儋州市雞高致病性禽流感免疫效果評(píng)估

榮光 葉丹 彭維祺 孫衛(wèi)平 李學(xué)征

摘要為了解儋州市雞高致病禽流感 H5和 H7亞型二聯(lián)滅活疫苗的免疫效果，于2020年12月在全市16個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)養(yǎng)雞場(chǎng)（戶）采集302份血清，采用血凝和血凝抑制試驗(yàn)（ HA-HI）對(duì)禽流感 H5、H7亞型免疫抗體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，302份雞血清樣品中，雞禽流感 H5以及 H7陽(yáng)性個(gè)體數(shù)分別為247、215份，合格率分別為82%、71%，均符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求免疫抗體水平達(dá)到70%的標(biāo)準(zhǔn)。說明 H5和 H7亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗的免疫效果較好，有較強(qiáng)的保護(hù)力。

關(guān)鍵詞高致病性禽流感;免疫效果;評(píng)估

中圖分類號(hào) S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2021.12.013

Evaluation of Immunity of Chickens to Highly Pathogenic Avian Influenza in Danzhou City

RONG? Guang1） YE? Dan1） PENG? Weiqi1） SUN? Weiping1） LI Xuezheng1 ，2）

（1 Tropical Crops Genetic Resources Institute， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China;

2 Danzhou Center for Animal Disease Control and Prevention， Danzhou， Hainan 571700， China）

Abstract? In? order? to? understand? the? immune? effect? of chicken? inoculated? with? a? bivalent? inactivated vaccine for avian influenza H5 and H7 subtypes in Danzhou City， 302 serum? samples of chicken were collected? from? chicken? farms （households） in 16 townships? of Danzhou? City? in? December， 2020. The hemagglutination? and? hemagglutination? inhibition? tests （HA-HI） were? used? to? detect? the? immune antibodies? of avian? influenza? H5 and? H7 subtypes. The? results? showed? that? there? were 247 and 215 individuals? found? positive? to? avian? influenza? H5 and? H7 subtypes，? respectively? in 302 chicken? serum samples， with the compliance rates being 82% and 71%， respectively， which met the requirements of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs for the level of immune antibodies being upto 70%. The results showed that? avian? influenza? H5 and? H7 subtypes bivalent? inactivated vaccine has? good? immune? effect and strong protection.

Keywords? highly pathogenic avian influenza ; immune effect ; assessment

禽流感（ Avian Influenza， AI），又稱為禽流行性感冒，是由 A 型流感病毒（ Avian Influ‐enza Virus， AIV）引發(fā)多種禽類感染的疾病綜合征[1]，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（ OIE）列為 A類傳染病，在我國(guó)被列為一類傳染病[2-5]。根據(jù)對(duì)禽類致病性不同，可分為高、低和非致病性3種類型[6]。其中，高致病性禽流感 （ Highly Pathogenic Avian Influenza， HPAI） H5亞型和 H7亞型，傳染性最強(qiáng)，發(fā)病率和死亡率最高，造成的疫情，對(duì)家禽和人類危害最嚴(yán)重[7]。因此，接種疫苗以及對(duì)家禽進(jìn)行禽流感的檢測(cè)是預(yù)防和控制禽流感發(fā)生的有效措施[8-9]。在高致病禽流感 H5和 H7免疫防治過程中，由于場(chǎng)地、母源抗體干擾及操作方法不當(dāng)?shù)?，往往造成免疫保護(hù)不夠[9-11]。本研究對(duì)儋州市16個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的雞場(chǎng)采集血清，采用血凝（ HA）和血凝抑制（ HI）試驗(yàn)方法對(duì)禽流感 H5、H7亞型免疫抗體進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)抗體水平進(jìn)行分析?？陀^評(píng)價(jià)儋州市雞 H5、H7免疫效果，以期對(duì)儋州市雞禽流感抗體水平有一個(gè)正確的認(rèn)識(shí)，對(duì)海南省無規(guī)定動(dòng)物疫病示范區(qū)和自由貿(mào)易港建設(shè)均具有重要意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑

阿氏（Alsevers）液 （自配）;1%雞紅細(xì)胞懸液（ 自配）; pH 7.2、0.01 mol/L PBS;禽流感病毒 H5亞型（ Re-11株）血凝血抑實(shí)驗(yàn)抗原（國(guó)生生物，試劑批號(hào)：20191106）;禽流感病毒 H7亞型（ Re-2株）血凝血抑實(shí)驗(yàn)抗原（國(guó)生生物，試劑批號(hào)：20191014）。

