陳允妲，李雪亮，趙曉艷，張麗霞，吳曉玉，，王 飛，*，陳金印

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西省果蔬保鮮與質(zhì)量安全創(chuàng)新中心，江西 南昌 330045）

【研究意義】海藻糖是由2個(gè)葡萄糖分子以1,1-糖苷鍵連接的一種非還原性雙糖，在生物體中具有多種功能[1]。海藻糖對(duì)生物大分子有良好的保護(hù)性能，當(dāng)細(xì)胞處于饑餓、干燥、高滲透壓、脫水等脅迫環(huán)境時(shí)，海藻糖能有效地保護(hù)蛋白質(zhì)不變性，保護(hù)細(xì)胞膜不受損傷，從而提高這些生物的抗逆性[2-4]。因此，海藻糖在食品、化妝品、醫(yī)藥等保護(hù)劑的應(yīng)用前景廣闊[5]。在已知的海藻糖生物合成途徑中，海藻糖合酶途徑（TS 途徑）只需要一個(gè)酶參與反應(yīng)，即利用海藻糖合酶通過(guò)轉(zhuǎn)糖苷作用催化麥芽糖與海藻糖之間的可逆反應(yīng)，可以將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖[6]。生產(chǎn)流程相對(duì)簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化率高，生產(chǎn)原料的成本比較低廉，穩(wěn)定性能好，適合大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，受到廣泛關(guān)注[7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國(guó)內(nèi)外研究者從Picrophilus torridus、Mycobacterium smegmatis、Paenarthrobacter aurescens、Arthrobacter chlorophenolicus、Deinococcus radiodurans、Pseudomonas stutzeri、Acidiplasmasp.MBA-1、Enterobacter hormaechei等G-菌株中分別克隆到海藻糖合酶[8-11]，但目前已報(bào)道的海藻糖合酶的熱穩(wěn)定性不強(qiáng)，限制了其工業(yè)化應(yīng)用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前期工作中，項(xiàng)目組分離得到的一株耐熱性良好的鏈霉菌Streptomyces lavendulaeX33 通過(guò)基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其基因組中含有一個(gè)海藻糖合酶的編碼序列?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本文擬對(duì)其進(jìn)行克隆和異源表達(dá)后，對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行表征，為海藻糖合酶開(kāi)發(fā)提供新的酶資源。

1 材料與方法

1.1 菌株

Streptomyces lavendulaeX33，克隆菌株E.coliDH5α，表達(dá)宿主菌株E.coliBL21（DE3）保藏于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開(kāi)發(fā)與利用工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

LB培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0～7.2。

限制性核酸內(nèi)切酶Hind Ⅲ和NdeⅠ、T4DNA 連接酶、DNA marker、PrimeSTAR Max DNA polymerase購(gòu)于大連寶生物工程有限公司（Takara Biotechnology Co.，Ltd.），其余各化學(xué)試劑均為分析純。凝膠回收試劑盒與質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司（BioTeke Corporation），核酸測(cè)序委托湖南擎科生物科技有限公司（Qingke Biotechnology Co.，Ltd.）。

1.3 儀器

梯度PCR 儀（Bio-Rad）、高速冷凍離心機(jī)（Beckman Coulter，Allegra X-22R）、超凈工作臺(tái)（蘇州安泰公司）、凝膠成像系統(tǒng)（上海天能，Tanon 1600）、核酸電泳儀（北京六一，DYCP-31DN）、蛋白垂直電泳儀（Bio-Rad，Mini-PROTEAN Tetra）、超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝，JY99-11D）等。

