QuEChERS-UPLC-MS/MS測定果蔬中18 種琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑

龔 蕾，黃 徽，韓 智，江 豐，彭青枝*，黃宗騫，王 亨

（湖北省食品質量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心，湖北 武漢 430070）

琥珀酸脫氫酶抑制劑（succinate dehydrogenase inhibitors，SDHIs）是一類通過抑制病原菌琥珀酸脫氫酶活性，從而干擾其呼吸作用的新型殺菌劑[1]，是近年發(fā)展很快且應用前景最廣的一類新型農藥[2]，包括麥銹靈、氟酰胺、滅銹胺、甲呋酰胺、萎銹靈、氧化萎銹靈、啶酰菌胺、噻呋酰胺、呋吡菌胺、吡噻菌胺以及近2 a新研發(fā)的氟吡菌酰胺、聯(lián)苯吡菌胺、吡唑萘菌胺、氟唑環(huán)菌胺和氟唑菌苯胺等[3]。目前，該類殺菌劑主要應用于蔬菜、水果、糧食等經(jīng)濟作物的殺菌和防霉[4]。雖然該類殺菌劑毒性較低，但因其使用日益廣泛，SDHIs殺菌劑及代謝物殘留對農產(chǎn)品質量安全造成嚴重影響。美國、日本和韓國規(guī)定小麥中萎銹靈的最大殘留限量（maximum residue limit，MRL）值均為0.2 mg/kg，中國、國際食品法典委員會（codex alimentarius commission，CAC）和歐盟等均未制定萎銹靈在小麥中的MRL標準[5]。吡噻菌胺、氟唑菌酰胺、氟吡菌酰胺、啶酰菌胺和吡唑萘菌胺的MRLs已經(jīng)確定，蘋果MRL為10 mg/kg，草莓為10 mg/kg，番茄為3 mg/kg，菠菜為60 mg/kg[6-8]。歐盟規(guī)定啶酰菌胺、吡噻菌胺、吡唑萘菌胺、氟唑菌酰胺在西紅柿中的限量為3 mg/kg[9]，我國規(guī)定啶酰菌胺在草莓和蘋果中的限量分別為3 mg/kg和2 mg/kg，新版GB 2763—2019《食品中農藥最大殘留限量》增加了吡唑萘菌胺、吡噻菌胺、氟唑環(huán)菌胺、氟唑菌酰胺和苯并烯氟菌唑在大麥、小麥、黃瓜、香蕉、結球甘藍、畜禽肉等食品中的臨時限量[10]，其他SDHIs殺菌劑還沒有相應的MRL值。有關此類農藥檢測的標準方法較少，僅見GB 23200.8—2016《水果和蔬菜中500 種農藥及相關化學品殘留量的測定 氣相色譜-質譜法》[11]和GB/T 20769—2006《水果和蔬菜中405 種農藥及相關化學品殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法》[12]中涉及了麥銹靈、氟酰胺、滅銹胺等幾種，其他SDHIs殺菌劑也沒有相應的國標檢驗方法。因此有必要開展快速分析SDHIs殺菌劑方法的研究，為該類殺菌劑的使用、監(jiān)管提供技術依據(jù)。

目前，國內外報道的關于食品中部分SDHIs類殺菌劑的分析方法主要有免疫分析法[13-15]、氣相色譜（gas chromatography，GC）法[16-17]、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[18-20]、液相色譜（liquid chromatography，LC）法[21]和液相色譜-串聯(lián)質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[22-26]。LC-MS/MS法分離能力強，可同時定性定量測定多組分，研究者采用較多。Abad-Fuentes等[27]建立了LC-MS/MS法測定果蔬中吡唑萘菌胺等7 種SDHIs殺菌劑；孫亞米等[28]采用LC-MS/MS法快速測定果蔬中啶酰菌胺、呋吡菌胺、噻唑菌胺、氟吡菌酰胺、聯(lián)苯吡菌胺和吡噻菌胺等16 種新型酰胺類殺菌劑；楊歡等[29]利用LC-MS/MS法測定果蔬中8 種新型SDHIs殺菌劑；Han Lijun等[30]采用了GC-MS/MS和UHPLC-MS/MS分別測定鯰魚肌肉組織中219 種和128 種農藥，涵蓋部分SDHIs殺菌劑；還有研究者[31-32]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法檢測柑橘、土豆、大豆及水果加工產(chǎn)品等不同基質中上百種農藥或其代謝物的殘留，包括啶酰菌胺、氧化萎銹靈、滅銹胺、吡噻菌胺等，而有關異丙噻菌胺、氟唑菌酰胺、苯并烯氟菌唑等新一代SDHIs殺菌劑在果蔬中殘留的檢測方法至今鮮見報道。

