山 珊，黃艷梅，趙雪龍，陳文瑤，劉成偉，龍中兒，劉道峰,*

（1.江西師范大學生命科學學院，南昌市鄱陽湖濕地微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，江西 南昌 330022；2.江西業(yè)力醫(yī)療器械有限公司，江西 南昌 330008；3.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；4.江西省疾病預防控制中心，江西省食源性疾病診斷溯源重點實驗室，江西 南昌 330029）

統(tǒng)計結(jié)果顯示全球每年約有6億 人因食用受污染的食品而患病，近42萬 人死亡，而食源性致病菌是造成食源性疾病的主要因素之一[1-2]。傳統(tǒng)的微生物檢測方法以培養(yǎng)法為基礎，此類方法依賴于微生物的生長[3-5]，操作過程費時耗力，難以滿足現(xiàn)場快速檢測的需要。為提高致病菌檢測方法的靈敏度并節(jié)省檢測時間，不依賴于微生物生長的檢測方法成為近年來食源性致病菌檢測研究領域的關注熱點[6-8]，主要包括基于分子生物學和基于免疫學的檢測方法。基于分子生物學的檢測方法[9-11]雖具有準確性高和檢測速度快的特點，但因其需要昂貴的儀器及專業(yè)的場所，故難以應用于基層。免疫學檢測技術[12-15]是基于抗原和抗體特異性結(jié)合實現(xiàn)對目標物直接識別的一種快速檢測方法，具有檢測效率高、不需要專業(yè)場所和大型儀器等特點。其中免疫層析法因人員技術要求低和檢測速度快而得到廣泛的應用[16-19]。

然而傳統(tǒng)的免疫層析方法靈敏度較低，通常難以滿足食源性致病菌超靈敏檢測的需求，同時免疫層析方法在檢測致病菌常依賴“夾心免疫層析模式”，該檢測模式因存在Hook效應而易引起假陰性檢測結(jié)果[20]。近年來提高免疫層析法檢測靈敏度的手段包括：1）使用新型標記物，如熒光標記物[21-22]、磁性標記材料[23]和強拉曼響應標記物[24-25]等；2）使用信號放大策略，如應用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)[26]、酶-底物反應系統(tǒng)[27]和金屬增強方法[28-29]等，Cho等[27]采用生物素-鏈霉親和素體系將酶標記在膠體金上，增加了酶的載量，通過酶-底物的顏色反應，增強了檢測線的信號強度，與傳統(tǒng)的免疫層析方法相比檢測靈敏度提高了100 倍。上述方法在一定程度上提高了致病菌的檢測靈敏度，但“夾心免疫層析模式”存在Hook效應這一共性問題并未得到解決，食源性致病菌的檢測靈敏度仍有待提高。

本研究首先采用免疫磁技術濃縮大腸埃希氏菌O157:H7，而后制備同時標記了抗體和大量β-內(nèi)酰胺酶的膠體金納米探針，利用膠體金納米探針上大量β-內(nèi)酰胺酶高效水解青霉素的特點實現(xiàn)檢測信號轉(zhuǎn)導與進一步放大，再結(jié)合競爭型免疫層析法靈敏監(jiān)測青霉素的含量變化，最終實現(xiàn)大腸埃希氏菌O157:H7的超靈敏檢測。研究巧妙地將檢測大分子目標菌轉(zhuǎn)移成檢測小分子目標物，實現(xiàn)超靈敏檢測食源性致病菌的同時規(guī)避了雙抗夾心免疫層析法中Hook效應的影響，旨在為免疫層析技術高靈敏準確檢測大分子目標物提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

大腸埃希氏菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7，ATCC 43888）、普通大腸埃希氏菌ATCC 25922、豬霍亂沙門氏菌（Salmonella choleraesuis，ATCC 10708）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC 26003）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris，CMCC 49027）、宋內(nèi)氏志賀菌（Shigella sonnei，ATCC 25931）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，ATCC 14579）、單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，ATCC 13932）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，CMCC 10104）、食品基質(zhì)中大腸埃希氏菌O157:H7為江西省疾病預防控制中心保存菌株。