1.4 重組菌株的構(gòu)建

高鹽法[10]提取菌株Streptomyces lavendulaeX33 總DNA，以菌株X33 總DNA 作模板，設(shè)計(jì)引物SlTs-F：5'-GGAATTCCATATGATCAACGACCCCG-3'（劃線部分表示NdeI酶切位點(diǎn)）和SlTs-R：5'-CCCAAGCTTATCGGCGCGGCGGTCAC-3'（劃線部分表示Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系：PrimeSTAR Max DNA polymerase 25 μL，引物（25 pmol/μL）各1 μL，菌株X33 總DNA（約50 ng/μL）1 μL，滅菌雙蒸水至50 μL。反應(yīng)條件：98 ℃變性2 min，98 ℃10 s，61 ℃5 s，72 ℃15 s，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收，試劑盒純化后以限制酶Hind Ⅲ和NdeⅠ進(jìn)行雙酶切，同時(shí)將原核載體pET-29a（+）按照相同體系進(jìn)行雙酶切。兩者酶切后的產(chǎn)物以T4DNA 連接酶在16 ℃下過(guò)夜酶連，酶連產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α。涂布于含卡那霉素終濃度為50 μg/mL 的LB 平板，37 ℃培養(yǎng)16 h 后，挑取陽(yáng)性克隆至3 mL 液體LB（Kan+），37 ℃，180 r/min 培養(yǎng)8 h 后提質(zhì)粒電泳，NdeI/Hind Ⅲ雙酶切檢測(cè)[12]。

陽(yáng)性克隆經(jīng)電泳檢測(cè)，大小無(wú)誤后，送樣品至湖南擎科生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建突變表達(dá)菌株。

1.5 突變表達(dá)菌株誘導(dǎo)表達(dá)

將經(jīng)0.2 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)后的突變表達(dá)菌株培養(yǎng)液6 000 r/min，10 min 離心，超聲破碎后，12 000 r/min離心10 min，SDS-PAGE電泳后以考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色液脫色后觀察結(jié)果[13]。

1.6 重組酶rSlTs的催化特性

1.6.1 重組酶rSlTs 的最適反應(yīng)溫度 取15 μg 重組酶rSlTs 加入至終濃度為0.03%（w/w）麥芽糖的20 mmol/L PBS緩沖液（pH 6.0）中，分別在0，10，20，30，40和50 ℃溫度下反應(yīng)1 h后，加入1 mol/L DNS試劑1 mL，沸水浴5 min，以蒸餾水稀釋2倍測(cè)定OD540，以rSlTs最適反應(yīng)溫度下的酶活力為100%進(jìn)行比較。

1.6.2 重組酶的最適反應(yīng)pH 取15 μg 重組酶rSlTs 加入不同pH 值的20 mmol/L PBS 緩沖液中，加入底物麥芽糖終濃度為0.03%（w/w），在20 ℃溫度下反應(yīng)1 h后，測(cè)定酶活，以rSlTs最適反應(yīng)pH下的酶活力為100%進(jìn)行比較。

1.6.3 重組酶的pH 穩(wěn)定性 取1.5 mg 重組酶rSlTs，分別在pH 為3～9 的緩沖液中0 ℃孵育12 h，取出15 μg，加入至pH 6.0的反應(yīng)體系，于20 ℃條件下反應(yīng)1 h后，測(cè)定酶活，以rSlTs最穩(wěn)定pH 條件下的酶活力為100%進(jìn)行比較。

1.6.4 重組酶的熱穩(wěn)定性 取15 μg 重組酶rSlTs，于10，20，30，40，50 和60 ℃條件下保溫后，定時(shí)取出，加入至終濃度為0.03%（w/w）麥芽糖的20 mmol/L PBS緩沖液（pH 6.0）中，在20 ℃溫度下反應(yīng)1 h后，測(cè)定酶活，以重組酶rSlTs在0 ℃條件下處理0 h的酶活力為100%，比較熱穩(wěn)定性。

1.6.5 金屬離子對(duì)重組酶酶活的影響 取15 μg 重組酶rSlTs，在反應(yīng)體系中添加終濃度為1 mmol/L 的不同金屬離子，水浴反應(yīng)1 h，以未加金屬離子的反應(yīng)體系為100%，測(cè)定酶活并進(jìn)行比較。