考慮到不同SDHIs殺菌劑限量范圍較寬以及樣品基質的復雜性，為滿足樣品實際測定需要，本研究采用經(jīng)濟、簡便、易操作的QuEChERS（quick, easy, cheap,effective, rugged and safe）前處理方法與UPLC-MS/MS技術結合，建立了能同時分析果蔬中18 種SDHIs殺菌劑的UPLCMS/MS方法。本方法快速、操作簡便、分析時間短、靈敏度高，可滿足果蔬中SDHIs殺菌劑的定量檢測需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

76 份果蔬樣品購自湖北武漢中百倉儲超市、沃爾瑪超市、武商超市3 家超市。

標準品：麥銹靈、氟酰胺、滅銹胺、氟吡菌酰胺、甲呋酰胺、萎銹靈、氧化萎銹靈、聯(lián)苯吡菌胺、呋吡菌胺、吡唑萘菌胺、氟唑菌苯胺、吡噻菌胺、氟唑環(huán)菌胺、氟唑菌酰胺、苯并烯氟菌唑、異丙噻菌胺、啶酰菌胺、噻呋酰胺（均為液態(tài)標準物質，質量濃度均為100 μg/mL） 阿爾塔科技有限公司。

乙腈（色譜純） 德國Merck公司；甲酸（色譜純）美國Thermo Fisher公司；醋酸鈉、無水硫酸鎂（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）（40～60 μm）上海安譜科學儀器有限公司；超純水由Millipore系統(tǒng)制備。

1.2 儀器與設備

AB SCIEX Triple QuadTM4500液相色譜-質譜聯(lián)用儀美國AB SCIEX公司；ME204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；MS3 digital渦旋儀 德國IKA公司；Centrifuge 5810離心機 艾本德中國有限公司；0.22 μm有機相濾膜 天津津騰公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 UPLC條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進樣量2 μL；柱溫35 ℃；流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為乙腈，流速0.3 mL/min；梯度洗脫條件如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.2 質譜條件

離子源：電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）；掃描方式：正負離子模式同時掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測，ESI+電壓5 500 V，ESI-電壓-4 500 V；離子源溫度500 ℃；氣簾氣壓力35 psi；碰撞氣壓力9 psi；霧化器壓力50 psi；輔助氣壓力50 psi；入口電壓10.0 V；碰撞室出口電壓6 V。各殺菌劑的質譜條件見表2。

表2 18 種SDHIs的定性離子、定量離子、去簇電壓和碰撞能量Table 2 Qualitative ions, quantitative ions, cone voltages and collision energies for eighteen compounds

1.3.3 標準溶液配制

分別準確移取質量濃度為100 μg/mL的麥銹靈、氟酰胺、滅銹胺、氟吡菌酰胺、甲呋酰胺、萎銹靈、氧化萎銹靈、聯(lián)苯吡菌胺、呋吡菌胺、吡唑萘菌胺、氟唑菌苯胺、吡噻菌胺、氟唑環(huán)菌胺、氟唑菌酰胺、苯并烯氟菌唑、異丙噻菌胺、啶酰菌胺、噻呋酰胺標準品各1.0 mL至10 mL容量瓶，用乙腈定容到10.00 mL，18 種SDHIs的標準品母液質量濃度均為10.0 μg/mL，于-18 ℃保存。

標準品混合中間液：準確移取18 種SDHIs的標準品母液各1.0 mL于20 mL容量瓶，用乙腈定容到20.00 mL，各化合物質量濃度均為0.5 μg/mL，于4 ℃保存。

標準曲線工作液：用乙腈稀釋混合中間液，配制系列標準曲線為0.5、5、20、50、100、200 ng/mL。

1.3.4 樣品前處理

取新鮮果蔬樣品，用粉碎機粉碎混勻，于-18 ℃冷凍保存。

準確稱取10.00 g（準確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加10.0 mL乙腈，振蕩混勻2 min，再加入5 g無水硫酸鎂和1 g醋酸鈉，混勻，4 000 r/min離心5 min。取3 mL上清液于15 mL離心管中，加入100 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA，渦旋3 min后，于4 000 r/min離心3 min，過0.22 μm有機濾膜，供UPLC-MS/MS待測。

