基于IL-6/JAK2/STAT3信號通路研究巖白菜素對急性肝損傷大鼠的保護作用

藍 穎，張可鋒，連苑宇，陳俊杰，楊超越，王躍峰*，高 雅*

1廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧 530021；2桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林 541000

急性肝損傷是一種在短期內(nèi)由于藥物中毒、免疫損傷、病毒感染等原因誘發(fā)的突發(fā)性肝功能異常疾病，目前治療肝損傷的方法很多，西藥療效明顯但藥物不良反應(yīng)較多且價格昂貴，肝移植治療方法也存在供源缺乏、并發(fā)癥多且病死率高等一系列問題[1]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥在預(yù)防和治療肝損傷中呈現(xiàn)獨特的療效，特別是中藥提取物和中藥單體化合物在抗氧化和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中作用顯著，能有效降低CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷大鼠體內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平和炎癥因子的釋放，提高谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶的活性起到抗炎和抗氧化作用改善肝損傷，近年來也有茵梔黃注射液、水飛薊素片等中成藥開發(fā)上市來治療肝損傷且臨床療效顯著，但大多作用機制尚不明確[2-4]。巖白菜素是一種白色疏松針狀結(jié)晶或結(jié)晶粉末狀化合物，化學(xué)式C14H16O9，相對分子質(zhì)量328.27，易溶于甲醇微溶于水或乙醇，該化合物存在于虎耳草科巖白菜全草及厚葉巖白菜和紫金?？瓢賰山鸬母o葉中，是一種民間常用藥，分布于我國四川西南部、湖南、云南北部及西藏南部和東部，又名為巖虎耳草素、矮茶素、巖白菜內(nèi)脂、佛手配質(zhì)等[5]。其具有良好的生物活性：如抗炎、抗癌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗心律不齊等，臨床上常用來治療慢性支氣管炎[6-9]。目前關(guān)于巖白菜素保肝的作用研究較少，因此，我們用CCl4誘導(dǎo)建立大鼠急性肝損傷模型，探究巖白菜素對急性肝損傷大鼠的保護作用，篩選新的保肝藥物，探究其治療急性肝損傷的作用機制來提高中藥防治的靶向性，為藥物的臨床應(yīng)用和開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠60只，體重180 ～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2016-0002，倫理委編號：GLMC201904008。

1.2 實驗藥物與試劑

巖白菜素(畢得醫(yī)藥，純度≥98.65%，批次：RMC804)；分析純CCl4(廣東汕頭市西隴化工廠)；水飛薊素(美倫生物技術(shù)有限公司，批號：M1120A)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(ALB)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；Janus蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)、磷酸化Janus蛋白酪氨酸激酶2(p-JAK2)、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(p-STAT3)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(NF-κB p65)、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白抗體(英國Abcam公司)；β-actin抗體購自傲銳東源生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(碧云天生物技術(shù)研究所)；Super ECL Plus超敏發(fā)光液(北京普利萊基因科技有限公司)。

1.3 儀器

FRESCO 21高速冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific公司)；Olympus BX51顯微鏡(奧林巴斯)；Epoch 2HS酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司)；THZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩器(太倉市實驗設(shè)備廠)；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Tek公司)；全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析檢測系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；Eppendorf移液器(Eppendorf股份公司)；AUW220D半微量電子天平(島津公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥

60只大鼠隨機分為正常組、模型組、水飛薊素(120 mg/kg)組、巖白菜素(20、40、80 mg/kg)低、中、高劑量組，每組10只。水飛薊素組，巖白菜素低中高劑量組大鼠每天以10 mL/kg灌胃給藥，正常組和模型組灌胃相應(yīng)體積蒸餾水，每日1次，連續(xù)一周。末次給藥2 h后，除正常組以外，其余各組大鼠均腹腔注射25% CCl4橄欖油溶液2 mL/kg，建立急性肝損傷模型。禁食不禁水，16 h后眼球取血，并收集肝臟。

2.2 肝組織病理學(xué)檢測

使用4%多聚甲醛固定各組大鼠肝組織48 h，經(jīng)過梯度乙醇脫水，石蠟包埋，將蠟塊以4 μm厚度制作切片，進行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肝組織的病理變化。