1.1.2 試劑

奧潤磁珠（PM3-020） 上海奧潤微納新材料科技有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、N-羥基硫代琥珀酰亞胺（N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt，NHSS）、嗎啉乙磺酸（morpholinoethanesulfonic acid，MES）、硼酸鈉溶液（sodium borate solution，BS）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-20000 阿拉丁化學試劑公司；吐溫20、氯化鉀（分析純）、氯化鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）、氫氧化鈉、鹽酸 天津永大化學試劑有限公司；D-氨基葡萄糖、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國Sigma公司；抗大腸埃希氏菌O157:H7多克隆抗體（E-pAb）、抗大腸埃希氏菌O157:H7單克隆抗體（E-mAb） 美國Meridian Life Science公司；LB液體培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基 英國Oxoid公司；山梨醇麥康凱瓊脂（sorbitol maconkey agar base，SMAC）平板北京陸橋技術有限責任公司；改良EC肉湯（mEC+n）培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；科瑪嘉O157顯色培養(yǎng)基 鄭州博賽生物技術股份有限公司；青霉素標準品 上海源葉生物技術有限公司；β-內(nèi)酰胺酶 上海晶純生化科技股份有限公司；青霉素檢測卡 北京輝奧生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Synergy超純水系統(tǒng) 德國Merker Millipore公司；BE-1200渦旋振蕩器 上海醫(yī)科大學儀器廠；微量移液器德國Eppendorf公司；ME204電子分析天平 美國梅特勒-托利多公司；LZDM高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；78HW1加熱磁力攪拌器 江蘇金城國盛實驗儀器廠；HZ100R冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；DH-II旋轉(zhuǎn)混合儀 浙江寧波新芝公司；磁分離架 江西中德生物工程有限公司；JP-C300超聲波清洗儀 廣州市吉普超聲波電子設備公司；HT-1300-U生物安全柜 蘇州蘇凈安泰；ZWY-2102C恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；DK-320恒溫水浴箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)

從大腸埃希氏菌生長的SMAC平板上取單菌落，在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h；副溶血性弧菌在加入了3%氯化鈉的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，培養(yǎng)溫度為37 ℃；其他細菌在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)18 h。單核細胞增生李斯特菌在腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)完成的細菌均采用平板計數(shù)法，同一濃度設置3 個平行實驗。

1.3.2 免疫磁珠的制備

使用1 mL含1%吐溫20的嗎啉乙磺酸緩沖液（morpholinoethanesulfonic acid with 1% tween 20，MEST，pH 5.5）對5 mg澳潤磁珠進行洗滌后，磁分離棄上清液。取10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHSS溶液（MES緩沖液配制，pH 5.5）各0.5 mL加入到清洗后的磁珠中，置于旋轉(zhuǎn)混合儀15 r/min、室溫條件下活化1 h，磁分離后棄上清液。將1 mL的MES緩沖液重懸活化后的磁珠，磁分離后棄上清液。加入1 mL 1 mg/mL的E-mAb，置于旋轉(zhuǎn)混合儀15 r/min、室溫條件下反應4 h，進行磁分離棄上清液。最后加入1 mL用BS緩沖液配制的1 mg/mL氨基葡萄糖溶液，置于旋轉(zhuǎn)混合儀15 r/min、室溫條件下反應1 h，磁分離棄上清液，用BST溶液（含0.5% BSA和0.02%疊氮鈉）清洗3 次。最后用1 mL的BST溶液重懸磁珠，將其放置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 膠體金納米探針的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液。取99 mL超純水于干凈的250 mL錐形瓶內(nèi)，置于加熱磁力攪拌器快速攪拌溶液，加入1 mL 0.1% HAuCl4溶液，待溶液沸騰后迅速地加入1.5 mL 1%的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱攪拌，當溶液變?yōu)榧t色透明時，繼續(xù)加熱10 min后停止加熱，攪拌5 min后待溶液平衡至室溫，放入4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將1 mL膠體金溶液加入一個干凈的5 mL燒杯中，用0.2 mol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)溶液pH 8，置于磁力攪拌器，滴加E-pAb（5、10、15、20 μg和25 μg），常溫下攪拌1 h。加入50 μgβ-內(nèi)酰胺酶，繼續(xù)攪拌反應1 h。最后向溶液中加入100 μL 1%的PEG-20000溶液，攪拌30 min后加入100 μL 1% BSA溶液繼續(xù)攪拌反應30 min，4 ℃、8 000 r/min離心30 min。用100 μL超純水復溶膠體金復合物，存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 免疫磁珠和膠體金納米探針捕獲目標菌