1.6.6 有機(jī)溶劑對(duì)重組酶酶活的影響 取15 μg 重組酶rSlTs，在反應(yīng)體系中分別添加10%的甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇、乙腈，5%的DMSO、DMF、PMSF 和20 mg/mL 的吐溫80、TritonX-100，10 mmol/L 的EDTA，2 mg/mL的SDS，以不添加任何化合物的測(cè)活體系為對(duì)照，測(cè)定酶活并進(jìn)行比較。

1.7 酶活測(cè)定方法

將破碎、離心后的適量純酶rSlTs 加入至終濃度為0.03%（w/w）麥芽糖的20 mmol/L PBS 緩沖液（pH 6.0）中，以滅活重組酶為對(duì)照，于20 ℃條件下反應(yīng)1 h后，加入1 mol/L DNS試劑1 mL，沸水浴5 min，以蒸餾水稀釋2倍測(cè)定OD540，計(jì)算酶活[14-15]。

酶活定義為20 ℃、pH 為7.5反應(yīng)條件下，以0.03%麥芽糖為底物，每分鐘催化消耗1 μmoL 麥芽糖所需的蛋白量（mg）為一個(gè)活力單位（U）[16]。

海藻糖合酶活性＝[麥芽糖差值毫克數(shù)（空白-酶反應(yīng)）×106]/（342.3×60）

1.8 蛋白含量的測(cè)定

按Bradford方法進(jìn)行，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，具體操作見(jiàn)參考文獻(xiàn)[17]。

1.9 分析軟件

以BioEdit 7.0 軟件進(jìn)行核酸序列和氨基酸序列分析，以MEGA5.5 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，以https://web.expasy.org/compute_pi/在線軟件進(jìn)行分子量和等電點(diǎn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

以菌株X33 基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增得到SlTs基因全長(zhǎng)，其大小在2 kb 左右（圖1a），符合預(yù)期結(jié)果，通過(guò)雙酶切與pET29a（+）酶連后構(gòu)建重組質(zhì)粒（圖1b）。將測(cè)序正確的核酸序列提交至GenBank，登錄號(hào)為：MW217513。

圖1 SlTs基因PCR產(chǎn)物和重組質(zhì)粒電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of fragment of SlTs by PCR and pET-29a（+）-SlTs

將SlTs 氨基酸序列與已報(bào)道的海藻糖合酶序列以MEGA5.5 軟件進(jìn)行比較，泊松法1 000 次校正，鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖2。

圖2 SlTs的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of SlTs and related trehalose synthases

SlTs 與來(lái)源于古細(xì)菌Thermomonospora curvataDSM 43183 海藻糖合酶TcTs 相似性為84%，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上與來(lái)源于Mycolicibacterium smegmatis的海藻糖合酶MsTs 聚為一類。但與來(lái)源于Paenarthrobacter aurescens、Enterobacter hormaechei、Pseudomonas stutzeri、Picrophilus torridus等G-細(xì)菌所產(chǎn)的海藻糖合酶有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。

將SlTs 氨基酸序列與已解析結(jié)構(gòu)的海藻糖合酶TcTs（PDB.5h2t，Thermomonospora curvataDSM 43183）[18]、MsTs（PDB.3zo9，Mycolicibacterium smegmatis）[19]、MtTs（PDB.4lxf，Mycobacterium tuberculosisH37Rv）[20]、TtTs（PDB.5x7u，Thermobaculum terrenumATCC BAA-798）[21]、DrTs（PDB.4tvu，Deinococcus radioduransR1）[22]進(jìn)行比較（圖3），SlTs具有幾個(gè)保守序列DGGYD，NHTS，QPDLN，RXDAVPYL，LLAEANQ和LRNHDELTLE。底物結(jié)合位點(diǎn)D78，H121，Q186，R216，H329，D330，金屬離子結(jié)合位點(diǎn)N120，D188，Y222，L223 以及三聯(lián)體催化中心D218-E260-D330 均位于保守區(qū)域內(nèi)。不同的是，MsTs 中另一個(gè)金屬離子位點(diǎn)E237與SlTs對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)為A225，這一位點(diǎn)的不同是否影響到酶活性有待考證。