1.3.5 實際樣品檢測

采集湖北武漢中百倉儲超市、沃爾瑪超市、武商超市共3 家超市76 份蔬菜及水果，采用本研究建立的前處理方法和液相色譜-質譜法測定18 種農藥的殘留量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

本研究所有數(shù)據(jù)均在AB SCIEX公司的Analyst Software軟件下采集，采用MultiQuant3.0.2軟件進行定性定量分析，采用Origin 9.0進行圖像處理。

2 結果與分析

2.1 質譜條件與色譜條件的優(yōu)化

為獲得18 種SDHIs最佳靈敏度和分離效果，對質量濃度為0.5 mg/L的18 種SDHIs單標溶液依次采取蠕動泵注射的方式進行一級質譜掃描。結果顯示：在正離子模式下，噻呋酰胺難以形成穩(wěn)定的[M+H]+峰，其他17 種殺菌劑在正離子模式下均有較好響應；在負離子模式下，噻呋酰胺能形成穩(wěn)定的[M-H]-峰。因此本實驗采取正負離子同時掃描，噻呋酰胺為負離子掃描，其他17 種SDHIs正離子掃描。為了得到響應值高，穩(wěn)定性好的子離子，優(yōu)化了質譜和液相色譜參數(shù)，圖1為優(yōu)化后18 種殺菌劑的多反應監(jiān)測離子色譜圖。

圖1 18 種化合物定量離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms for quantitative analysis of 18 compounds

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取

QuEChERS法是經(jīng)典的果蔬農藥殘留檢測方法，包含原始QuEChERS法、AOAC的QuEChERS法和歐盟的QuEChERS法。鹽析法也是農殘檢測中常用的前處理方法[33]。本實驗選擇毛白菜為實驗對象，通過加標回收，考察QuEChERS及鹽析法對SDHIs的提取效率。5 種前處理方法分別為：1）原始QuEChERS法，10 g樣品+10 mL乙腈+4 g無水MgSO4+1 g NaCl；2）歐盟的QuEChERS法，10 g樣品+10 mL乙腈+4 g無水MgSO4+1 g NaCl+1 g檸檬酸三鈉+0.5 g檸檬酸氫二鈉；3）AOAC的QuEChERS法（未酸化），10 g樣品+10 mL乙腈+4 g無水MgSO4+1 g醋酸鈉；4）AOAC的QuEChERS法，10 g樣品+10 mL乙腈+4 g無水MgSO4+1 g醋酸鈉+0.1%乙酸；5）NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定》的提取方法，10 g樣品+10 mL乙腈+7 g NaCl。

考察不同前處理對提取效果的影響，具體操作步驟如下：取均質的10 g毛白菜樣品（每個樣品3 個平行），加入100 μL質量濃度為1 μg/mL的混合標準溶液，靜置30 min后，用以上5 種方法進行提取，渦旋3 min，取上清液，過0.22 μm濾膜檢測，通過計算18 種化合物的回收率計算提取方式。

表3顯示，采取方法3）整體提取效果較好，總體回收率好。方法1）中整體回收率較低，氧化萎銹靈回收率僅65.7%，方法5）中超過一半樣品的回收率高于100%，有明顯的基質增強效應，方法2）平均回收率不及方法3）和方法4），方法3）和方法4）的回收率差別不大，區(qū)別在于噻呋酰胺在酸化條件下回收率高于120%，綜合考慮，本實驗選擇方法3）提取，即稱取10 g樣品，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩，加入4 g無水MgSO4和1 g醋酸鈉混勻。

表3 不同提取方法的18 種化合物總體回收率Table 3 Effects of different extraction methods on recoveries of eighteen compounds

2.2.2 凈化與基質效應

QuEChERS法常用到凈化劑C18、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）和石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）。C18可用來除脂，PSA可用來消除各種果蔬的有機酸、色素及一些糖和脂肪酸，GCB可用來去除甾體、葉綠素等色素，但對含苯官能團的化合物有較強吸附作用。楊歡等[29]在研究8 種新型SDHIs殺菌劑快速測定中，對凈化試劑進行比較和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)C18的加入對氟唑環(huán)菌胺、聯(lián)苯吡菌胺等化合物有吸附作用，本實驗參考其研究結果，使用PSA粉末進行凈化。并考察不同質量PSA（0、20、40、50、80、100、200、500 mg）與200 mg無水MgSO4的凈化效果，選取基質為毛白菜、芹菜、梨、橙4 種。

