竇 偉 李英倫肖 瀟 李亨東
(四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院藥學實驗室,四川雅安 625014)
巖白菜素在小鼠體內(nèi)的藥動學研究
竇 偉 李英倫*肖 瀟 李亨東
(四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院藥學實驗室,四川雅安 625014)
目的:研究巖白菜素(bergenin)在血液中的HPLC檢測方法及在健康小鼠體內(nèi)的藥動學。方法:65只健康小鼠,單劑量一次灌胃巖白菜素200 mg.kg-1;采用高效液相色譜法測定血藥濃度,血藥濃度最低檢測質(zhì)量濃度為0.203μg.mL-1,并以DAS 2.0藥動學軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果:巖白菜素體內(nèi)過程符合一級吸收二室模型(權(quán)重=1),主要動力學參數(shù)如下:t1/2α為(1.363±0.761)h,t1/2β為(2.658±0.182)h,Tmax為(0.833±0.167)h,Cmax為(10.864±1.616)mg.L-1,AUC(0-t)為(44.626±5.497)mg.L-1.h-1,Ka為(2.918±1.643)l.h-1,MRT(0-t)為(3.600±0.210)h。結(jié)論:巖白菜素在健康小鼠體內(nèi)吸收迅速,生物利用度低,分布較廣,消除較快。
巖白菜素 藥動學 高效液相色譜
巖白菜素(C14H16O9),環(huán)合芳香碳苷類化合物,最早從巖白菜屬中植物提取出來而得名[1]。中國藥典收載為鎮(zhèn)咳祛痰藥,可用于慢性支氣管炎的治療,并有護肝、抗心律不齊、免疫增強、抗炎、抗HIV、等方面的藥理作用[2-6]。但由于巖白菜素脂溶性低,對光和熱不穩(wěn)定,其制劑在體內(nèi)不易被吸收,代謝快,生物利用度不高等因素,限制了巖白菜素的廣泛應用。本實驗通過對巖白菜素的藥動學和組織分布研究,建立巖白菜素的藥動學研究方法,為以后的在體藥效研究和劑型設計提供依據(jù)。
1.1 樣品與試劑
巖白菜素對照品(中國藥品生物制品檢定所提供,批號:111532-200202),巖白菜素片(云南滇池藥業(yè),批號:080105),磷酸、甲醇均為色譜級,實驗用水為超純水。
1.2 試驗動物
清潔級昆明小鼠65只,雌性,體重20±2.2g,購于成都生物制品研究所。小鼠購進后常規(guī)飼養(yǎng),飼料不含任何抗生素,觀察五天無異常后進行實驗。
1.3 儀器
島津LC-2010C高效液相色譜儀、島津CLASS-VP色譜工作站,北京同泰聯(lián)TTL-DC氮吹儀。
2.1 供試品制備方法與測定
小鼠眼眶取血,血液收集到肝素抗凝管中,以4 000 r.min-1離心10 min后,將上清液取出,4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取血漿0.1 ml加入甲醇1.0 ml,旋渦混合1 min,超聲波萃取5 min,4 000 r.min-1離心5min,取上清液,置40℃水浴中氮氣吹干。精密加入甲醇100μl溶解殘渣,旋渦振蕩混合均勻,4 000 r.min-1離心5 min,取上清液過0.45 μm濾膜,取濾液作為供試品溶液。
2.2 標準曲線和檢測限測定
取小鼠空白血漿6份,每份100μl,分別加入不同濃度的巖白菜素對照品溶液,使其在樣品中質(zhì)量濃度分別為0.5 μg.ml-1、2 μg.ml-1、5 μg.ml-1、10 μg.ml-1、15μg.ml-1、20μg.ml-1,旋渦振蕩混勻。進樣20μL,記錄巖白菜素峰面積,以峰面積(A)對濃度(C)作線形回歸。巖白菜素標準曲線回歸方程為Y = 6811C+ 1115.3,R2=0.9991。線性范圍為0.5~20μg/ml。以信噪稀釋法測定信噪比為3∶1時的濃度值,即為檢測限。巖白菜素的最低檢測質(zhì)量濃度為0.203μg.ml-1,最低檢測量為4.06 ng。
2.3 回收率與精密度實驗
表1 絕對回收率,相對回收率及精密度實驗結(jié)果.n=5
2.4 藥液制備和給藥方式
巖白菜素片藥液:2顆巖白菜素片(每片含巖白菜素120mg),加少量水研磨2min,定容至15ml,超聲乳化2 min,制成16mg.ml-1巖白菜素的藥液。
取小鼠65只,隨機分為5個平行組,給藥前禁食12h,自由飲水。按200mg.kg-1灌胃給藥。于給藥前及給藥后10min,20min,30min,40min,50min,1h,2h,4h,6h,8h,10h,12h眼眶取血,血樣直接采集到肝素抗凝管中,按2.1中方法處理待用。
2.5 數(shù)據(jù)分析
根據(jù)所測的巖白菜素血藥濃度-時間數(shù)據(jù),利用DAS2.0.1藥動學軟件計算藥動學參數(shù)。
色譜柱:phenomenex C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動相甲醇-0.7%磷酸(15:85),流速1.0ml.min-1,檢測波長275nm,柱溫40℃,進樣體積20μl。
在此色譜條件下,內(nèi)源性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物不干擾測定,峰形和分離度良好,巖白菜素的保留時間為13.4min,柱效4530,結(jié)果見圖1.
