樂(lè)靖宇，馮金慧，劉瑞曦，鄧志軍

(1.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北民族大學(xué))，湖北 恩施 445000；2.恩施州特色植物資源種質(zhì)工程技術(shù)研究中心(湖北民族大學(xué))，湖北 恩施 445000)

種子萌發(fā)一般被視為種子植物生活史的開(kāi)端.種子的萌發(fā)特性除了受控于自身的遺傳特性外，還受到溫度、光照等環(huán)境因子的影響.大部分種子都存一個(gè)適宜萌發(fā)溫度范圍，溫度過(guò)高或過(guò)低都不萌發(fā)[1].根據(jù)種子萌發(fā)行為對(duì)光照條件的響應(yīng)，可將種子分為需光性、忌光性和光中性三類種子[2].對(duì)于需光性種子來(lái)說(shuō)，光是調(diào)控其萌發(fā)的主要環(huán)境因子，感知光信號(hào)的受體主要是光敏色素[3].光敏色素是一類吸收紅光-遠(yuǎn)紅光的可逆轉(zhuǎn)光受體，存在兩種類型，紅光吸收型(Pr)和遠(yuǎn)紅光吸收型(Pfr)，兩者可相互轉(zhuǎn)化，Pr吸收紅光后轉(zhuǎn)化為Pfr，Pfr吸收遠(yuǎn)紅光后轉(zhuǎn)化為Pr，Pfr是生理活性型[4].光敏色素同時(shí)也是溫度受體，即光溫二受體.Pfr可不依賴于光，僅受溫度影響也可轉(zhuǎn)化為Pr，稱之為熱逆轉(zhuǎn)或暗逆轉(zhuǎn)[5].光照和溫度可通過(guò)光敏色素共同調(diào)控種子休眠與萌發(fā)[2,6].目前，光、溫信號(hào)協(xié)同調(diào)控種子休眠與萌發(fā)的具體機(jī)制還知之甚少.

皺葉酸模(Rumexcrispus)為蓼科(Polygonaceae)酸模屬多年生草本植物，種子初夏成熟，多生于田邊、路旁、河灘及溝邊濕地等處，遍布?xì)W亞和北美各地，在醫(yī)藥[7-11]、環(huán)保[12-13]、食品[14-18]等方面均具有重要的應(yīng)用價(jià)值.酸模屬多種植物的種子歷來(lái)就是研究光照調(diào)控種子萌發(fā)機(jī)制的理想材料[19-21].

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試皺葉酸模種子于2018年6月采自湖北省恩施市湖北民族大學(xué)，去除果皮和雜質(zhì)后充分混勻，于室內(nèi)平鋪成一薄層陰干，7 d后用于下述試驗(yàn)，剩余種子置于4 ℃冰箱密封保存.

1.2 初始萌發(fā)測(cè)試

設(shè)置交替光照[12 h light /12 h dark,PPFD=121 μmol/(m2·s)]和全黑暗(鋁箔紙嚴(yán)密包裹)兩種光照條件，每種光照條件下設(shè)置10、15、20、25、30 ℃等5個(gè)溫度梯度.每個(gè)處理均設(shè)4次重復(fù)，每次重復(fù)50粒種子.將種子播于墊有兩層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)中，添加適量蒸餾水后放入設(shè)置好光照和溫度條件的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng).每天晚上統(tǒng)計(jì)并記錄萌發(fā)種子數(shù)，統(tǒng)計(jì)時(shí)關(guān)閉窗簾和熒光燈，在綠光燈下進(jìn)行.以胚根突破種皮2 mm作為萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn).按下列公式計(jì)算各萌發(fā)參數(shù).

式中，G表示萌發(fā)率,GP表示發(fā)芽勢(shì),GI表示發(fā)芽指數(shù).n表示發(fā)芽種子數(shù)，nt表示第t天發(fā)芽的種子數(shù)，N表示供試種子總數(shù).Gt為每日發(fā)芽種子數(shù)，Dt表示相應(yīng)發(fā)芽天數(shù).

1.3 光暗交替處理萌發(fā)測(cè)試

分別在15 ℃和25 ℃兩種恒溫條件下進(jìn)行光暗交替處理萌發(fā)測(cè)試.① 光照轉(zhuǎn)黑暗處理.在交替光照[12 h light /12 h dark，PPFD=121 μmol/(m2·s)]條件下培養(yǎng)1、2、3、4 d后轉(zhuǎn)到全黑暗(鋁箔紙嚴(yán)密包裹)條件下繼續(xù)培養(yǎng)；② 黑暗轉(zhuǎn)光照處理.在全黑暗條件下培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8 d后轉(zhuǎn)到交替光照條件下繼續(xù)培養(yǎng).其余萌發(fā)測(cè)試條件和方法同前述初始萌發(fā)測(cè)試一樣.