分別用乙腈和空白基質溶液配制相同質量濃度的標準溶液，在相同色譜條件下測定，按照基質效應/%=B/A×100計算樣品基質溶液的基質效應，其中B為目標化合物在空白基質溶液中的響應值，A為目標化合物在乙腈中的響應值。通過基質效應強弱評價方法的凈化效果。結果表明，PSA的加入能有效達到凈化效果，并發(fā)現(xiàn)在取上清液3 mL的條件下，使用50 mg PSA即能有效降低基質增強效應，加大PSA量對凈化效果無顯著性影響，與楊歡等[29]的研究相同。

2.2.3 線性范圍、檢出限及定量限

在空白樣品中添加一系列質量濃度的目標化合物，在1.3.4節(jié)的前處理條件下進行檢測，以目標物質量濃度為橫坐標，質譜定量峰面積為縱坐標繪制標準曲線（表4），得出18 種農藥在0.5～200 ng/mL范圍內呈現(xiàn)出良好的線性關系，相關系數(shù)R均大于0.99，以信噪比RSN=3確定檢出限，以RSN=10確定定量限，18 種SDHIs檢出限為0.5～2.0 μg/kg，定量限為1.5～6.0 μg/kg，具體結果見表4。楊歡等[29]研究的8 種SDHIs殺菌劑檢出限為0.2～1.7 μg/kg，本方法檢出限與其水平相當，均滿足檢測需要。

表4 18 種SDHIs的標準曲線、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 4 Linear ranges, related coefficient, LODs and LOQs for 18 compounds

在毛白菜、芹菜、梨、橙4 種基質中分別添加標準溶液，按照1.3.4節(jié)進行樣品前處理，按高中低3 水平對空白樣品提取液進行添加，每個添加水平平行測定6 次，計算平均回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表5。各種目標化合物在4 種基質中3 個添加水平（10、50 μg/kg和150 μg/kg）下的回收率為83.6%～109.4%，RSD為1.2%～8.4%。孫亞米等[28]利用LC-MS/MS建立的16 種SDHIs殺菌劑回收率為85.7%～103.9%；楊歡等[29]建立的8 種SDHIs殺菌劑回收率為71.4%～121.3%，本研究與其相比，均能滿足果蔬中農藥殘留檢測的回收率要求。

表5 18 種SDHIs的加標回收率及RSDTable 5 Average spiked recoveries and precision of 18 compounds

續(xù)表5

2.3 實際樣品檢測結果

采用優(yōu)化建立UPLC-MS/MS快速分析方法對市售沃柑、橙、梨、黃瓜、番茄、菠菜、辣椒、山藥、上海青、白菜、茄子、芹菜、豇豆、油麥菜等76 份樣品進行測試。結果顯示氟吡菌酰胺檢出樣品2 個，分別為西紅柿和黃瓜，檢出值分別為10.2、22.6 μg/kg；氟唑菌酰胺檢出樣品1 個，為黃瓜，檢出值為7.8 μg/kg；啶菌酰胺在芹菜、黃瓜、番茄、菠菜、上海青、茄子6 種蔬菜共12 個樣品中均有檢出，檢出值為7.4～1 966 μg/kg，其中在2 批次芹菜中檢出值分別高達1 017、1 966 μg/kg。噻呋酰胺檢出樣品1 個，為沃柑，檢出值為47.2 μg/kg。

3 結 論

本實驗建立了同時分析果蔬中18 種SDHIs殺菌劑殘留的UPLC-MS/MS檢測方法。該方法靈敏度高、重復性好，經(jīng)過系列方法學驗證，結果表明18 種目標化合物在0.5～200 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.99，方法檢出限為0.5～2.0 μg/kg，定量限為1.5～6.0 μg/kg。各種目標化合物在4 種基質中3 個添加水平（10、50 μg/kg和150 μg/kg）下的回收率為83.6%～109.4%，RSD為1.2%～8.4%（n＝6）。實際樣品的檢測結果表明氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、啶酰菌胺和噻呋酰胺均在黃瓜、西紅柿、芹菜、沃柑等果蔬中有殘留，啶菌酰胺殘留現(xiàn)象嚴重。該方法操作簡單、凈化效果好，適用于果蔬中SDHIs殺菌劑的快速檢測，不僅可以滿足當前國際上對果蔬中這18 種SDHIs殺菌劑MRL的檢測要求，也可推進果蔬中SDHIs殺菌劑殘留的食品安全風險評估，為政府監(jiān)管部門數(shù)據(jù)支撐具有重要的實際意義和社會效益。