1.1.2儀器設(shè)備

微量移液器;槍頭;96孔 V型微量反應(yīng)板;微型振蕩器;高速離心機(jī);恒溫箱。

1.2方法

1.2.1樣品采集

1.2.1.1取血

于2020年12月在儋州市16個(gè)鎮(zhèn)的養(yǎng)雞場(chǎng)（戶）采集血樣302份。采用雞翼內(nèi)靜脈采血法，把家禽側(cè)臥保定，展開雞翅，拔除采血部位的部分羽毛，取酒精棉球?qū)Σ裳课贿M(jìn)行消毒，然后將采血器針尖斜口向上，以 30°傾斜插入翅靜脈，緩緩抽取血液，達(dá)到所需血量后，用酒精棉球按壓以止血[12-13]。

1.2.1.2血清制備

取適量血樣以2000 r/min 離心5～8 min，取上清液于1.5 mL 滅菌離心管中， -20℃保存?zhèn)溆肹14]。

1.2.2血凝實(shí)驗(yàn)（HA）

（1）分別吸取0.025 mL PBS液加到酶標(biāo)板微孔的1～12孔中，換滴頭。

（2）吸取病毒懸液0.025 mL 加入至第1孔混勻，再?gòu)牡?孔吸取0.025 mL 加入至第2孔混勻，如此反復(fù)，依次稀釋至第11孔，再?gòu)牡?1孔吸取0.025 mL，棄之，換滴頭。

（3）每孔各加入 PBS 0.025 mL，體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸液0.025 mL，振蕩混勻，室溫（20～25℃）靜置40 min觀察結(jié)果。

結(jié)果判定∶傾斜反應(yīng)板，紅細(xì)胞無呈淚滴狀流淌（完全血凝）的抗原的最高稀釋倍數(shù)表示一個(gè)血凝單位（ HAU）。本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)血凝單位為256。

1.2.3血凝抑制實(shí)驗(yàn)（HI ）

（1）根據(jù)血凝（ HA）試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU 的病毒抗原。

（2）在微量反應(yīng)板的1～11孔加入0.025 mL PBS，第12孔加人0.05 mL PBS。

（3）吸取0.025 mL血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸0.025 mL 于第2孔，依次對(duì)倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.25 mL棄去。

（4）1～11孔分別加入含4HAU 的病毒抗原液0.025 mL，室溫（20℃）靜置至少30 min。

（5）每孔加入0.025 mL 體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液混勻，靜置約40 min （室溫約20℃，若環(huán)境溫度太高可置4℃條件下進(jìn)行），對(duì)照紅細(xì)胞將呈現(xiàn)紐扣狀的物質(zhì)沉于孔底。

結(jié)果判定：以完全抑制4個(gè) HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為 HI 滴度。HI 價(jià)小于或等于3log2判定 HI 試驗(yàn)為陰性; HI 價(jià)≥4log2為陽(yáng)性;或按照高致病性禽流感診斷技術(shù)（GB/T 18936—2003）進(jìn)行陽(yáng)性率的判定。

2結(jié)果與分析

2.1 H5血凝血抑檢測(cè)結(jié)果

抗體檢測(cè)結(jié)果見表1。從表1可以得出，2020年秋季儋州市16個(gè)鎮(zhèn)的雞禽流感 H5免疫合格率分別為80%、60%、 100%、85%、 100%、 100%、75%、100%、 65%、 85%、 90%、 80%、 100%、 80%、 60%、55%，有12個(gè)鎮(zhèn)的抗體合格率均達(dá)到國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的標(biāo)準(zhǔn)（群體抗體水平≥70%）。其中，雞禽流感 H5亞型抗體合格率達(dá)到100%的鎮(zhèn)有 C、E、F、H 和 M鎮(zhèn)，達(dá)到90%≤抗體合格率<100%區(qū)間的鄉(xiāng)鎮(zhèn)只有 K 鎮(zhèn)，這些地區(qū)的抗體水平高，免疫效果顯著，表明這些地區(qū)雞禽流感 H5亞型的防疫工作受到充分重視，工作落實(shí)到位，筑牢了免疫屏障。在80%≤抗體合格率<90%區(qū)間的鄉(xiāng)鎮(zhèn)有 A、D、J、L 和 N鎮(zhèn)，表明這些鎮(zhèn)的抗體水平較高，免疫效果較好，雞禽流感 H5亞型防疫工作落實(shí)較好。在70%≤抗體合格率<80%區(qū)間的鄉(xiāng)鎮(zhèn)只有 G鎮(zhèn)，表明 G鎮(zhèn)的抗體水平良好，免疫效果一般，防疫工作要進(jìn)一步加強(qiáng)，努力做得更好。除此之外，B鎮(zhèn)、I鎮(zhèn)、 O 鎮(zhèn)和 P 鎮(zhèn)的抗體水平不達(dá)標(biāo)（群體抗體水平<70%），表明這些地區(qū)的防疫工作做得不到位，雞禽流感 H5亞型的防疫工作還應(yīng)進(jìn)一步扎實(shí)。