2.3 生化指標(biāo)檢測

將收集的血液在4 ℃靜置3 h，放置于離心機離心15 min(4 ℃，4 500 rpm)，收集血清置于-20 ℃中冰箱保存?zhèn)溆?。生化法檢測血清中ALT、AST、ALB、MDA、GSH-Px、SOD活性或含量。

2.4 ELISA檢測肝組織中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量

將肝組織置于研磨管中充分研磨，制備組織勻漿，取上清液后嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，檢測并計算肝組織中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量。

2.5 蛋白免疫印跡法實驗

取肝組織約60 mg于研磨管，用移液槍吸取1 mL細胞裂解液加入研磨管后置于冰上充分研磨，待組織完全裂解后轉(zhuǎn)移至EP管中，離心(4 ℃，14 000 rpm，10 min)，取上清液，采用BCA法測定蛋白含量。先配制濃度為10%的分離膠和濃度為5%的濃縮膠，加入蛋白樣品后，調(diào)節(jié)電壓為80 V進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，在冰浴條件下300 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉2 h后，用TBST漂洗3次，加入Ⅰ抗置于4 ℃孵育過夜；TBST漂洗3次后加入Ⅱ抗，4 ℃孵育2 h，采用ECL法顯色，全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)顯影，分析蛋白灰度并計算目的蛋白相對表達量。

2.6 免疫組化實驗

將4 μm組織切片于烘箱中37 ℃烘片過夜，二甲苯脫蠟10 min，脫蠟后浸入梯度濃度乙醇中水化，使用抗原修復(fù)液枸櫞酸鈉高壓修復(fù)抗原4 min，修復(fù)后將切片冷卻至室溫，置于內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑10 min。PBS潤洗3次后滴加Ⅰ抗于組織切片，37 ℃孵育1 h，PBS潤洗3次后滴加Ⅱ抗孵育1 h，最后滴加DAB顯色液孵育3～5 min，進行蘇木素染色、鹽酸酒精分化，流水反藍后梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察IL-6表達情況。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 實驗結(jié)果

3.1 巖白菜素對CCl4致急性肝損傷大鼠肝組織病理形態(tài)的影響

觀察HE染色及免疫組化結(jié)果，正常組(圖1A)大鼠中央靜脈周圍未見細胞壞死，炎癥細胞浸潤等病理變化，且肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞呈放射狀整齊排列。模型組(圖1B)大鼠可見肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，匯管區(qū)及中央靜脈周圍出現(xiàn)大量肝細胞變性且壞死和炎癥細胞浸潤；與模型組相比，水飛薊素(圖1C)和巖白菜素組中(圖1E)、高(圖1F)劑量大鼠可見肝損傷程度明顯降低，肝組織病變明顯改善，巖白菜素高劑量組(圖1F)改善狀況尤為明顯，其肝小葉和肝細胞結(jié)構(gòu)清晰，炎癥細胞浸潤和細胞壞死情況改善。

3.2 巖白菜素對CCl4致急性肝損傷大鼠肝組織IL-6表達的影響

免疫組化結(jié)果顯示，模型組(圖2B)黃棕色沉積物聚集增多，顯示IL-6表達明顯升高，主要在受損肝細胞周圍表達；與模型組相比，水飛薊素(圖2C)和巖白菜素組中(圖2E)、高(圖2F)劑量大鼠肝臟中IL-6表達明顯降低，結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 肝組織HE染色病理檢查圖(200×)Fig.1 HE staining pathological examination of liver tissue (200×)注：A：正常組；B：模型組；C：水飛薊素組；D：巖白菜素低劑量組；E：巖白菜素中劑量組；F：巖白菜素高劑量組；下同。Note:A:Normal group;B:Model group;C:Silymarin group;D:Bergenin low dose group;E:Bergenin middle lose group;F:Bergenin high dose group;The same below.