圖3 SlTs與其它海藻糖合酶氨基酸序列的比較Fig.3 Comparison of amino acid sequences of different trehalose synthases

2.2 重組酶誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3），表達(dá)菌株經(jīng)0.2 mmol/L IPTG 在16 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)后，6 000 r/min 離心10 min，收集菌體，以20 mmol/L PBS 緩沖液（pH 7.5）重懸，超聲破碎，12 000 r/min 離心10 min，取5 μL 上清液（約20 μg 蛋白），進(jìn)行SDS-PAGE 電泳（圖4）。圖4 顯示經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，重組酶rSlTs 在E.coliBL21（DE3）內(nèi)以可溶蛋白的形式大量表達(dá)。經(jīng)Ni2+-NTA 親和層析，以含200 mmol/L 咪唑的PBS緩沖液（pH 7.5）洗脫后，重組酶rSlTs達(dá)到電泳純標(biāo)準(zhǔn)，分子量在66 ku左右，經(jīng)ExPasy軟件預(yù)測(cè)，其等電點(diǎn)為4.85。

圖4 重組酶rSlTs 表達(dá)和純化SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 Analysis of the expression of the recombinant enzyme rSlTs on SDS-PAGE

2.3 重組酶rSlTs的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH

以麥芽糖為底物，對(duì)重組酶rSlTs的最適反應(yīng)溫度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖5a所示。重組酶rSlTs的最適反應(yīng)溫度為20 ℃，在30 ℃條件下反應(yīng)，酶活性為最適溫度的90%，在60 ℃條件下反應(yīng)1 h未能檢測(cè)到酶活，最適反應(yīng)溫度與來(lái)源于Pseudomonas stutzeri的海藻糖合酶一致[23]。重組酶rSlTs的最適反應(yīng)pH 為7.5（圖5b），與來(lái)源于Pseudomonas putida的海藻糖合酶一致[24]，在此條件下，測(cè)得的酶活為67.6 U/（min·mg）protein。在pH 為7.0和pH為8.0條件下，酶活性為最適pH反應(yīng)條件的85%和80%。

圖5 重組酶rSlTs的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pHFig.5 Optimum temperature and pH of recombinant rSlTs

2.4 重組酶rSlTs的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

將重組酶在不同溫度條件下保藏，定時(shí)取出測(cè)定酶活，比較其在不同溫度條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6a。重組酶rSlTs 對(duì)熱敏感，在20 ℃條件下放置9 h，殘留酶活為60%，在50 ℃條件下30 min 酶活徹底喪失。在40 ℃條件下保持1 h，殘留酶活僅為5%。將重組酶在不同pH 條件下保藏12 h，取出測(cè)定酶活，比較其在不同pH緩沖液中的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6b。重組酶rSlTs在pH 6.5～8穩(wěn)定，在pH為6條件下放置12 h，殘留酶活為30%，在pH 為8.5 條件下放置12 h，殘留酶活為34%，而在pH 為6.5 和7.5 條件下放置12 h，殘留酶活分別為86%和94%。

圖6 重組酶rSlTs的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性Fig.6 Effects of pH and temperature on stablity of the recombinant rSlTs

2.5 金屬離子對(duì)重組酶rSlTs酶活的影響

重組酶rSlTs酶活性受到Ni2+、Zn2+、Cu2+的強(qiáng)烈抑制，在含有濃度為1 mmol/L上述離子的反應(yīng)條件下，酶活性僅有35%，26%和32%。Ca2+對(duì)重組酶rSlTs 活性有激活作用，其酶活達(dá)到115%，Mn2+對(duì)重組酶rSlTs活性也有輕微的激活作用，其相對(duì)酶活達(dá)到104%（圖7）。

圖7 金屬離子對(duì)重組酶rSlTs活性的影響Fig.7 Effect of metal ions on enzyme activity of recombinant rSlTs

