副溶血性弧菌能力驗證及分析

范鵬飛 顧春華 楊陶麗薇 燕妮 郭嬌嬌 楊雅珺

副溶血性弧菌是一種嗜鹽性細(xì)菌，主要來自海產(chǎn)品，如墨魚、海魚、海蝦、海蟹、海蜇，以及含鹽分較高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。該菌存活能力強(qiáng)，在抹布和砧板上能生存1個月以上，海水中可存活47天。進(jìn)食含有該菌的食物可致食物中毒，也稱嗜鹽菌食物中毒。因此，加強(qiáng)對食品中副溶血性弧菌的檢測十分重要。

能力驗證是檢驗檢測水平的有效手段，能夠提高實驗室的檢測能力，對于一些不經(jīng)常檢測的項目，更需要能力驗證來檢驗檢測的科學(xué)性。我們采用GB4789.7-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 副溶血性弧菌檢驗》，在確證試驗中采用了BD與VITEK 2兩種全自動微生物菌種鑒定系統(tǒng)，用實時熒光PCR進(jìn)行結(jié)果驗證。結(jié)果顯示，樣品20-T966、20-S861均檢出副溶血性弧菌，結(jié)果評價滿意。所以，通過傳統(tǒng)生化鑒定、全自動微生物菌種鑒定系統(tǒng)與實時熒光PCR相結(jié)合的方法，提高了檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確率，通過能力驗證活動，提升了檢驗人員的檢測能力，可以為能力驗證活動及食品中副溶血性弧菌檢測提供指導(dǎo)。

一、試劑、材料與方法

1.試劑。樣品20-T966、20-S861（中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心發(fā)放）;副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802（廣東微生物研究所）;弧菌顯色培養(yǎng)基（法國科馬嘉公司）;TCBS瓊脂、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂、3%氯化鈉堿性蛋白胨水、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、氧化酶試劑、革蘭氏染液、ONPG試劑、Voges-Proskauer（V-P）試劑、副溶血性弧菌生化鑒定試劑盒（北京路橋技術(shù)股份有限公司）;NID鑒定板（美國碧迪公司）;GN卡（法國生物梅里埃公司）;DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

2.材料。IPP260plus生化培養(yǎng)箱（德國美墨爾特公司）;CL-32L高壓滅菌器（日本ALP公司）;AC2-5S1生物安全柜（新加坡藝思高科技有限公司）;VITEK 2 compact細(xì)菌生化鑒定儀（法國生物梅里埃公司）;Phoenix M50全自動菌種鑒定儀（美國碧迪公司）;RVC2-25CDplus真空離心濃縮儀（德國Chist公司）; BX53 DP74熒光顯微成像系統(tǒng)（日本奧林巴斯株式會社公司）;viia7實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)（美國Life公司）;simplicity uv超純水儀（德國默克密理愽公司）;ndo全波長超微量分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司）。

3.方法。（1）樣品的復(fù)原。按照參試指導(dǎo)書進(jìn)行。用酒精棉球消毒西林瓶外部，小心打開西林瓶，立即加入5mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水進(jìn)行水化，待溶解后吸出放入無菌瓶中，再反復(fù)用余下的3%氯化鈉堿性蛋白胨水清洗西林瓶內(nèi)壁，回收清洗液放入無菌瓶中，總共60mL，此溶液即是待測樣品原液。

（2）增菌。以無菌操作從制取的60mL待測樣品原液中吸取樣品25mL，加入盛有225mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水的均質(zhì)袋中，均質(zhì)器均質(zhì)1min，制備成1∶10（體積比）的樣品勻液，制備的樣品勻液于培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)18h。

（3）分離純化。用接種環(huán)沾取一環(huán)增菌液，于TCBS平板和弧菌顯色培養(yǎng)基平板上劃線分離。于36℃±1℃培養(yǎng)18-24h。 同時復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)菌株，并劃線于TCBS平板、弧菌顯色平板和TSA平板。典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸，有類似口香糖的質(zhì)感，直徑2mm-3mm，在顯色平板上呈淡紫色菌落。每個樣品挑取4個可疑菌落劃線于TSA平板進(jìn)行純化。

（4）初步鑒定。①氧化酶實驗。生理鹽水浸濕氧化酶試紙，放入無菌的培養(yǎng)皿中，用一次性接種環(huán)蘸取TSA平板上純化的菌落，研磨于氧化酶試紙上。如果濾紙在10s之內(nèi)出現(xiàn)紫色或紫紅色，即可判定氧化酶試驗陽性，不變色為氧化酶試驗陰性。若氧化酶試驗陽性，則說明有副溶血性弧菌。②涂片鏡檢。用接種環(huán)蘸取純化后的可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。副溶血性弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無芽胞、有鞭毛。③3%氯化鈉三糖鐵試驗。用接種針蘸取純化后的可疑菌落，劃線于3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面，并穿刺底層，但不要穿刺到底部。副溶血性弧菌在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面顏色不變或產(chǎn)堿紅色加深，底層產(chǎn)酸培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，無氣孔。

（5）確定鑒定。將可疑單菌落純化后，用接種環(huán)挑取新鮮培養(yǎng)物至10mL的0.85%生理鹽水中，仔細(xì)研磨，與標(biāo)準(zhǔn)0.5麥?zhǔn)蠞岫缺葷峁鼙容^，制成0.5個麥?zhǔn)蠞岫鹊木鶆蚓鷳乙?，按照生化鑒定試劑盒使用說明書加入到相應(yīng)生化反應(yīng)孔中，36℃培養(yǎng)18-24h后，按照說明書觀察結(jié)果。

