黑果腺肋花楸果中總花色苷含量測定方法的比較

趙 婧，李涵涵，千 文，樸昌善，楊長青,*

（1.中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211198；2.南京珼瑞斯生物醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 南京 211100；3.延邊日鑫生物科技有限公司，吉林 延吉 133000）

黑果腺肋花楸（Aornia melanocarpa）為薔薇科腺肋花楸屬植物。果實富含多酚、有機酸、蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)[1]，并且多酚類物質(zhì)的含量在已知漿果中居于榜首[2]?；ㄇ嗨刈鳛楹诠倮呋ㄩ惫闹饕喾宇愇镔|(zhì)，在自然狀態(tài)下通常以不穩(wěn)定的花青素結(jié)構(gòu)單元和糖類結(jié)合形成穩(wěn)定的糖配體，即花色苷形式存在[3]。花色苷具有抗炎、抗氧化、改善視力、消除自由基、預(yù)防心腦血管疾病等多種生物活性[4-5]，因此黑果腺肋花楸果具有藥用開發(fā)潛力。

目前，花色苷含量的測定方法主要有pH示差法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[1]。其中，pH示差法主要采用花色苷在不同pH值的分子結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而改變顏色以定量測定[6]，其測定結(jié)果通常受外界條件及輔色素轉(zhuǎn)化等因素影響[7]，若測定以黑果腺肋花楸果中含量最低[1,8]的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)[9-10]進(jìn)行計算可能引起誤差[7,11]。自然界中花色苷形式眾多，標(biāo)準(zhǔn)品昂貴且不易獲取，因此HPLC法大多采用1～2 種對照品為標(biāo)準(zhǔn)，通過相對分子質(zhì)量校正以定量計算總花色苷含量[12-15]，或采用鹽酸水解糖苷的方法，通過測定花青素單體的含量間接表示花色苷含量[16]，但花色苷分子質(zhì)量的差異、水解后苷元穩(wěn)定性降低等問題均可能會對結(jié)果造成偏差[17-18]。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分辨率高、靈敏度高，可用于含量低、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的花色苷含量測定，也可鑒別未知結(jié)構(gòu)[1,19-20]，但此方法價格昂貴，不利于測定方法的普及。目前，國內(nèi)鮮見采用混合標(biāo)樣HPLC法和以矢車菊素-3-O-半乳糖苷摩爾吸光系數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)的pH示差法測定黑果腺肋花楸果中總花色苷含量的報道。因此，本研究運用優(yōu)化前后的pH示差法和HPLC法測定延邊地區(qū)4 個種植基地黑果腺肋花楸果實中總花色苷，通過比較不同方法測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，進(jìn)而優(yōu)選黑果腺肋花楸果實中總花色苷含量的最佳測定方法，以期為黑果腺肋花楸果花色苷質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸果實1～4號均由延邊日鑫生物科技有限公司提供，經(jīng)采摘挑選后冷凍干燥，用粉碎機粉碎，過40 目篩，于4 ℃避光密封保存。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（批號DST180622-019、含量98%） 成都德思特生物技術(shù)有限公司；矢車菊素-3-O-木糖苷（批號AR9781W1，純度98%） 寶雞辰光生物科技有限公司；矢車菊素-3-O-半乳糖苷（批號20190612，純度98%）、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷（批號20190612，純度98%） 南京珼瑞斯生物醫(yī)藥科技有限公司；乙醇（分析純） 美國Merck Drugs &Biotechnology公司；甲醇（色譜純） 美國TEDIA公司；磷酸溶液（分析純） 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；純化水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2010AHT高效液相系統(tǒng)（配備四元高壓泵、紫外檢測器） 日本Shimadzu公司；Galaksil?EF C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 無錫加萊克色譜科技有限公司；冷凍干燥機 上海比朗儀器制造有限公司；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花色苷的提取

取黑果腺肋花楸果粉（冷凍干燥品）0.2 g于具塞試管中，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液（含0.096 mol/L鹽酸），40 ℃超聲30 min，于室溫、2 500 r/min離心5 min，果渣再重復(fù)提取2 次，收集所有離心后上清液用60%乙醇溶液（含0.096 mol/L鹽酸）定容至25 mL，室溫保存。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷適量，分別用鹽酸-甲醇（2∶98，V/V）配制，得1 mg/mL對照品儲備液；取各對照品儲備液適量，用鹽酸-甲醇（2∶98，V/V）制得含有矢車菊素-3-O-半乳糖苷225 μg/mL、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷7.2 μg/mL、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷72 μg/mL、矢車菊素-3-O-木糖苷30 μg/mL的混合對照品溶液，均置于4 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 HPLC條件