2.2 H7血凝血抑檢測(cè)結(jié)果

從表2可以得出，2020年秋季儋州市16個(gè)鎮(zhèn)的雞禽流感 H7免疫合格率分別為90%、75%、100%、0、 100%、 100%、 0、 100%、 65%、 100%、 100%、25%、100%、90%、87%、30%， 11個(gè)鎮(zhèn)的抗體合格率均達(dá)到國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的標(biāo)準(zhǔn)（群體抗體水平≥70%）。其中，雞禽流感 H7亞型抗體合格率達(dá)到100%的鎮(zhèn)有 C、E、F、H、J、K 和 M鎮(zhèn)，達(dá)到90%≤抗體合格率<100%區(qū)間的鄉(xiāng)鎮(zhèn)有 A鎮(zhèn)和 N鎮(zhèn)，這些地區(qū)的抗體水平高，免疫效果顯著，表明大多數(shù)地區(qū)雞禽流感 H7亞型的防疫工作受到充分重視，工作落實(shí)到位，筑牢了免疫屏障。在80%≤抗體合格率<90%區(qū)間的鄉(xiāng)鎮(zhèn)只有 O鎮(zhèn)，表明 O鎮(zhèn)抗體水平較高，免疫效果較好，雞禽流感 H7亞型防疫工作落實(shí)較好。在70%≤抗體合格率<80%區(qū)間的鄉(xiāng)鎮(zhèn)只有 B鎮(zhèn)，表明 B鎮(zhèn)的抗體水平良好，免疫效果一般，防疫工作要進(jìn)一步加強(qiáng)，努力做得更好。除此之外，D、G、I、L 和 P 鎮(zhèn)的抗體水平不達(dá)標(biāo)（群體抗體水平<70%），表明這些地區(qū)的防疫工作做得不到位，雞禽流感 H7亞型的防疫工作還應(yīng)進(jìn)一步扎實(shí)。

結(jié)合表1與表2的結(jié)果分析可得，秋季檢測(cè)302份雞血清中，雞禽流感 H5、H7亞型免疫抗體陽(yáng)性數(shù)分別是247、215份，合格率分別是82%、71%， H5、H7亞型免疫抗體合格率均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

3討論與結(jié)論

3.1討論

從檢測(cè)結(jié)果上看，儋州市雞禽流感 H5和 H7亞型整體免疫效果良好，免疫抗體合格率均達(dá)到了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，表明2020年秋季儋州市雞總體上已建立起了較好的免疫機(jī)能屏障，禽流感流行風(fēng)險(xiǎn)較低，但也存在少數(shù)鄉(xiāng)鎮(zhèn)禽流感抗體水平較低的現(xiàn)象。造成這種現(xiàn)象的原因可能與雞群產(chǎn)生抗體時(shí)間、疫苗的質(zhì)量、免疫操作的規(guī)范程度、雞群的飼養(yǎng)環(huán)境等因素有關(guān)[15-16]。

從不同類型雞禽流感免疫抗體水平上看，H5亞型抗體合格率整體略高于 H7亞型，這可能與養(yǎng)殖人員對(duì)防疫工作的重視程度、冬春季節(jié)的防疫工作落實(shí)情況有關(guān)，也可能與不同疫苗毒株有不同的免疫原性有關(guān)[17-18]。

3.2結(jié)論

從檢測(cè)結(jié)果可知，2020年秋季儋州市雞禽流感 H5以及 H7免疫抗體合格率分別是82%、71%，均符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求的標(biāo)準(zhǔn)。說明 H5和 H7亞型禽流感二聯(lián)苗的免疫效果較好，有較強(qiáng)的保護(hù)力。同時(shí)，針對(duì)抗體水平不達(dá)標(biāo)的鄉(xiāng)鎮(zhèn)，建議全面排查原因，及時(shí)補(bǔ)免，進(jìn)一步提高免疫抗體合格率，強(qiáng)化免疫屏障。

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（編輯排版：林海妹）