基于熒光PCR檢驗(yàn)方法對(duì)食品中沙門氏菌檢驗(yàn)的分析研究

孔慶巖 胥小榮 龐婕 王艷英 苗育可

摘 要：目的：針對(duì)國家標(biāo)準(zhǔn)中沙門氏菌檢驗(yàn)周期比較長的問題，探究利用PCR檢測(cè)致病菌病源的方法。方法：利用沙門氏菌特異性片段作為PCR擴(kuò)增的靶序列，制作相應(yīng)模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，找到最佳方案，選擇30份食品采取實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方式進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)同等份數(shù)食品運(yùn)用傳統(tǒng)方法的進(jìn)行檢測(cè)，隨機(jī)分為研究組和參照組，對(duì)兩組食品的食源性致病菌總檢出率進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果：利用PCR檢測(cè)沙門氏菌正確率和國家標(biāo)準(zhǔn)相似，檢驗(yàn)時(shí)效大幅縮短。結(jié)論：利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)食品中沙門菌，為食源性沙門菌污染的快速檢驗(yàn)提供方法學(xué)支持。

關(guān)鍵詞：食品安全;沙門氏菌;PCR

食品安全是當(dāng)今社會(huì)非常關(guān)注的話題，而食品安全多是由于食源性致病菌所致，沙門氏菌是近年來食源性致病菌最主要原因之一，所以快速有效的檢測(cè)方法有利于減少食品安全的事件的發(fā)生。熒光PCR法檢測(cè)致病菌病源，以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快和全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)而成為分子生物學(xué)研究中的重要工具[1-2]。傳統(tǒng)的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定沙門氏菌的檢驗(yàn)需要前增菌、二次增菌、平板分離、生化鑒定及血清學(xué)分析等步驟，培養(yǎng)時(shí)間長，出具實(shí)驗(yàn)結(jié)果需要至少5 d時(shí)間。其他如以抗原-抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，如免疫酶實(shí)驗(yàn)、免疫擴(kuò)散法、乳膠凝集實(shí)驗(yàn)、免疫熒光法及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等，使得沙門菌的檢測(cè)受到一些限制[3]。因此，快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法是大勢(shì)所趨，對(duì)快速及時(shí)發(fā)現(xiàn)致病菌，控制污染起到積極作用。目前最成熟的技術(shù)就是實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)致病菌病源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檢驗(yàn)食品：熟肉制品、糕點(diǎn)和餐飲常見食品等。沙門氏陽性菌標(biāo)準(zhǔn)菌株：乙型副傷寒沙門氏菌;非沙門菌陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大腸埃希氏菌O157：H7;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）;旋達(dá)R1致病菌生物檢測(cè)系列“沙門氏菌核酸檢驗(yàn)試劑盒”（雙螺旋基因公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFX96TMOptics Moduie，BIO-RAD）;高速離心機(jī)（HC-1016，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）;生物安全柜（SC1100ⅡB2-X，生濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA制備

（1）標(biāo)準(zhǔn)菌株。①取沙門氏菌復(fù)壯菌液1 mL于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄去上清液。②用PBS將沉淀的菌體洗滌2次，加入100 ?L已滅菌超純水中，于100 ℃水浴15 min。③-20 ℃放置30 min。④37 ℃解凍后，用離心機(jī)12 000 r/min離心5 min，取得的上清液為沙門氏菌的DNA。

（2）TIANGEN細(xì)菌基因組使用DNA提取試劑盒提取。具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.3.2 食品樣品DNA提取

致病菌是活的生物物質(zhì)，為了得到大量的可檢測(cè)致病菌，可以取一定量食品在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增菌。培養(yǎng)增菌還可以簡化介質(zhì)，減少復(fù)雜食品介質(zhì)對(duì)PCR的抑制影響。①稱取25 g（mL）樣品加入到225 mL緩沖蛋白胨水BPW增菌液培養(yǎng)基中，36 ℃增菌培養(yǎng)18 h。②取出1 mL增菌培養(yǎng)后的樣品于1.5 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min。③將上清液用移液槍轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，用離心機(jī)12 000 r/min離心5 min。④棄去上清液，用PBS懸浮菌體，離心洗滌2次。⑤提取細(xì)菌基因組DNA。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