圖1 生物樣品中巖白菜素的色譜圖A-空白血樣;B-給藥后血樣;C-空白血樣加巖白菜素;1-巖白菜素
3.1 色譜條件及適用性研究
3.2 藥動學參數(shù)的測定
小鼠給藥后,巖白菜素在小鼠體內(nèi)不同時間的平均血藥濃度數(shù)據(jù)用DAS2.0程序擬合,結(jié)果符合二室模型,其血藥濃度見表2,血藥濃度-時間曲線見圖3,主要藥動學參數(shù)見表3。
表2 小鼠灌胃巖白菜素后體內(nèi)血藥濃度(n=5)
圖2 小鼠灌胃(200 mg.kg-1)后血液中巖白菜素的血藥濃度-時間曲線(n=5)
4.1 給藥劑量
人口服巖白菜素的推薦劑量為375mg/d,按體表面積比例折算小鼠灌胃量為1mg/d,但在此劑量下一次給藥,大部分時間點血藥濃度低于最低檢測限,無法準確檢測,故將一次性口服劑量擴大為4mg.(kg.bw)-1,該劑量下得到了較好的實驗結(jié)果。
4.2 巖白菜素的藥動學
健康小鼠灌服巖白菜素后,各項參數(shù)表明:巖白菜素在小鼠體內(nèi)吸收快,達峰時間短,吸收迅速。在大劑量給藥的情況下血藥濃度能達到一個較高的水平,說明巖白菜素在小鼠體內(nèi)的血藥濃度與給藥劑量呈正相關,提示了巖白菜素的吸收方式有可能為被動擴散,該結(jié)論與秦瑄[7]等以大鼠作為實驗動物的研究結(jié)果相符。導致巖白菜素吸收程度低的可能原因是:一、巖白菜素結(jié)構(gòu)中含有內(nèi)酯環(huán),在堿性條件下易開環(huán)水解[8];二、巖白菜素具疏水性,在水中溶解度不高。
另外,小鼠按200 mg.kg-1灌服巖白菜素后,T1/2a為(1.363±0.761)h,表明在小鼠體內(nèi)分布較快;V/F為(6.863±2.515)L.kg-1,說明巖白菜素在小鼠體內(nèi)分布廣泛。大鼠[7]T1/2a為(0.45±0.21)h,V/F(83.66±26.59)L.kg-1,與小鼠相比存在分布差異。
表3 小鼠灌胃(200 mg.kg-1)后血中巖白菜素的藥動學參數(shù)(二室模型).n=5
小鼠灌服巖白菜素后的T1/2β為(2.658±0.182)h,CL/F為(2.152±0.289)L·kg-1·h-1,說明巖白菜素在小鼠體內(nèi)消除較快,有效血藥濃度維持時間較短。大鼠[7]T1/2β為(8.73±3.67)h,CL/F為(30.48±4.35)L·kg-1·h-1,大小鼠相比較,小鼠對巖白菜素的消除較快。
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竇偉(1984-),男,碩士研究生,從事新獸藥的開發(fā)。
李英倫(1965-),男,教授,博士,主要從事獸醫(yī)藥理與中獸醫(yī)的研究。