將大腸埃希氏菌O157:H7菌液用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.4）梯度稀釋，平板計數(shù)。取100 μg免疫磁珠（1.3.2節(jié)），PBS清洗2 次，磁分離棄上清液，加入900 μL PBS復溶和100 μL 105CFU/mL大腸埃希氏菌O157:H7菌液，同時用PBS作空白對照組，將其置于旋轉(zhuǎn)混合儀15 r/min、常溫反應30 min，磁分離3 min棄上清液；用1 mL含1%吐溫20磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline with 1% tween 20，PBST）清洗2 次，加入1 mL PBS復溶，加入一定量（0、1、3、5 μL和10 μL）的膠體金納米探針（1.3.3節(jié)），置于旋轉(zhuǎn)混合儀（15 r/min）于常溫反應10 min；磁分離3 min，取出上清液進行平板計數(shù)，PBS清洗復合物（免疫磁珠-目標菌-膠體金納米探針），最后1 mL PBS復溶。

將上清液、洗滌液和對照組進行平板計數(shù)，同時進行3 個平行實驗。在37 ℃條件下，培養(yǎng)12～16 h，進行計數(shù)，磁珠的捕獲效率按照下式計算：

1.3.5 基于級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導結(jié)合免疫層析方法快速檢測大腸埃希氏菌O157:H7

檢測原理見圖1。當大腸埃希氏菌O157:H7存在時，偶聯(lián)了E-mAb的免疫磁珠與大腸埃希氏菌O157:H7結(jié)合，隨后加入標記了E-pAb和β-內(nèi)酰胺酶的膠體金納米探針，此時免疫磁珠、大腸埃希氏菌O157:H7和膠體金納米探針形成夾心復合物。將一定量的青霉素溶液與復合物混合，復合物上的β-內(nèi)酰胺酶可高效水解青霉素，磁富集后得到的上清液采用商業(yè)化的免疫層析試紙條確認青霉素含量。免疫層析方法檢測青霉素原理是：青霉素全抗原噴于檢測線（T），抗鼠二抗噴于控制線（C），標記了抗青霉素單克隆抗體的膠體金（指示物）噴在結(jié)合墊上，當溶液中存在一定量的青霉素時，青霉素與結(jié)合墊上指示物結(jié)合，指示物無法再與檢測線上青霉素全抗原結(jié)合，試紙條檢測線不顯色；當溶液中不存在青霉素時，結(jié)合墊上的指示物與檢測線上青霉素全抗原結(jié)合，試紙條檢測線顯色。若待測樣品中存在目標菌，青霉素被水解，檢測線顯色。若待測樣品中不存在目標菌，則無法形成復合物，體系中不存在β-內(nèi)酰胺酶，青霉素無法被水解，試紙條上檢測線不顯色。

圖1 級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)結(jié)合免疫層析法檢測大腸埃希氏菌O157:H7的原理圖Fig.1 Schematic diagram of the detection of E.coli O157:H7 by cascade signal transduction combined with immunochromatography

檢測具體步驟如下：將大腸埃希氏菌O157:H7與清洗后的100 μg免疫磁珠（1.3.2節(jié)）混合，PBS作空白對照組。將其置于旋轉(zhuǎn)混合儀15 r/min、常溫反應30 min，磁分離3 min棄上清液；PBST清洗2 次，加入1 mL PBS復溶，加入膠體金納米探針（1.3.3節(jié)），置于旋轉(zhuǎn)混合儀15 r/min、常溫反應10 min；磁分離3 min，PBS清洗復合物5 次，磁分離棄上清液；加入100 μL 50 μg/mL青霉素溶液，37 ℃放置30 min；磁分離取上清液，用青霉素檢測卡檢測上清液中青霉素的質(zhì)量濃度。同時用ImageJ軟件，掃描實驗結(jié)果圖。