（1）添加模板。剪下所需測(cè)試數(shù)的已含有反應(yīng)液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30 s后揭開封口膜，向每管反應(yīng)液中分別加入5 μL模板，順序?yàn)榭瞻?、陰性?duì)照、待測(cè)樣品模板、陽性對(duì)照。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30 s，離心1 min，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

（2）擴(kuò)增反應(yīng)。使用熒光定量PCR儀，熒光基團(tuán)選擇FAM，淬滅基團(tuán)選擇TAMRA。

（3）PCR反應(yīng)條件。①預(yù)變性：95 ℃，10 min，1個(gè)循環(huán)。②擴(kuò)增：95 ℃，15 s;60 ℃，45 s。40個(gè)循環(huán)。在60 ℃時(shí)收集熒光。熒光通道選擇FAM。

1.3.4 結(jié)果判斷

①檢測(cè)樣品Ct≥40.0，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴(kuò)增曲線，樣品陰性，不含沙門氏菌。②檢測(cè)樣品Ct≤35.0，曲線為“S”型擴(kuò)增曲線，樣品陽性，含有沙門氏菌。③檢測(cè)樣品35.0

為確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，設(shè)立空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系，在檢驗(yàn)區(qū)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線盒Ct值判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

對(duì)一株沙門氏菌和3株非沙門氏菌及30個(gè)食品樣品，用建立的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。由圖1知，沙門氏菌的檢測(cè)結(jié)果為陽性，而非沙門氏菌檢測(cè)可知，結(jié)果為陰性，食品樣本為陰性，PCR方法比較傳統(tǒng)增菌培養(yǎng)方法更具時(shí)效性的優(yōu)勢(shì)，通過此次檢驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果的比較，表明建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)具有良好的的靈敏性、時(shí)效性和特異性，PCR方法和傳統(tǒng)方法對(duì)比檢測(cè)結(jié)果見表1。

3 結(jié)論與討論

該方法采用BPW對(duì)目標(biāo)菌沙門氏菌和3種非沙門氏菌進(jìn)行增菌，按直接提取法提取DNA模板，提高了檢測(cè)效率，節(jié)省檢測(cè)費(fèi)用，方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，能滿足食品微生物的快速檢測(cè)。由于PCR實(shí)驗(yàn)中退火溫度對(duì)結(jié)果影響較大，通過優(yōu)化，最佳退火溫度設(shè)置為60 ℃，在該條件下，5種菌均能擴(kuò)增出清晰條帶，沙門氏菌、副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌O157：H7和金黃色葡萄球菌在多重PCR中能檢測(cè)出[4-5]。

在沙門氏菌的快速檢驗(yàn)中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)占有重要地位。它已成為保障食品安全，鑒定相應(yīng)食源性致病菌的有力工具，相對(duì)于傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法，具有自動(dòng)化程度高、污染性小、實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，大大提高了檢測(cè)的效率，節(jié)省了檢測(cè)的人力、物力和財(cái)力。隨著研究的不斷深入，該方法會(huì)得以發(fā)展和完善，在沙門氏菌的檢測(cè)中發(fā)揮更大作用，但仍存在一定不足，PCR本身靈敏度高，操作過程中存在系統(tǒng)誤差、環(huán)境污染等問題，如樣品間的交叉污染、外源性污染等其他污染，造成結(jié)果會(huì)產(chǎn)生假陽性。由于此方法是對(duì)基因片段進(jìn)行檢測(cè)，無法自動(dòng)識(shí)別活菌與死菌，要求前處理過程需要有效控制，樣品、試劑本身和設(shè)備等條件會(huì)抑制PCR酶反應(yīng)。

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