色譜柱：Galaksil?EF-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）、體積分?jǐn)?shù)8.5%甲酸溶液（B），按以下條件勻速梯度洗脫：0～5 min，90%～78% A、10%～22% B；5～7.5 min，78% A、22% B；7.5～11.5 min，78%～92% A、22%～8% B；11.5～14.5 min，92%～60% A、8%～40% B；14.5～18.5 min，60% A、40% B；18.5～20 min，60%～90% A、40%～10% B；20～23 min，90% A、10% B。流速1.0 mL/min；檢測波長525 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.4 花色苷含量的計算

1.3.4.1 單標(biāo)樣HPLC法

根據(jù)SW/T 2—2013《越橘提取物國際商務(wù)標(biāo)準(zhǔn)》[21]，按式（1）計算花色苷含量：

式中：i為黑果腺肋花楸果中相應(yīng)花色苷組分（對照品色譜峰1～4）；Ci為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得花色苷組分質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為花色苷提取液定容體積/mL；m為黑果腺肋花楸果實稱樣質(zhì)量/g；F為稀釋倍數(shù)（5）；Mi為黑果腺肋花楸果中相應(yīng)花色苷組分的相對分子質(zhì)量；Mstda為對照品花色苷相對分子質(zhì)量。

1.3.4.2 pH示差法

參照孫婧超[22]和楊萍[23]等的方法并優(yōu)化。取2 份0.5 mL花色苷提取液分別加入KCl-HCl（25∶67，V/V）緩沖液（pH 1.0）、NaAc-HCl（1∶1，V/V）的緩沖液（pH 4.5）4.5 mL，避光、40 ℃恒溫水浴30 min，以提取溶劑為空白對照，在515、700 nm波長處測定溶液吸光度，按式（4）、（5）分別以矢車菊素-3-O-半乳糖苷摩爾吸光系數(shù)、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷摩爾吸光系數(shù)計算黑果腺肋花楸果中總花色苷的含量。

式中：ε為對照品摩爾吸光系數(shù)/（L/（mol·cm）），其中ε矢車菊素-3-O-半乳糖苷、ε矢車菊素-3-O-葡萄糖苷分別為23 505、26 900 L/（mol·cm）[9]；M為對照品相對分子質(zhì)量；V為最后定容的體積/mL；F為稀釋倍數(shù)（10）；m為黑果腺肋花楸果實稱樣量/g；L為比色皿的寬度（1 cm）；A515nm、A700nm分別為提取液在515、700 nm波長下的吸光度；ΔA1.0、ΔA4.5為pH 1.0、4.5條件下提取液的不同波長吸光度差值；ΔA為ΔA1.0、ΔA4.5差值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC法

2.1.1 線性范圍

2.1.1.1 單標(biāo)樣HPLC法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

取1.3.2節(jié)質(zhì)量濃度均1 mg/mL矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品儲備液，分別逐級稀釋得質(zhì)量濃度0.5、1.0、5.0、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL的系列對照品溶液，再經(jīng)1.463 mol/L磷酸溶液稀釋5 倍后制得0.1、0.2、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL對照品溶液，進(jìn)樣檢測[17]，HPLC分析結(jié)果如圖1所示。

圖1 花色苷HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of anthocyanin standards

2.1.1.2 混合標(biāo)樣HPLC法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

取1.3.2節(jié)的混合對照品儲備液，逐級稀釋分別制得矢車菊素-3-O-半乳糖苷質(zhì)量濃度24.0、48.0、96.0、120.0、150.0、180.0、225.0 μg/mL；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷質(zhì)量濃度0.8、1.5、3.1、3.8、4.8、5.8、7.2 μg/mL；矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷質(zhì)量濃度7.9、15.4、30.7、38.4、48.0、57.6、72.0 μg/mL；矢車菊素-3-O-木糖苷質(zhì)量濃度3.2、6.4、12.8、16.0、20.0、24.0、30.0 μg/mL的系列對照品混合溶液，再經(jīng)1.463 mol/L磷酸溶液稀釋5 倍后分別制得矢車菊素-3-O-半乳糖苷質(zhì)量濃度4.8、9.6、19.2、24、30、36.4、45 μg/mL；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷質(zhì)量濃度0.2、0.3、0.6、0.8、1.0、1.1、1.4 μg/mL；矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷質(zhì)量濃度1.5、3.1、6.1、7.7、9.6、11.5、14.4 μg/mL；矢車菊素-3-O-木糖苷質(zhì)量濃度0.6、1.3、2.6、3.2、4.0、4.8、6.0 μg/mL的對照品混合溶液，進(jìn)樣檢測[17]，HPLC結(jié)果如圖1C所示?；ㄉ杖芤簶?biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見表1。