（6）全自動微生物菌種鑒定系統(tǒng)。①BD全自動微生物菌種鑒定系統(tǒng)。純化后的菌用接種環(huán)挑到4.5mL的Phoenix ID肉湯管中，制成0.5McFarland的菌懸液，倒入NID卡后封蓋，放入BD機(jī)箱中進(jìn)行鑒定。每個菌鑒定兩次。②VITEK 2全自動微生物菌種鑒定系統(tǒng)。純化后的菌用接種環(huán)挑到盛有3.0mL無菌鹽水的透明的塑料管中，制成0.5 McFarland的菌懸液，放入GN鑒定卡，最后放入VITEK 2 COMPACT中進(jìn)行鑒定。每個菌鑒定兩次。

4.實時熒光定量PCR驗證。（1）DNA提取。將分離純化的單菌落接種到5mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水試管中，36℃培養(yǎng)18h，取1mL菌懸液加入到1.5mL無菌離心管中，8000r/min離心5min，移去上清液，加入1mL無菌超純水混勻后離心，移去上清液。加入50μL DNA提取液混勻，室溫放置10min后進(jìn)行沸水浴10min，13000r/min離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至新管備用。

（2）引物與探針。采用Tamman方法。Taqman探針：5'-ATCCATCGTGGCGGTCATATCCAC-3' ，探針5'端由FAM標(biāo)記，3'端由TAMRA標(biāo)記。上游引物：5'-CGGTAGTAAACCCACTGTCAG-3'，下游引物：5'-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3'。

（3）PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系的配置：H2O 3.0μL、Template 4.0μL、Premix Ex Taq 10.0μL、Rox Ⅱ0.4μL、Probe 1.0μL、Primer各0.8μL;反應(yīng)條件：第一階段，預(yù)變性93℃，2min;第二階段，93℃ 45s，55℃ 60s，10個循環(huán);第三階段，93℃ 30s，55℃ 45s，30個循環(huán)，熒光收集設(shè)置在第三階段每次循環(huán)的退火延伸時進(jìn)行。

二、結(jié)果與分析

1.菌落形態(tài)及菌體形態(tài)。樣品20-T966、20-S861與標(biāo)準(zhǔn)菌的菌落形態(tài)一致，符合副溶血性弧菌在TCBS與弧菌顯色培養(yǎng)基上的典型菌落形態(tài)（見表1）。經(jīng)革蘭氏染色，在100倍油鏡下觀察（見圖1），菌體為革蘭氏陰性菌，呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無芽胞。

2.生化鑒定。樣品20-T966和20-S861經(jīng)初步生化鑒定、確證性生化鑒定，以及其他生化鑒定，其結(jié)果均符合副溶血性弧菌生理生化現(xiàn)象（見表2），由此可判斷樣品20-T966和20-S861中均含有副溶血性弧菌。

3.全自動微生物菌種鑒定。經(jīng)BD與VITEK 2全自動菌種鑒定系統(tǒng)鑒定后，其結(jié)果均為副溶血性弧菌，置信度較高，為極好的鑒定結(jié)果（見表3）。對于BD與VITEK 2在副溶血性弧菌的鑒定中，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確度較高，均在96%以上，也可選擇其他的生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。全自動菌種鑒定系統(tǒng)的關(guān)鍵是單菌落的純化，并用非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行增菌，比濁儀每次使用時都應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)比濁管進(jìn)行校正，菌懸液調(diào)到合適的麥?zhǔn)蠞岫确秶?/p>

4.實時熒光PCR驗證。樣品20-S861能夠呈S型曲線特異性擴(kuò)增，如圖2所示。樣品20-T996能夠呈S型曲線特異性擴(kuò)增，如圖3示。陽性對照能夠呈S型曲線特異性擴(kuò)增，空白對照和陰性對照無擴(kuò)增，如圖4所示。根據(jù)SN/T 2424-2010《中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 進(jìn)出口食品中副溶血性弧菌快速及鑒定檢測方法 實時熒光PCR方法》中6.1.3中的結(jié)果描述及判讀，所以樣品20-S861和20-T966中均檢出副溶血性弧菌。

三、結(jié)論與討論

能力驗證是檢驗檢測水平的有效手段，能夠提高實驗室的檢測能力，對于一些不經(jīng)常檢測的項目，更需要能力驗證來檢驗檢測的科學(xué)性。本次申請了能力驗證食品中副溶血性弧菌（定性）檢測項目，在檢驗過程中除了常規(guī)的生理生化確證外，使用了BD與VITEK 2兩種全自動微生物菌種鑒定系統(tǒng)進(jìn)行相互比較驗證，加入了分子生物學(xué)方法實時熒光PCR進(jìn)行確證。最后綜合得出檢驗結(jié)果，樣品20-S861與樣品20-T966均檢出副溶血性弧菌，反饋結(jié)果為滿意。此次能力驗證活動，提升了檢驗人員對副溶血性弧菌的檢測能力，提高了實驗室競爭力，可以為副溶血性弧菌能力驗證和日常的食品檢驗提供指導(dǎo)。

作者簡介：范鵬飛，本科，助理工程師，主要研究方向為食品微生物檢測。