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析和做圖均使用R軟件(R version 3.5.2,2018)完成.萌發(fā)率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均使用單因素方差分析方法和Student-Newman-Keuls(S-N-K,P=0.05)方法進(jìn)行多重比較，光照和溫度交互作用采用雙因素方差分析方法.萌發(fā)率數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)分析前先進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)化.文中的統(tǒng)計(jì)數(shù)值均以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)表示，小數(shù)點(diǎn)后面保留兩位有效數(shù)字.

2 結(jié)果分析

2.1 溫度和光照對(duì)皺葉酸模種子萌發(fā)的影響

不管是在交替光照條件下還是在全黑暗條件下，新采收的皺葉酸模種子在15～25 ℃條件下均可萌發(fā)，而在較低的10 ℃和較高的30 ℃則均幾乎無(wú)萌發(fā)(如表1所示).溫度和光照對(duì)新采收的皺葉酸模種子的萌發(fā)具有極顯著的影響(如表1所示).種子的萌發(fā)率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)在交替光照和全黑暗條件下均隨著培養(yǎng)溫度升高呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，且除了幾乎無(wú)萌發(fā)的10 ℃和30 ℃外，在相同溫度條件下，交替光照條件下的萌發(fā)率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)遠(yuǎn)高于全黑暗條件下的相應(yīng)萌發(fā)參數(shù)值.綜合萌發(fā)率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)來(lái)看，皺葉酸模種子在交替光照條件下的最適萌發(fā)溫度為25 ℃，在全黑暗條件下的最適萌發(fā)溫度為20 ℃.雙因素方差分析顯示，溫度和光照處理對(duì)皺葉酸模種子萌發(fā)具有極顯著的交互作用(P<0.01;如表2所示).

表1 光照和溫度對(duì)皺葉酸模種子萌發(fā)率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)的影響Tab.1 Effects of light and temperature on germination rate,germination potential and germination index of Rumex crispus seeds

表2 光照和溫度對(duì)皺葉酸模種子萌發(fā)影響的雙因素方差分析Tab.2 Two-factor covariance analysis on the effect of light and temperature on the Rumex crispus seed germination

2.2 在不同培養(yǎng)溫度下皺葉酸模種子萌發(fā)對(duì)光暗交替處理的響應(yīng)

為研究皺葉酸模種子萌發(fā)的光溫敏感性，在種子可萌發(fā)溫度范圍(15 ℃～25 ℃)內(nèi)，選擇較低溫(15 ℃)和較高溫(25 ℃)進(jìn)行光暗交替實(shí)驗(yàn).對(duì)于交替光照轉(zhuǎn)全黑暗處理，15 ℃和25 ℃條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類似，先在交替光照條件下預(yù)培養(yǎng)1 d后再轉(zhuǎn)到全黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)，其最終累積萌發(fā)率顯著低于交替光照對(duì)照組(P<0.05)，并顯著高于全黑暗對(duì)照組(P<0.05)；而先在交替光照條件下預(yù)培養(yǎng)大于1 d時(shí)間后再轉(zhuǎn)到全黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)，其最終累積萌發(fā)率均與交替光照對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，但都顯著高于全黑暗對(duì)照組(P<0.05;如圖1A,C所示).

L：交替光照對(duì)照組；D：全黑暗對(duì)照組；L1～L4：在交替光照條件下預(yù)培養(yǎng)1～4 d后轉(zhuǎn)到全黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)；D1～D8：在全黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)1～8 d后轉(zhuǎn)到交替光照條件下繼續(xù)培養(yǎng).標(biāo)有相同小寫(xiě)英文字母的數(shù)據(jù)間無(wú)顯著差異(P=0.05,n=4).圖1 光暗交替處理對(duì)皺葉酸模種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of light and dark alternation on Rumex crispus seed germination

而對(duì)于全黑暗轉(zhuǎn)交替光照處理，15 ℃和25 ℃條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示出極大不同.在25 ℃條件下，不管在全黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)多久(1～8 d)，轉(zhuǎn)到交替光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)后都能達(dá)到很高的累積萌發(fā)率，與交替光照對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，并都遠(yuǎn)高于全黑暗對(duì)照組(P<0.05;如圖1D所示)；而在15 ℃條件下，當(dāng)在全黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)時(shí)間大于等于6 d時(shí)，轉(zhuǎn)到交替光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)后的累積萌發(fā)率顯著低于交替光照對(duì)照組(P<0.05)，且在全黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間越長(zhǎng)(≥6 d)，最后的累積萌發(fā)率越低，但在本實(shí)驗(yàn)中始終顯著高于全黑暗對(duì)照組(P<0.05)；在全黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)時(shí)間小于等于5 d時(shí)，轉(zhuǎn)到交替光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)后的累積萌發(fā)率則與交替光照對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05;如圖1B所示).