表1 花色苷的線性回歸方程Table 1 inear regression equations for anthocyanins

2.1.2 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率

取混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各對照品色譜峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。樣品中矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷峰面積的RSD（n=6）分別為0.06%、0.66%、0.18%、0.32%。表明方法的精密度良好。

取黑果腺肋花楸果粉4號樣品，按1.3.1節(jié)的方法制備供試液1 份，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計算RSD。樣品中矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷峰面積的RSD（n=8）分別為0.44%、0.69%、1.31%、2.69%。表明花色苷提取液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

取黑果腺肋花楸果粉4號樣品，按1.3.1節(jié)的方法制備供試液6 份，進(jìn)樣后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各成分含量。樣品中矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷含量分別為（15.985±0.113）、（0.219±0.003）、（5.491±0.034）、（1.467±0.013）mg/g，RSD（n=6）分別為0.71%、1.28%、0.62%、0.91%，表明方法的重復(fù)性良好。

取黑果腺肋花楸果粉4號樣品0.1 g，共6 份，分別精密加入對照品溶液，按1.3.1節(jié)的方法制備供試溶液，進(jìn)樣分析，計算加樣回收率。樣品中矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷回收率分別為95.03%、99.17%、95.93%、99.10%，RSD（n=6）分別為3.14%、2.54%、3.54%、3.83%，表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.1.3 樣品測定

取黑果腺肋花楸果粉樣品1～4號，一式三份，按1.3.1節(jié)的方法制備花色苷提取液，再經(jīng)1.463 mol/L磷酸溶液配制，將其稀釋5 倍后進(jìn)樣檢測[17]，帶入單標(biāo)和混標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計算各組分花色苷單體含量及花色苷的總含量?；ㄉ湛偭繑?shù)據(jù)之間采用單因素方差分析顯著差異。結(jié)果如表2所示。

表2 HPLC法測定黑果腺肋花楸果中花色苷的含量（n=3）Table 2 Anthocyanin contents in black chokeberry determined by HPLC with different reference standards (n = 3)

以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為標(biāo)樣計算的花色苷總量均與其他2 種方法的結(jié)果比較具有顯著差異（P＜0.05），其原因可能與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷在黑果腺肋花楸果中花色苷含量占比最低有關(guān)。黑果腺肋花楸果中矢車菊素-3-O-半乳糖苷約占總花色苷的65.6%，而矢車菊素-3-O-葡萄糖苷僅占2.5%[24]，因此用非主要花色苷單體作為標(biāo)樣計算黑果腺肋花楸果中花色苷含量明顯偏離真實結(jié)果。以矢車菊素-3-O-半乳糖苷為標(biāo)樣計算的花色苷總量與混合標(biāo)樣結(jié)果無顯著差異（P＞0.05），因此采用混合標(biāo)樣HPLC法計算結(jié)果最準(zhǔn)確，但以矢車菊素-3-O-半乳糖苷為單標(biāo)樣的HPLC法結(jié)果可靠，且方法經(jīng)濟(jì)、簡便，同樣適用于黑果腺肋花楸果中花色苷的含量測定。

2.2 pH示差法

2.2.1 摩爾吸光系數(shù)

配制質(zhì)量濃度分別為0.020、0.025、0.050、0.075、0.100、0.150、0.20 mg/mL的矢車菊素-3-O-半乳糖苷系列對照品溶液，按1.3.4.2節(jié)的方法得到對照品溶液吸光度，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明：矢車菊素-3-O-半乳糖苷在0.02～0.20 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，得線性回歸方程Y=48.481X+0.011 1（r=0.999 9），經(jīng)計算矢車菊素-3-O-半乳糖苷在515 nm波長處、60%乙醇（含0.096 mol/L鹽酸）溶液中摩爾吸光系數(shù)為23 505 L/（mol·cm）。采用位路路等[9]矢車菊素-3-O-葡萄糖苷吸光系數(shù)26 900 L/（mol·cm）。