1.3.6 方法特異性的評價

選取普通大腸埃希氏菌、豬霍亂沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、宋內(nèi)氏志賀菌、蠟樣芽孢桿菌、單核細胞增生李斯特菌和銅綠假單胞菌作為待檢目標物，進行特異性實驗，評價該檢測方法的特異性。

1.3.7 級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)結(jié)合免疫層析檢測牛奶中的大腸埃希氏菌O157:H7

將對數(shù)期生長的大腸埃希氏菌O157:H7用無菌PBS稀釋到101CFU/mL（用平板記數(shù)法計算菌濃度），取250 μL菌液接種于25 g牛奶中，將人工污染的牛奶置于225 mL無菌改良EC肉湯培養(yǎng)基中，放置于180 r/min搖床中，37 ℃條件下培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)時間為0、4、5、6、7 h的增菌肉湯，用本研究所建方法進行檢測。同時使用科瑪嘉O157顯色培養(yǎng)基鑒定檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫磁珠捕獲效率的評價

免疫磁珠捕獲效率越高，所形成復合物中β-內(nèi)酰胺酶越多，更有利于青霉素水解，進而提高檢測靈敏度。制備具有高效捕獲效率的免疫磁珠是提高檢測靈敏度的關鍵。使用本研究制備的免疫磁珠捕獲不同濃度的大腸埃希氏菌O157:H7，表1結(jié)果顯示，當菌濃度為2×102～2×107CFU/mL時，捕獲效率可以達到約94.17%以上，免疫磁珠對不同濃度的大腸埃希氏菌O157:H7均具有較高的捕獲效率。

表1 免疫磁珠對不同濃度大腸埃希氏菌O157:H7的捕獲效率Table 1 Capture efficiency of immunomagnetic beads for E.coli O157:H7 at different concentrations

2.2 膠體金納米探針上E-mAb標記量對檢測靈敏度的影響

膠體金納米探針需滿足2 個條件：1）需標記足夠多的E-mAb，保證膠體金納米探針具有高效捕獲目標菌的效率；2）膠體金納米探針需偶聯(lián)大量的β-內(nèi)酰胺酶，可高效地水解青霉素，使檢測信號被成功地轉(zhuǎn)導并被有效地放大。在弱堿環(huán)境下，帶負電荷的膠體金可與E-mAb以及β-內(nèi)酰胺酶的正電荷基團通過靜電吸附作用形成牢固的結(jié)合。然而膠體金的蛋白承載量有限，若標記抗體量過多，則會導致膠體金的表面被大量抗體占據(jù)，而沒有足夠空間結(jié)合大量β-內(nèi)酰胺酶；若抗體標記量過低，直接導致膠體金探針捕獲目標菌效率降低，最終影響檢測靈敏度。本研究通過調(diào)節(jié)膠體金納米探針上E-mAb標記量，探究E-mAb和β-內(nèi)酰胺酶標記量對檢測靈敏度的影響機制。如圖2所示，當E-mAb標記量為5～10 μg時，檢測線顏色強度隨E-mAb標記量的增加而增強，原因可能是隨著E-mAb標記量增加，膠體金納米探針的捕獲效率得到提升，使檢測信號增強。進一步增加E-mAb標記量，檢測線顯色強度開始減弱，原因可能是過量的E-mAb占據(jù)了膠體金表面其余的結(jié)合位點，導致膠體金上β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)合率下降，青霉素水解效率降低，檢測靈敏度明顯下降。當E-mAb標記量為10 μg時，試紙條上檢測線顯色最深，ImageJ軟件掃描檢測結(jié)果圖顯示此時檢測線的灰度面積值最高（圖2C），此時與膠體金結(jié)合的E-mAb和β-內(nèi)酰胺酶的比例最優(yōu)。

圖2 膠體金納米探針上E-mAb標記量對檢測靈敏度的影響Fig.2 Effect of amount of E-mAb conjugated to AuNPs on detection sensitivity