2.6 化學(xué)試劑、有機(jī)溶劑對(duì)重組酶rSlTs酶活的影響

重組酶rSlTs 酶活性受到DMSO、SDS、丙酮、乙腈等有機(jī)溶劑和化學(xué)試劑的強(qiáng)烈抑制，在含有上述化學(xué)試劑和有機(jī)溶劑的反應(yīng)條件下，相對(duì)酶活性僅有52%，0%，0%和12%。EDTA對(duì)重組酶rSlTs活性無(wú)顯著影響（圖8）。

圖8 化學(xué)試劑對(duì)重組酶rSlTs活性的影響Fig.8 Effects of chemical agent on enzyme activity of recombinant rSlTs

3 討論

海藻糖合酶在工業(yè)化酶法生產(chǎn)海藻糖上具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力，本研究從鏈霉菌Streptomyces lavendulaeX33克隆到的海藻糖合酶基因，并通過(guò)原核表達(dá)體系對(duì)其進(jìn)行了重組表達(dá)，得到有活性的重組海藻糖合酶rSlTs。重組酶rSlTs 分子量為66 ku，等電點(diǎn)為4.85，最適反應(yīng)溫度為20 ℃，最適反應(yīng)pH 為7.5，對(duì)熱敏感，在pH 6～8 條件下穩(wěn)定，1 mmol/L Ca2+對(duì)重組酶rSlTs 有激活作用，三聯(lián)體催化中心由D218-E260-D330組成。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示，SlTs與古細(xì)菌Thermomonospora curvataDSM 43183來(lái)源的海藻糖合酶同屬一個(gè)亞類，進(jìn)化關(guān)系最近，而與Pseudomonas、Enterobacter hormaechei等G-細(xì)菌來(lái)源的海藻糖合酶距離較遠(yuǎn)。盡管如此，SlTs 與不同來(lái)源的海藻糖合酶之間的氨基酸序列多重比對(duì)仍顯示存在某些氨基酸殘基高度保守，如底物結(jié)合位點(diǎn)D78，H121，Q186，R216，H329，D330，金屬離子結(jié)合位點(diǎn)N120，D188，Y222，L223以及三聯(lián)體催化中心D218-E260-D330等。此外，SlTs氨基酸序列中還存在一些相對(duì)保守的區(qū)段，與已知晶體結(jié)構(gòu)的TcTs（PDB.5H2T）相比，在數(shù)目和位置上都高度一致。

重組酶最適反應(yīng)pH 為7.5，與來(lái)源于Pimelobactersp.R48、Pseudomonas putida的海藻糖合酶一致，而來(lái)源于Thermus aquaticusATCC33923、Picrophilus torridus最適反應(yīng)pH 為6.5[24]。重組酶rSlTs 的最適反應(yīng)溫度為20 ℃，與來(lái)源于Pseudomonas stutzeri的海藻糖合酶最適反應(yīng)溫度一致，而來(lái)源于Thermus aquaticusATCC33923的海藻糖合酶最適反應(yīng)溫度為65 ℃。有意思的是，SlTs在氨基酸序列上和來(lái)源于古細(xì)菌Thermomonospora curvataDSM 43183、Thermus aquaticusATCC33923 等的耐高溫海藻糖合酶具有更高的相似性，但在酶學(xué)特性上卻與來(lái)源于Pseudomonas stutzeri、Pimelobactersp.R48等G-細(xì)菌海藻糖合酶更為相似，表明SlTs 為研究氨基酸位點(diǎn)突變對(duì)酶學(xué)特性之間的關(guān)系提供了良好的材料。與古細(xì)菌來(lái)源的海藻糖合酶相比，重組酶rSlTs 熱穩(wěn)定性較差。而酶的熱穩(wěn)定性也是制約其應(yīng)用價(jià)值的重要因素，因此在后續(xù)的研究中課題組將嘗試對(duì)酶進(jìn)行改造，以提高其溫度的穩(wěn)定性。此外，EDTA 對(duì)重組酶rSlTs無(wú)顯著抑制作用，表明SlTs對(duì)金屬離子沒(méi)有很強(qiáng)的依賴性。