2.2.2 樣品測定

取黑果腺肋花楸果樣品1～4號，一式三份，按1.3.1、1.3.4.2節(jié)的方法分別制備供試溶液、計算花色苷總含量。各組數(shù)據(jù)之間采用t檢驗比較顯著性差異，結(jié)果見圖2。以矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷共2 種花色苷各自摩爾吸光系數(shù)計算的結(jié)果之間存在顯著差異（P＜0.05）。樣品1～4號中花色苷含量以矢車菊素-3-O-半乳糖苷摩爾吸光系數(shù)計算結(jié)果分別為（26.67±0.50）、（25.61±0.38）、（25.61±0.29）、（22.68±0.38）mg/g；以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷摩爾吸光系數(shù)計算結(jié)果分別為（23.30±0.44）、（22.38±0.33）、（22.38±0.25）、（19.82±0.33）mg/g。不同溶劑、波長檢測物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)存在差異[22]，因此計算過程需要考慮實際的檢測波長及溶劑情況。黑果腺肋花楸果中花色苷主要以矢車菊素-3-O-半乳糖苷為主，因此以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷摩爾吸光系數(shù)計算的結(jié)果必然會有誤差[25]。結(jié)合以矢車菊素-3-O-半乳糖苷為標(biāo)準(zhǔn)的單標(biāo)樣HPLC法測定結(jié)果可知，使用pH示差法時以矢車菊素-3-O-半乳糖苷摩爾吸光系數(shù)計算的結(jié)果更加準(zhǔn)確。

圖2 基于pH示差法以矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾吸光系數(shù)計算黑果腺肋花楸果中花色苷的含量（n=3）Fig.2 Anthocyanin contents in black chokeberry determined by pH differential method based on the molar extinction coefficients of cyanidin 3-O-galactopyranoside and cyanidin 3-O-glucoside (n = 3)

2.3 混合標(biāo)樣HPLC法和pH示差法的比較

黑果腺肋花楸果樣品經(jīng)過2.1、2.2節(jié)方法計算后，采用t檢驗比較混合標(biāo)樣HPLC法測定結(jié)果和pH示差法測定結(jié)果間顯著差異的結(jié)果如圖3所示。1、3號樣品pH示差法測定結(jié)果與HPLC法測定結(jié)果之間存在顯著差異（P＜0.05），2、4號樣品的2 種方法結(jié)果間無顯著差異（P＞0.05）。周丹蓉等[26]報道果實中花色苷含量越高，pH示差法與HPLC法所測花色苷的結(jié)果差異越大，而本實驗1號和3號花色苷總含量經(jīng)HPLC法測定均高于2號和4號，因此與周丹蓉等[26]的結(jié)論相符。另外4 個樣品HPLC法測定的花色苷總量均高于pH示差法，這也劉玉芹[27]和Wu Xianli[28]等報道的結(jié)論一致。導(dǎo)致以上結(jié)果的可能原因為花色苷通常與輔色素結(jié)合，以共呈色的形式存在[29]，因此花色苷含量越高，這種作用越強。這種現(xiàn)象往往會導(dǎo)致偏離朗格比爾定律[30]的現(xiàn)象出現(xiàn)，從而影響pH示差法對花色苷的含量測定。其次，pH示差法僅針對游離狀態(tài)的花色苷分子，而聚合形式的花色苷在pH值分別為1.0、4.5時均有吸收[31]，因此在pH值為1.0時，輔色素不完全轉(zhuǎn)化導(dǎo)致游離態(tài)花色苷分子較少[32]，可能為pH示差法結(jié)果偏低的另一個原因。此外，pH示差法還比較容易受儀器、溫度、溶液pH值及操作的影響[17]。因此混合標(biāo)樣HPLC法測定結(jié)果比pH示差法更加準(zhǔn)確。

圖3 pH示差法和HPLC法對花色苷總含量測定的比較（n=3）Fig.3 Comparison of total anthocyanin contents in black chokeberry determined by optimized pH differential method and HPLC (n = 3)

3 結(jié) 論

本實驗對黑果腺肋花楸果中總花色苷含量測定方法進(jìn)行優(yōu)化和比較，結(jié)果表明：混合標(biāo)樣HPLC法為黑果腺肋花楸果果實總花色苷含量測定的最準(zhǔn)確的方法，但成本較高；以矢車菊素-3-O-半乳糖苷作單標(biāo)樣的HPLC法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)成本適宜，同樣適用于黑果腺肋花楸果實總花色苷的測定。本研究為黑果腺肋花楸果實及其相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及開發(fā)提供理論依據(jù)。