也為玉米漿原料的再利用提供了一定的理論基礎(chǔ)和參考價(jià)值[13]。

3 結(jié) 論

通過對(duì)酸性蛋白酶、植酸酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間4種因素進(jìn)行單因素及正交實(shí)驗(yàn),確定玉米漿酶解最佳條件為:酸性蛋白酶添加量為0.3%,植酸酶添加量為0.15%,水解溫度為50 ℃,水解時(shí)間為16 h。將最佳酶解組合的酶解玉米漿應(yīng)用于谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中,可完全替代酸水解蛋白液,其產(chǎn)酸指標(biāo)提高0.6%～0.8%,轉(zhuǎn)化率提高0.5%～0.8%。酶解后的玉米漿營(yíng)養(yǎng)豐富,有助于提高菌體活力,提高谷氨酸產(chǎn)量,且玉米漿價(jià)格低廉,能夠替代價(jià)格昂貴的酸水解蛋白液,同時(shí)減少酸水解蛋白液的使用,有效降低對(duì)環(huán)境的污染。