3 討論

因受儲(chǔ)藏時(shí)間、溫度、水分等多種環(huán)境因子的影響，種子萌發(fā)的適溫范圍和光敏感性均會(huì)隨著休眠釋放而發(fā)生改變[1,22].在本研究中，15 ℃～25 ℃交替光照條件下培養(yǎng)的皺葉酸模種子的萌發(fā)率均遠(yuǎn)高于全黑暗條件下培養(yǎng)的萌發(fā)率，表明新采收的皺葉酸模種子應(yīng)屬于需光性種子，并且光照和溫度之間存在極顯著的交互作用(如表2所示).

光敏色素存在不具生理活性的紅光吸收型(Pr)和具有生理活性的遠(yuǎn)紅光吸收型(Pfr)兩種類型，兩者之間可相互轉(zhuǎn)化[23].當(dāng)種子被白光或紅光照射后，光敏色素從Pr向Pfr轉(zhuǎn)變，經(jīng)過(guò)一系列的生理生化反應(yīng)，最終促進(jìn)種子萌發(fā)[2]；而當(dāng)吸脹種子被黑暗或遠(yuǎn)紅光處理后，Pfr向Pr轉(zhuǎn)變，從而減弱光敏色素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而抑制種子萌發(fā)[24].光敏色素是光溫二受體，在調(diào)控種子休眠萌發(fā)過(guò)程中可整合光溫信號(hào)通路[2]，且不同的光敏色素反應(yīng)具有不同的溫度效應(yīng)參數(shù)[23].

在本研究中，不管是在較低的15 ℃還是在較高的25 ℃條件下，僅交替光照預(yù)培養(yǎng)1 d的皺葉酸模種子的萌發(fā)在一定程度上會(huì)受到隨后全黑暗培養(yǎng)的抑制，而當(dāng)在交替光照下預(yù)培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)于1 d時(shí)，其萌發(fā)則不會(huì)受到隨后全黑暗培養(yǎng)的影響，最終萌發(fā)率均能達(dá)到和交替光照培養(yǎng)對(duì)照組相當(dāng)?shù)母咚?如圖1A,C所示).該結(jié)果似乎表明，光敏色素對(duì)種子萌發(fā)光敏性的調(diào)控具有時(shí)間依賴性.

另外，在本研究中，僅在較低的15 ℃條件下，且全黑暗預(yù)培養(yǎng)時(shí)間大于等于6 d時(shí)，后續(xù)的交替光照培養(yǎng)無(wú)法完全抵消之前全黑暗預(yù)培養(yǎng)對(duì)萌發(fā)的抑制作用，且全黑暗預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間越長(zhǎng)，這種萌發(fā)抑制作用越強(qiáng)，越不易被后續(xù)交替光照培養(yǎng)所逆轉(zhuǎn)；而在較高的25 ℃條件下，全黑暗預(yù)培養(yǎng)對(duì)萌發(fā)的抑制均能被后續(xù)的交替光照培養(yǎng)所抵消，而使最終累積萌發(fā)率達(dá)到和交替光照對(duì)照組相同的水平(如圖1B,D所示).這可能是因?yàn)?，在較高溫25 ℃黑暗預(yù)培養(yǎng)下，具有生理活性的Pfr生成少量的無(wú)生理活性的Pr，因而隨后的光照處理可重新生成活性Pfr，促進(jìn)種子萌發(fā)；而在較低溫黑暗預(yù)培養(yǎng)下，生成大量具生理活性的Pr，因而隨后的光照處理無(wú)法全部轉(zhuǎn)換為活性的Pfr，從而種子萌發(fā)受到一定程度抑制，且隨著黑暗預(yù)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)及隨后的光照時(shí)間縮短，萌發(fā)抑制效果越明顯.可見(jiàn)，皺葉酸模種子在較高溫的黑暗預(yù)培養(yǎng)中，熱逆轉(zhuǎn)速度似乎更慢.但也有研究表明，熱逆轉(zhuǎn)速度隨著溫度升高而加快[25-26].因此，關(guān)于光溫整合信號(hào)調(diào)控其種子萌發(fā)的生理和分子機(jī)制，需要進(jìn)一步研究其中的光敏色素信號(hào)通路.