2.3 膠體金納米探針添加量對檢測信號強度和準確度的影響

膠體金納米探針添加量越大，目標菌捕獲效率和β-內(nèi)酰胺酶含量則越高，有利于提高檢測方法靈敏度。研究在陽性樣本和陰性樣本中評價了不同膠體金納米探針添加量對檢測信號強度和準確度的影響。由圖3A可見，隨著膠體金納米探針添加量的增加，檢測線顯色強度逐漸加深，當膠體金納米探針的加入量為5 μL時，檢測線信號值明顯增加，進一步增加膠體金納米探針添加量，檢測線的信號強度并沒有明顯增加。陰性對照結(jié)果顯示（圖3B），當膠體金納米探針添加量為10 μL時，陰性樣本檢測線出現(xiàn)淺紅色條帶（圖3B1），原因可能是過量的膠體金納米探針與免疫磁珠形成非特異性吸附。因此，膠體金納米探針的最優(yōu)添加量為5 μL。

圖3 膠體金探針添加量對檢測靈敏度的影響Fig.3 Effect of amount of colloidal gold probe on detection sensitivity

2.4 級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)結(jié)合免疫層析法檢測大腸埃希氏菌O157:H7的靈敏度

利用本研究建立的方法對濃度為2×102～2×107CFU/mL的大腸埃希氏菌O157:H7進行檢測。圖4結(jié)果顯示，陰性對照組（PBS）檢測線并無檢測信號產(chǎn)生，當大腸埃希氏菌O157:H7濃度為2×102CFU/mL時，檢測線的灰度面積值顯著增加。與相同抗體建立的傳統(tǒng)膠體金試紙條檢測方法相比，本研究建立的檢測方法靈敏度是傳統(tǒng)膠體金試紙條檢測方法檢測靈敏度的570 倍[30]（傳統(tǒng)方法檢測大腸埃希氏菌O157:H7的檢測靈敏度為1.14×105CFU/mL）。

圖4 級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導體系結(jié)合免疫層析法檢測大腸埃希氏菌O157:H7靈敏度Fig.4 Sensitivity of cascade signal transduction combined with immunochromatography for the detection of E.coli O157:H7

2.5 級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)結(jié)合免疫層析檢測大腸埃希氏菌O157:H7的特異性

利用本研究建立的方法對8 株常見的食源性致病菌進行檢測，同時大腸埃希氏菌O157:H7作為陽性對照，評價方法的特異性。如圖5所示，除大腸埃希氏菌O157:H7的檢測結(jié)果是陽性之外，其他8 種常見食源性致病菌的檢測線均無檢測信號出現(xiàn)，沒有交叉反應產(chǎn)生。結(jié)果顯示所建立的檢測方法具有良好的特異性。

圖5 級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)結(jié)合免疫層析法檢測大腸埃希氏菌O157:H7的特異性Fig.5 Specificity of cascade signal transduction combined with immunochromatography for the detection of E.coli O157:H7

2.6 級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)結(jié)合免疫層析檢測牛奶中的大腸埃希氏菌O157:H7

將大腸埃希氏菌O157:H7接種到牛奶中，使其終濃度為2 CFU/g。比較新鮮牛奶接種了大腸埃希氏菌O157:H7后，經(jīng)過不同時間的增菌培養(yǎng)，用級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)結(jié)合免疫層析法對牛奶樣品進行檢測，由圖6可知，增菌培養(yǎng)到4 h即可檢測到陽性信號。

圖6 級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)結(jié)合免疫層析法檢測牛奶中大腸埃希氏菌O157:H7Fig.6 Detection of E.coli O157:H7 in milk by cascade signal transduction system combined with immunochromatography

3 結(jié) 論

本研究通過構(gòu)建級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導體系，將檢測信號有效轉(zhuǎn)導并層層放大，實現(xiàn)了大腸埃希氏菌O157:H7的快速超靈敏檢測。方法對大腸埃希氏菌O157:H7的檢測靈敏度為2×102CFU/mL，相比傳統(tǒng)的免疫層析法檢測靈敏度提高了570 倍。本研究巧妙地將檢測大分子目標菌轉(zhuǎn)移成檢測小分子目標物，實現(xiàn)超靈敏檢測食源性致病菌的同時規(guī)避了雙抗夾心免疫層析法中Hook效應存在的影響，為免疫層析法高靈敏準確檢測大分子目標物提供了新的思路。