圖2 肝組織IHC染色病理檢查圖(100×)Fig.2 IHC staining pathological examination of liver tissue (100×)

3.3 巖白菜素對大鼠血清中肝功能、氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清中ALT、AST、MDA水平顯著上升(P< 0.01)，ALB、SOD、GSH-Px含量或活性顯著降低(P< 0.01)。與模型組相比，水飛薊素組和巖白菜素中、高劑量組大鼠血清中ALT、AST、MDA水平顯著降低(P< 0.01)，ALB含量增加，SOD、GSH-Px活性顯著升高(P< 0.01)；巖白菜素低劑量組ALT、MDA水平降低(P< 0.05)，AST、ALB、SOD、GSH-Px活性或水平無統(tǒng)計學(xué)意義(見表1、表2)。

表1 巖白菜素對CCl4致急性肝損傷大鼠血清中ALT、AST和ALB的影響Table 1 Effects of bergenin on the activities of ALT,AST and ALB in serumof rats with acute liver injury induced by ± s,n = 10)

表2 巖白菜素對CCl4致急性肝損傷大鼠血清中MDA、SOD和GSH-Px的影響Table 2 Effects of bergenin on the activities of MDA,SOD and GSH-Px in serum of ratswith acute liver injury induced by ± s,n = 10)

3.4 巖白菜素對大鼠肝組織中炎癥因子含量的影響

與正常組相比，模型組肝組織TNF-α、IL-6、IL-1β的含量顯著升高(P< 0.01)。與模型組相比，水飛薊素組和巖白菜素中、高劑量組大鼠肝組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量顯著降低(P< 0.01)；巖白菜素低劑量組IL-6和IL-1β含量降低(P< 0.05)，TNF-α含量無統(tǒng)計學(xué)意義(見表3)。

表3 巖白菜素對CCl4致急性肝損傷大鼠肝組織中TNF-α、IL-6和IL-1β含量的影響Table 3 Effects of bergenin on the contents of TNF-α,IL-6 and IL-1β in liver tissueof rats with acute liver injury induced by by ± s,n = 10)

3.5 巖白菜素對IL-6/JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

與正常組相比，模型組大鼠肝組織中p-JAK2、p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高(P< 0.01)。與模型組相比，水飛薊素組和巖白菜素中、高劑量組肝組織中p-JAK2、p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低(P< 0.01)；巖白菜素低劑量組p-JAK2蛋白表達水平降低(P< 0.05)，p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖3)。

圖3 巖白菜素對CCl4致急性肝損傷大鼠肝組織中p-JAK2、p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白表達的影響Fig.3 Effect of bergenin on p-JAK2,p-STAT3,p-NF-κB p65 protein expression in acute liver injury induced by CCl4

4 討論與結(jié)論

研究表明，JAK-STAT信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過參與多種生長因子、細胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)[17]。IL-6是一種調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)的多功能細胞因子，IL-6/JAK2/STAT3信號通路的激活是IL-6與其靶細胞表面的受體sIL-6R識別結(jié)合形成復(fù)合物sIL-6R/IL-6，膜表面糖蛋白130(gp-130)被其活化后使得相關(guān)聯(lián)的JAK2被激活，激活后的JAK2與下游效應(yīng)因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活轉(zhuǎn)錄因子3(STAT3)結(jié)合發(fā)生磷酸化[18,19]。磷酸化的STAT3激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，NF-κB被激活轉(zhuǎn)移到細胞核后，繼而促進TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子釋放，這些炎癥因子表達過量時，又可正反饋作用于NF-κB，繼而促進炎癥反應(yīng)，加重肝組織的損傷[20-22]。此外，IL-6/JAK2/STAT3通路的激活可促進B細胞分化為漿細胞，并刺激IL-6的自分泌，從而形成正前饋循環(huán)，也會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)進一步擴大[23-25]。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比模型組IL-6及p-JAK2、p-STAT3、p-NF-κB p65表達顯著增加，提示該炎癥信號通路可能被激活；給予巖白菜素藥物治療后，血清中肝功能指標(biāo)ALT、AST、MDA、SOD、GSH-Px趨向正常，IL-6、p-JAK2、p-STAT3、p-NF-κB p65的表達不同程度降低，病理切片顯示肝組織匯管區(qū)及中央靜脈周圍肝細胞變性壞死和炎癥細胞浸潤狀況明顯改善，免疫組化明顯可見IL-6表達不同程度降低，以上提示巖白菜素可能通過干預(yù)IL-6的表達，從而抑制IL-6/JAK2/STAT3信號通路的激活減少炎癥因子的釋放，減少炎癥和凋亡，從而有效地改善肝損傷。

綜上所述，巖白菜素可有效減緩CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷，其機制可能與IL-6/JAK2/STAT信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和抗氧化有關(guān)，本研究結(jié)果可為臨床采用巖白菜素治療急性肝損傷提供新思路。